抗人cd69抗體及其用于醫(yī)療目的的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供抗體，其能夠特異性結(jié)合人CD69，具有預(yù)防過敏性炎癥的活性，并且具有與小鼠CD69的交叉反應(yīng)性。本發(fā)明還提供具有對(duì)人CD69的高結(jié)合親和力并具有預(yù)防過敏性炎癥的活性的抗體。本發(fā)明的抗體的每一種均可以是人抗體。
【專利說明】抗人CD69抗體及其用于醫(yī)療目的的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗人CD69抗體及其藥物用途。

【背景技術(shù)】
[0002] CD69是屬于C型凝集素家族的II型跨膜蛋白。由于CD69的表達(dá)在T細(xì)胞和B 細(xì)胞的刺激后幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)增加，所W它被廣泛用作早期活化標(biāo)記分子W作為淋己細(xì)胞活 化的指標(biāo)（非專利文獻(xiàn)1)。此外，在胸腺中分化過程中在選擇下的T細(xì)胞中也觀察到表達(dá) (非專利文獻(xiàn)2和3)。盡管假定CD69具有作為加強(qiáng)來自抗原受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同受體 的功能，但細(xì)節(jié)是未知的。其配體至今尚未鑒定。它在血小板中組成型表達(dá)，并且在活化的 嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等中也觀察到表達(dá)。因此，假定其在血小板中的功能表達(dá)和局 部炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。此外，已經(jīng)闡明，嗜中性粒細(xì)胞上的CD69在關(guān)節(jié)炎的發(fā)作中發(fā)揮 重要作用（非專利文獻(xiàn)4)。此外，已經(jīng)報(bào)道，CD69控制過敏性氣道炎癥，并且針對(duì)小鼠CD69 的抗體抑制過敏性氣道炎癥（非專利文獻(xiàn)5)。還已經(jīng)報(bào)道，香煙煙霧誘導(dǎo)的COro和博來 霉素誘導(dǎo)的肺纖維化（lungfibrogenesis)在CD69缺陷的小鼠中得到衰減（非專利文獻(xiàn)6 和7)。因此，預(yù)期應(yīng)用針對(duì)CD69的抗體W預(yù)防或治療此類過敏性疾病和炎性疾病。然而， 由于CD69的配體是未知的，所W沒有可用的用于有效評(píng)價(jià)針對(duì)人CD69的抗體的體外藥理 學(xué)作用的方法。此外，由于現(xiàn)有針對(duì)人CD69的抗體不與非人CD69交叉反應(yīng)，所W對(duì)于現(xiàn)有 抗體的體內(nèi)藥理學(xué)作用的評(píng)價(jià)實(shí)質(zhì)上是不可能的，并且甚至該些抗體是否得到有用的藥理 學(xué)作用也是不清楚的。如上所述，由于不存在用于評(píng)價(jià)抗人CD69抗體的藥理學(xué)作用的令人 滿意的方法，所W適用于預(yù)防或治療過敏性疾病和炎性疾病的抗人CD69抗體的開發(fā)延遲 落后很多。
[0003] 瞻菌體展示方法是已經(jīng)通過在功能膚或蛋白和編碼其的DNA之間W瞻菌體顆粒 的形式形成一一對(duì)應(yīng)而實(shí)現(xiàn)體外高速選擇的展示技術(shù)之一。該種瞻菌體展示方法已經(jīng)被應(yīng) 用于抗體選擇，并且通過該方法獲得的抗體已經(jīng)被開發(fā)作為藥物（非專利文獻(xiàn)8)。此外，已 經(jīng)建立了通過組合人人工抗體文庫和瞻菌體展示方法而獲得特異性抗體的方法，而此類方 法已經(jīng)由多個(gè)公司實(shí)施，如Mo巧hoSys的化CAL(人組合抗體文庫（HumanCombinatorial AntibodyLibrary))所證明。
[0004][文獻(xiàn)列表]
[非專利文獻(xiàn)] 非專利文獻(xiàn) 1:Testi,R.等人Immunol.Today15: 479-483, 1994。 非專利文獻(xiàn) 2:Yamashita,I.等人Int.Immunol. 5: 1139-1150，1993。 非專利文獻(xiàn) 3:P'Jakayama,T.等人J.Immunol. 168: 87-94, 2002。 非專利文獻(xiàn) 4:Murata,K.等人Int.Immunol. 15: 987-992，2003。 非專利文獻(xiàn) 5:Miki-Hosokawa,T.等人J.Immunol. 183: 8203-8215，2009。 非專利文獻(xiàn) 6:Tsuyusaki,J.等人J.Recept.Si即alTransduct.Res. 31: 似4-439，2011。 非專利文獻(xiàn) 7:Yamauchi,K.等人Respir.Res. 12: 131, 2011。 非專利文獻(xiàn) 8:Rothe,C.等人J.Mol.Biol. 376: 1182-1200，2008。
[000引 發(fā)明概述 本發(fā)明待解決的問題 本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供適用于預(yù)防或治療過敏性疾病和炎性疾病的抗人CD69抗 體。
[0006] 解決問題的方法 為了解決上述問題，本發(fā)明人首先產(chǎn)生結(jié)合人CD69和小鼠CD69兩者的抗CD69抗體。 此外，他們深入研究了體內(nèi)評(píng)價(jià)抗人CD69抗體的藥理學(xué)作用的方法。作為結(jié)果，他們已經(jīng) 成功地通過在用特定抗原免疫的CD69缺陷小鼠的化2細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)人CD69并將化2細(xì) 胞返回至小鼠的體內(nèi)而在小鼠中再現(xiàn)過敏反應(yīng)，該是由表達(dá)人CD69的Th2細(xì)胞介導(dǎo)的。他 們已經(jīng)通過化CAL產(chǎn)生了多種抗人CD69抗體，并通過使用上述小鼠評(píng)價(jià)對(duì)過敏反應(yīng)的效 果。作為結(jié)果，他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有優(yōu)異的過敏抑制效果和炎癥抑制效果的抗人CD69抗 體。此外，他們已經(jīng)通過修飾獲得的抗體的輕鏈CDR3而改進(jìn)了人CD69的親和力，并成功地 加強(qiáng)了過敏抑制效果和炎癥抑制效果，同時(shí)維持了與小鼠CD69的交叉反應(yīng)性?；谏鲜霭l(fā) 現(xiàn)，他們已經(jīng)完成了本發(fā)明。
[0007] 因此，本發(fā)明涉及W下內(nèi)容。
[0008] [1]特異性結(jié)合人CD69的抗體，其具有抑制過敏性炎癥的活性，并且具有與小鼠 CD69的交叉反應(yīng)性。
[000引 凹山的抗體，其在包含SEQIDNO:33顯示的氨基酸序列的表位處結(jié)合人CD69。
[0010] [3] [1]的抗體，其包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中 (1) 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 7中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:8中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 9、19或20中顯示的氨基酸序列的 CDR3,并且所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQ IDNO: 11中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的CDR3， 或 (2) 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 7中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:8中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 9、19或20中顯示的氨基酸序列的 CDR3,并且所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQ IDNO: 11中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的CDR3， 除了在選自SEQIDN0:7 - 9、19和20中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列 中取代、缺失、插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸，和/或 在選自SEQIDNO: 10 - 12中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、 插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸。
[0011] [句閒的抗體，其中 (1'）所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 23、27或28中顯示的氨基酸序列，并且所述重 鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 24顯示的氨基酸序列。
[0012] [引特異性結(jié)合人CD69的抗體，其具有抑制過敏性炎癥的活性，并在包含SEQID NO: 59或78顯示的氨基酸序列的表位處結(jié)合人CD69。
[0013] [6]特異性結(jié)合人CD69的抗體，其具有抑制過敏性炎癥的活性，并且包含輕鏈可 變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中 (3) 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 3中顯示的氨基酸序列的CDR3,并且 所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDN0:5中 顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO:6中顯示的氨基酸序列的CDR3 ; (4) 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 13中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQID NO: 14中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 15中顯示的氨基酸序列的CDR3,并 且所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 16中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 17 中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 18中顯示的氨基酸序列的CDR3 ; (5) 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 3中顯示的氨基酸序列的CDR3,并且 所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDN0:5中 顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDN0:6中顯示的氨基酸序列的CDR3, 除了在選自SEQIDN0:1至3中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺 失、插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸，和/或 在選自SEQIDN0:4至6中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插 入和/或添加1至3個(gè)氨基酸；或 (6) 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 13中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 14中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 15中顯示的氨基酸序列的CDR3,并 且所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 16中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 17 中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 18中顯示的氨基酸序列的CDR3, 除了在選自SEQIDNO: 13至15中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、 缺失、插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸，和/或 在選自SEQIDNO: 16至18中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、 插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸。
[0014] [7] [6]的抗體，其中 (3'）所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 21中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區(qū) 包含SEQIDNO: 22顯示的氨基酸序列；或 (4'）所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 25中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區(qū) 包含SEQIDNO: 26顯示的氨基酸序列。
[0015][引[1] - [7]中任一項(xiàng)的抗體，其關(guān)于與人CD69的結(jié)合親和力具有不大于5xl〇-s M的Kd值。
[001引 [9]山-閒中任一項(xiàng)的抗體，其是人抗體。
[0017] [10]藥物組合物，其包含山-[9]中任一項(xiàng)的抗體。
[0018] [11]用于過敏性疾病或炎性疾病的預(yù)防劑或治療劑，其包含[1] - [9]中任一項(xiàng) 的抗體。
[0019] [12]多核巧酸，其編碼[1] - [9]中任一項(xiàng)的抗體。
[0020] [13]載體，其包含[12]的多核巧酸。
[00川 [M]轉(zhuǎn)化體，其包含[切的載體。
[0022] [1引非人哺乳動(dòng)物，其包含用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)移 的化2細(xì)胞，其中所述化2細(xì)胞表達(dá)人CD69。
[0023] [16] [15]的非人哺乳動(dòng)物，其中所述非人哺乳動(dòng)物是小鼠。
[0024] [17] [1] - [9]中任一項(xiàng)的抗體，其用于預(yù)防或治療過敏性疾病或炎性疾病。
[0025] [1引用于哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療過敏性疾病或炎性疾病的方法，其包括將有效 量的[1] - [9]中任一項(xiàng)的抗體施用于所述哺乳動(dòng)物。
[0026] [19] [1] - [9]中任一項(xiàng)的抗體用于生產(chǎn)預(yù)防或治療過敏性疾病或炎性疾病的 藥劑的用途。
[0027] 發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明，提供了適用于預(yù)防或治療過敏性疾病和炎性疾病的抗人CD69抗體。此 夕F，根據(jù)本發(fā)明，可提供允許體內(nèi)評(píng)價(jià)抗人CD69抗體的藥理學(xué)作用的動(dòng)物模型。
[002引附圖簡(jiǎn)述 圖1顯示通過細(xì)胞染色評(píng)價(jià)與人CD69和小鼠CD69的結(jié)合。
[0029] 圖2顯示通過流式細(xì)胞術(shù)分析人CD69表達(dá)。
[0030] 圖3顯示各種抗人CD69抗體對(duì)肺泡白細(xì)胞浸潤的效果。
[0031] 圖4通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)各種抗人CD69抗體與小鼠CD69和人CD69的交叉反應(yīng) 性。
[0032] 圖5顯示各種抗人CD69抗體針對(duì)肺泡白細(xì)胞浸潤的效果。
[0033] 圖6顯示小鼠CD69 (上部序列）和人CD69 (下部序列）的氨基酸序列的比對(duì)。
[0034] 實(shí)施方案的描述 本發(fā)明提供具有對(duì)人CD69特異性結(jié)合活性和抑制過敏性炎癥的活性的抗體。
[003引 CD69是已知的II型膜蛋白，并且其氨基酸序列和其CDNA序列也是已知的。人 CD69的代表性氨基酸序列顯示于SEQIDNO: 30,人CD69的代表性cDNA序列顯示于SEQID NO: 29,小鼠CD69的代表性氨基酸序列顯示于SEQIDNO: 32,且小鼠CD69的代表性CDNA序 列顯示于SEQIDNO:31。
[0036] 本發(fā)明的抗體具有對(duì)人CD69的胞外結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合活性。人CD69的胞外結(jié) 構(gòu)域?qū)?yīng)于SEQIDN0:30顯示的氨基酸序列中62-199的區(qū)域，且小鼠CD69的胞外結(jié)構(gòu)域 對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:32顯示的氨基酸序列中62-199的區(qū)域。
[0037]"人CD69"意指CD69的氨基酸序列或核酸序列具有與人中天然表達(dá)的CD69的氨 基酸序列或核巧酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列或核酸序列。"實(shí)質(zhì)上相同"意指目 標(biāo)氨基酸序列或核酸序列與人中天然表達(dá)的具體CD69的氨基酸序列或核酸序列具有70% 或更高（優(yōu)選80 %或更高，更優(yōu)選90 %或更高，進(jìn)一步優(yōu)選95 %或更高，最優(yōu)選99 %或更 高）同一性，并且具有具體人CD69的功能。除了人W外的生物物種，除了CD69W外的蛋白， 其基因和片段也W相同方式進(jìn)行解釋。
[003引抗體與抗原X的"特異性結(jié)合"意指在抗原-抗體反應(yīng)中抗體與抗原X的結(jié)合親 和力的Kd值不大于Ixicr7M。
[0039]在本說明書中，關(guān)于本發(fā)明的抗體與人CD69的結(jié)合親和力的Kd值根據(jù) Immunoassays(OXK)畑UNIVERSITYPRESS, 2000)中描述的原理使用斯卡恰特作圖法 (scatchardplotmethod)進(jìn)行計(jì)算。將抗體與各種濃度的抗原（人CD69的胞外結(jié)構(gòu)域） 在室溫下賠育2小時(shí)，直到平衡，并且通過化ISA方法測(cè)量賠育溶液中存在的游離抗體的 量?；诿總€(gè)平衡樣品中游離抗體量的變化測(cè)定結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)（Kd值）。平衡反應(yīng) 過程中的抗體濃度為0. 015yg/ml，并且用于測(cè)量游離抗體的量的化ISA板用W1yg/ml 的抗原固定。
[0040] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與人CD69的結(jié)合親和力的Kd值不大于 5X10-8M。
[0041] 本發(fā)明的抗體具有抑制過敏性炎癥的活性。過敏性炎癥是指特征在于目標(biāo)組織中 單核細(xì)胞的選擇性積累的炎癥，其與過敏反應(yīng)關(guān)聯(lián)發(fā)生。單核細(xì)胞涵蓋Th2細(xì)胞、嗜酸性粒 細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和服大細(xì)胞?？贵w是否具有抑制過敏性炎癥的活性可W通過評(píng)價(jià)其是 否抑制通過將下述本發(fā)明的非人哺乳動(dòng)物暴露于抗原誘導(dǎo)的過敏性反應(yīng)（例如，白細(xì)胞浸 潤）來證實(shí)。
[0042] 在本說明書中，"抗體"被用作涵蓋全長(zhǎng)抗體和其任何抗原結(jié)合片段（即"抗原結(jié) 合部分"）或其單鏈的抗體。"抗體"是指含有通過二硫鍵連接的至少兩條重鏈（H)和兩條 輕鏈（L)的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)（本文中簡(jiǎn)稱為Vh)和重 鏈恒定區(qū)構(gòu)成。重鏈恒定區(qū)由ChUCh2和Ch3的3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū) (本文中簡(jiǎn)稱為和輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。輕鏈恒定區(qū)由單一結(jié)構(gòu)域片構(gòu)成。Vh和Vl區(qū)被 進(jìn)一步細(xì)分為被稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的具有更高可變性的區(qū)域，其含有分散在其中的被 稱為框架區(qū)（FR)的更高保守區(qū)域。每個(gè)Vh和Vl由3個(gè)CDR和4個(gè)FR構(gòu)成，它們W下列 順序排列，即，從氨基末端至駿基末端的FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述重鏈和 輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可W介導(dǎo)免疫球蛋白與宿 主組織或因子（包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞（例如，效應(yīng)細(xì)胞）和常規(guī)補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分 (Clq))的結(jié)合。
[0043] 在本說明書中，抗體的"抗原結(jié)合部分"被用來指抗體的保留特異性結(jié)合抗原（例 女口，人CD69)的能力的一個(gè)或多個(gè)片段。已經(jīng)闡明，抗體的抗原結(jié)合功能由全長(zhǎng)抗體的片段 行使。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"中包括的結(jié)合片段的實(shí)例包括（i)F油片段，由心Vh、 片和Chi結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段，（ii)F(ab'）2片段，含有由較鏈區(qū)中的二硫鍵連接的兩個(gè) F油片段的二價(jià)片段，（iii)F油'片段，具有較鏈區(qū)部分的固有F油（參見FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY,Pauled.，3.sup.rded. 1993)，（iv)由Vh和Cm結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段， (V)由抗體的單一臂中的和Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段，（Vi)由Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的dAb片段 (Ward等人，（1989)化Uire341:544-546)，（vU)分離的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，W及（ViU) 作為含有單一可變結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)恒定區(qū)的重鏈可變區(qū)的納米抗體。盡管作為Fv片段的兩 個(gè)結(jié)構(gòu)域的Vl和Vh由不同基因編碼，但它們可W通過重組技術(shù)通過合成接頭連接W產(chǎn)生 來自它們的單一蛋白鏈，其中，在該鏈中，和Vh區(qū)彼此配對(duì)W形成單價(jià)分子（稱為單鏈 Fv(ScFv);參見，例如，Bird等人（1988)Science242:423-426;和Huston等人，（1988) Proc.化tl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。此類單鏈抗體也涵蓋在抗體的"抗原結(jié)合 部分"中。此類抗體片段由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過已知的常規(guī)技術(shù)獲得，并且W與未修飾 抗體相同的方式篩選可用性。
[0044] 本發(fā)明的抗體優(yōu)選是單克隆抗體。"單克隆抗體"是指單一分子組成（single moleculecomposition)的抗體分子的制備物。單克隆抗體組成顯示對(duì)被稱為表位的抗原 特定部分的單一結(jié)合特異性和親和力。
[0045] 本發(fā)明的抗體優(yōu)選是人抗體。"人抗體"是指在框架區(qū)和CDR區(qū)兩者中具有源自人 種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)的抗體。此外，當(dāng)抗體含有恒定區(qū)時(shí)，恒定區(qū)也源自人種系免 疫球蛋白序列。在本說明書中，"人抗體"也甚至涵蓋包括不是由人種系免疫球蛋白序列編 碼的氨基酸殘基的實(shí)施方案（例如，通過在體外隨機(jī)或位點(diǎn)定向誘變或在體內(nèi)體細(xì)胞突變 引入的突變）。然而，在本說明書中，"人抗體"的術(shù)語并不意在包括其中源自除了人W外的 動(dòng)物物種諸如小鼠的種系的CDR序列融合在人框架序列上的抗體。
[0046] 在本說明書中，人抗體涵蓋"重構(gòu)的人抗體"。重構(gòu)的人抗體是指其中在第二人受 體抗體中使用第一人供體抗體中含有的至少一個(gè)CDR而不是第二人受體抗體的CDR的修 飾的抗體。優(yōu)選地，取代所有6個(gè)CDR。更優(yōu)選地，使用第一人供體抗體的整個(gè)抗原結(jié)合區(qū) (例如，F(xiàn)v、Fab或F(ab'）2)代替第二人受體抗體中的對(duì)應(yīng)區(qū)域。更優(yōu)選地，將第一人供體 抗體的F油區(qū)可操作地連接至第二人受體抗體的適當(dāng)?shù)暮愣▍^(qū)，W形成全長(zhǎng)抗體。
[0047] 重構(gòu)的人抗體可W通過公開于，例如，EP125023、W096/02576、非專利文獻(xiàn)8等中 的常規(guī)基因重組技術(shù)來產(chǎn)生。具體地，例如，經(jīng)設(shè)計(jì)W連接供體人抗體中期望的CDR和受 體人抗體中期望的框架區(qū)（FR)的DNA序列通過PCR方法使用作為引物的經(jīng)產(chǎn)生W具有與 CDR和FR兩者的末端區(qū)域重疊的區(qū)域的幾個(gè)寡核巧酸來合成（參見W098/13388中描述的 方法）。將獲得的DNA連接至編碼人抗體恒定區(qū)或人抗體恒定區(qū)突變體的DNA，將其并入 表達(dá)載體中，并將載體引入宿主W允許產(chǎn)生，由此可W獲得重構(gòu)的人抗體（參見EP125023、 W096/02576)。
[0048] 此外，在本說明書中，人抗體涵蓋"人工人抗體"。人工人抗體可W通過公開于，例 女口，非專利文獻(xiàn)8等中的常規(guī)基因重組技術(shù)來產(chǎn)生。
[0049] 本發(fā)明的抗體還包括其中融合上述抗體和其他膚或蛋白的融合蛋白。融合蛋白的 產(chǎn)生方法包括：連接編碼本發(fā)明的抗體的多核巧酸和編碼其他膚或多膚的多核巧酸W匹配 框架，將其引入表達(dá)載體，并允許其在宿主中表達(dá)，并可W使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的 技術(shù)。作為待與本發(fā)明的抗體融合的其他膚，可W使用已知的膚，諸如FLAGOlopp,T.P. 等人，BioTechnology(1988) 6，1204-1210)、由 6 個(gè)His(組氨酸）殘基組成的 6XHis、 10XHis、人c-myc片段、VSV-GP片段、pl8HIV片段、T7-標(biāo)簽、HSV-標(biāo)簽、E-標(biāo)簽、SV40T抗 原片段、Ick標(biāo)簽、a-微管蛋白片段、B-標(biāo)簽、蛋白C片段等。待與本發(fā)明的抗體融合的 其他多膚的實(shí)例包括GST(谷脫甘膚-S-轉(zhuǎn)移酶）、HA(流感血凝素）、免疫球蛋白恒定區(qū)、 目-半乳糖巧酶、MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白）等。將商購的編碼此類膚或多膚的多核巧酸與編 碼本發(fā)明的抗體的多核巧酸融合，并且表達(dá)由此制備的融合多核巧酸，從而可W制備融合 多膚。
[0050] 本發(fā)明的抗體可W是與各種分子結(jié)合的綴合抗體，所述分子例如，聚合物物質(zhì)，諸 如聚己二醇（PEG),透明質(zhì)酸等，放射性物質(zhì)，英光物質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)，酶，毒素等。此類綴合 抗體可W通過化學(xué)修飾獲得的抗體而獲得。本領(lǐng)域中已經(jīng)建立了抗體的修飾方法（例如， US5057313.US5156840)〇
[0051] 本發(fā)明的抗體優(yōu)選是分離的或純化的。"分離的或純化的"意指去除除了目標(biāo)組 分W外的組分的操作已被應(yīng)用于天然存在的狀態(tài)。本發(fā)明的分離或純化的抗體的純度（本 發(fā)明的抗體的重量與總蛋白的重量的比率）通常為50%或更高，優(yōu)選70%或更高，更優(yōu)選 90%或更高，最優(yōu)選95%或更高（例如，基本上100% )。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有與小鼠CD69 (優(yōu)選小鼠CD69的胞外結(jié)構(gòu) 域）的交叉反應(yīng)性。"交叉反應(yīng)性"意指特異性結(jié)合人CD69的抗體也通過抗原-抗體反應(yīng) 結(jié)合小鼠CD69(優(yōu)選小鼠CD69的胞外結(jié)構(gòu)域）。具有與小鼠CD69的交叉反應(yīng)性的本發(fā)明 的抗體的優(yōu)異之處在于它可W甚至在不表達(dá)人CD69的小鼠中評(píng)價(jià)效力。
[0053] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有與小鼠CD69的交叉反應(yīng)性的本發(fā)明的抗體在含 有SEQIDN0:33顯示的氨基酸序列（YNCPG)的表位處結(jié)合人CD69。含有SEQIDN0:33 中顯示的氨基酸序列的表位包括，例如，由SEQIDN0:30中顯示的氨基酸序列的連續(xù)部分 序列組成的表位，其含有SEQIDN0:33中顯示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸長(zhǎng) 度。作為含有SEQIDNO: 33顯示的氨基酸序列的表位，具體地，可W提到由SEQIDNO: 35 顯示的氨基酸序列組成的表位，和由SEQIDN0:36顯示的氨基酸序列組成的表位。
[0054] 作為具有與小鼠CD69的交叉反應(yīng)性的本發(fā)明的抗體，可W提到W下（1)和（2)中 描述的抗體： (1) 包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體， 其中所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 7中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:8中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 9、19或20中顯示的氨基酸序列的 CDR3,并且所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQ IDNO: 11中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的CDR3; 和 (2) 包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體， 其中所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 7中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:8中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 9、19或20中顯示的氨基酸序列的 CDR3,并且所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQ IDNO: 11中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的CDR3， 除了在選自SEQIDN0:7 - 9、19和20中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列 中取代、缺失、插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸，和/或 在選自SEQIDN0:10 - 12中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺 失、插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸。
[005引上述（1)或似中描述的抗體可W在W下表位處結(jié)合人CD69;包含SEQIDNO: 33 中顯示的氨基酸序列的表位（優(yōu)選地，由SEQIDN0:30中顯示的氨基酸序列的連續(xù)部分序 列組成的表位，其含有SEQIDN0:33中顯示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸長(zhǎng) 度；更優(yōu)選地，由SEQIDNO:35或SEQIDNO:36顯示的氨基酸序列組成的表位）。
[0056] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在由SEQIDN0:59顯示的氨基酸序列組成的表 位處結(jié)合人CD69。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在含有SEQIDN0:78顯示的氨基酸序列 (YAGRE巧的表位處結(jié)合人CD69。含有SEQIDN0:78中顯示的氨基酸序列的表位包括， 例如，由SEQIDN0:30中顯示的氨基酸序列的連續(xù)部分序列組成的表位，其含有SEQID NO:78中顯示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸長(zhǎng)度。作為含有SEQIDNO:78顯 示的氨基酸序列的表位，具體地，可W提到由SEQIDN0:57顯示的氨基酸序列組成的表位， 由SEQIDNO:58顯示的氨基酸序列組成的表位，和由SEQIDNO:59顯示的氨基酸序列組 成的表位。
[005引作為其他本發(fā)明的抗體，可W提到W下（3)-化）中描述的抗體： (3) 包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體， 其中所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 3中顯示的氨基酸序列的CDR3,并且 所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDN0:5中 顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO:6中顯示的氨基酸序列的CDR3 ; (4) 包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體， 其中所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 13中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 14中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 15中顯示的氨基酸序列的CDR3,并 且所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 16中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 17 中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 18中顯示的氨基酸序列的CDR3 ; (5) 包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體， 其中所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 3中顯示的氨基酸序列的CDR3,并且 所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDN0:5中 顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO:6中顯示的氨基酸序列的CDR3， 除了在選自SEQIDN0:1至3中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺 失、插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸，和/或 在選自SEQIDN0:4至6中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插 入和/或添加1至3個(gè)氨基酸；和 (6) 包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體， 其中所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 13中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 14中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 15中顯示的氨基酸序列的CDR3,并 且所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 16中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 17 中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 18中顯示的氨基酸序列的CDR3, 除了在選自SEQIDNO: 13至15中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、 缺失、插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸，和/或 在選自SEQIDNO: 16至18中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、 插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸。
[005引上述（3)或（5)中描述的抗體在由SEQIDNO:59顯示的氨基酸序列組成的表位 處結(jié)合人CD69。
[0060]上述（4)或（6)中描述的抗體可W在W下表位處結(jié)合人CD69 :由SEQIDN0:78中 顯示的氨基酸序列組成的表位（優(yōu)選地，由SEQIDN0:30中顯示的氨基酸序列的連續(xù)部分 序列組成的表位，其含有SEQIDNO: 78中顯示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸長(zhǎng) 度；更優(yōu)選地，由SEQIDNO: 57、SEQIDNO: 58或SEQIDNO: 59顯示的氨基酸序列組成的 表位）。
[0061] (I)中描述的抗體關(guān)于與人CD69的結(jié)合親和力的Kd值優(yōu)選不大于3xl〇-sM。當(dāng)輕 鏈可變區(qū)中的CDR3具有SEQIDNO: 19顯示的氨基酸序列時(shí)，所述抗體關(guān)于與人CD69的結(jié) 合親和力的Kd值為優(yōu)選不大于Ixicr8M，更優(yōu)選不大于5xl(T9M，進(jìn)一步優(yōu)選不大于2xl(T9 M。當(dāng)輕鏈可變區(qū)中的CDR3具有SEQIDN0:20顯示的氨基酸序列時(shí)，所述抗體關(guān)于與人 CD69的結(jié)合親和力的Kd值為優(yōu)選不大于IxlO-SM，更優(yōu)選不大于5xl〇-9M，進(jìn)一步優(yōu)選不大 于 3x10 9M。
[0062] (2)中描述的抗體關(guān)于與人CD69的結(jié)合親和力的Kd值優(yōu)選不大于3xl〇-sM。
[0063] 當(dāng)（2)中描述的抗體是包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體，其中 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO:7中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQIDNO:8 中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 19中顯示的氨基酸序列的CDR3,并且所 述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 11中 顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的CDR3, 除了在選自SEQIDN0:7、8和19中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、 缺失、插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸，和/或 在選自SEQIDNO: 10至12的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至 3個(gè)氨基酸， 所述抗體關(guān)于與人CD69的結(jié)合親和力的Kd值為優(yōu)選不大于Ixicr8M，更優(yōu)選不大于 5xl〇-9M,進(jìn)一步優(yōu)選不大于2xl〇-9M。
[0064] 當(dāng)（2)中描述的抗體是包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體，其中 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO:7中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQIDNO:8 中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 20中顯示的氨基酸序列的CDR3,并且所 述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 11中 顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的CDR3， 除了在選自SEQIDN0:7、8和20中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、 缺失、插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸，和/或 在選自氨基酸序列SEQIDN0:10 - 12的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插入和/ 或添加1至3個(gè)氨基酸，關(guān)于所述抗體與人CD69的結(jié)合親和力的Kd值為優(yōu)選不大于1x10^8 M，更優(yōu)選不大于5xl〇-9M，進(jìn)一步優(yōu)選不大于3xl〇-9M。
[0065] (3)或巧）中描述的抗體關(guān)于與人CD69的結(jié)合親和力的Kd值優(yōu)選不大于5xl〇-s M。
[0066] (4)或化）中描述的抗體關(guān)于與人CD69的結(jié)合親和力的Kd值優(yōu)選不大于8xl〇-9 M。
[0067]在（2)、妨和做的實(shí)施方案中，待取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸數(shù)目沒 有特別限制，只要所述抗體特異性結(jié)合人CD69,并且具有抑制過敏性炎癥的活性。它優(yōu)選為 每一個(gè)CDR序列2個(gè)氨基酸W內(nèi)，更優(yōu)選一個(gè)氨基酸。其中取代、缺失、插入和/或添加氨 基酸的CDR序列的數(shù)目沒有特別限制，只要所述抗體特異性結(jié)合人CD69,并且具有抑制過 敏性炎癥的活性。它優(yōu)選為每一個(gè)輕鏈可變區(qū)2W內(nèi)，更優(yōu)選為一，并且優(yōu)選為每一個(gè)重鏈 可變區(qū)2W內(nèi)，更優(yōu)選為1。可W在輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)兩者或它們的任一者中進(jìn)行氨 基酸的取代、缺失、插入和/或添加。
[006引在（2)、妨和做的實(shí)施方案中，優(yōu)選僅在輕鏈可變區(qū)中CDR3的氨基酸序列中取 代、缺失、插入和/或添加1 - 3 (優(yōu)選1或2,更優(yōu)選1)個(gè)氨基酸。
[0069] 在（2)的實(shí)施方案中，當(dāng)在輕鏈可變區(qū)中CDR3的氨基酸序列中取代、缺失、插入和 /或添加1 - 3個(gè)氨基酸時(shí)，優(yōu)選維持CDR3的氨基酸序列的第2個(gè)的絲氨酸和第3個(gè)的酪 氨酸。CDR3的氨基酸序列的第一個(gè)氨基酸是在谷氨醜胺和甘氨酸之間可相互取代的。CDR3 的氨基酸序列的第4個(gè)氨基酸是在天冬氨酸和蘇氨酸之間可相互取代的。CDR3的氨基酸序 列的第5個(gè)氨基酸是在絲氨酸和蘇氨酸之間可相互取代的。
[0070] 用于用其他期望的氨基酸取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的方法的實(shí)例包括 定點(diǎn)誘變法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y, 和Nakagawa,M. (1995)An〇1igodeoxyribonucIeotide-directeddualambermethodfor site-directedmutagenesis.Gene152, 271-275;Zoller,MJ, 和Smith,M. (1983)Oligonucleotide-directedmutagenesisofDNAfragmentsclonedintoM13vectors.MethodsEnzymoI. 100, 468-500;Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW, Kramer,B,Pflugfelder,M,和Fritz,HJ(1984)ThegappedduplexDNAapproach tooligonucleotide-directedmutationconstruction.NucleicAcidsRes. 12, 9441-9456;KramerW,和FritzHJ(1987)Oligonucleotide-directedconstruction ofmutationsviagappedduplexDNAMethods.EnzymoI. 154, 350-367,KunkeI, TA(1985)Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypic selection.Proc化1:1AcadSciUSA. 82, 488-492)O使用該些方法，抗體中期望的氨 基酸可W被其他目標(biāo)氨基酸取代。此外，使用文庫技術(shù)諸如框架改組（MolImmunol. 2007 Apr; 44(11):3049-60)和CDR修復(fù)化S2006 /0122377)等，框架或CDR中的氨基酸也可W 被其他適當(dāng)?shù)陌被崛〈?br> [0071]在本發(fā)明的抗體中，作為待連接至CDR的抗體的框架區(qū)（FR)，選擇使得CDR形成良 好抗原結(jié)合位點(diǎn)的框架。盡管待用于本發(fā)明的抗體的FR沒有特別限制并且可W使用任何 FR,但優(yōu)選使用人抗體的FR。作為人抗體的FR,可W使用具有天然序列的FR,或者可W根據(jù) 需要取代、缺失、插入和/或添加等具有天然序列的框架區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，從而使 得CDR將形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合位點(diǎn)。例如，可W通過測(cè)量和評(píng)價(jià)具有含取代的氨基酸的FR 的抗體與抗原的結(jié)合活性來選擇具有期望特性的突變體FR序列（Sato,K.等人，Cancer Res. (1993)53, 851-856)。
[007引在（1)和似的抗體中，人抗體的V13的FR化油at數(shù)據(jù)庫）優(yōu)選用于輕鏈，并且 人抗體的V冊(cè)的FR化油at數(shù)據(jù)庫）優(yōu)選用于重鏈。
[007引在做和妨的抗體中，人抗體的Vkl的FR化油at數(shù)據(jù)庫）優(yōu)選用于輕鏈，并且 人抗體的VHlB的FR化油at數(shù)據(jù)庫）優(yōu)選用于重鏈。
[0074] 在（4)和化）的抗體中，人抗體的Vk3的FR化abat數(shù)據(jù)庫）優(yōu)選用于輕鏈，并且 人抗體的V冊(cè)的FR化油at數(shù)據(jù)庫）優(yōu)選用于重鏈。
[0075] 用于本發(fā)明的抗體的恒定區(qū)沒有特別限制，并且可W使用任何恒定區(qū)。用于本發(fā) 明的抗體的恒定區(qū)的優(yōu)選實(shí)例包括人抗體的恒定區(qū)（源自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM 等的恒定區(qū)）。例如，Cyl、Cy2、Cy3、Cy4、Cy、C5、Cal、Ca2、Ce可用于H鏈中，并 且Ck、C入可用于L鏈中。
[007引在（I)和似的抗體中，人抗體的CA的恒定區(qū)優(yōu)選用于輕鏈，并且人抗體的Cy4 的恒定區(qū)優(yōu)選用于重鏈。
[0077]在做和妨的抗體中，人抗體的Ck的恒定區(qū)優(yōu)選用于輕鏈，并且人抗體的Cy4 的恒定區(qū)優(yōu)選用于重鏈。
[007引在（4)和做的抗體中，人抗體的Ck的恒定區(qū)優(yōu)選用于輕鏈，并且人抗體的Cy4 的恒定區(qū)優(yōu)選用于重鏈。
[0079] 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體包括W下： (1'）包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 23、27或28中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 24中顯示的氨基 酸序列； (3'）包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 21 中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 22中顯示的氨基酸序列；和 (4'）包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 25 中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 26中顯示的氨基酸序列。
[0080] 分別地，上述（1'）的抗體對(duì)應(yīng)于上述（1)的抗體的優(yōu)選實(shí)施方案，上述保）的抗 體對(duì)應(yīng)于上述（3)的抗體的優(yōu)選實(shí)施方案，并且上述（4'）的抗體對(duì)應(yīng)于上述（4)的抗體的 優(yōu)選實(shí)施方案。
[00引]上述（r)中描述的抗體可W在W下表位處結(jié)合人CD69 ;包含SEQIDNO:33顯示 的氨基酸序列的表位（優(yōu)選地，由SEQIDNO:30中顯示的氨基酸序列的連續(xù)部分序列組成 的表位，其含有SEQIDN0:33中顯示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸長(zhǎng)度；更優(yōu) 選地，由SEQIDNO: 35或SEQIDNO: 36顯示的氨基酸序列組成的表位）。
[0082] 上述保）中描述的抗體可W在由SEQIDN0:59顯示的氨基酸序列組成的表位處 結(jié)合人CD69。
[0083] 上述（4'）中描述的抗體可W在W下表位處結(jié)合人CD69 ;包含SEQIDNO: 78顯示 的氨基酸序列的表位（優(yōu)選地，由SEQIDNO:30中顯示的氨基酸序列的連續(xù)部分序列組成 的表位，其含有SEQIDN0:78中顯示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸長(zhǎng)度；更優(yōu) 選地，由SEQIDNO:57、SEQIDNO:58或SEQIDNO:59顯示的氨基酸序列組成的表位）。
[0084] 本發(fā)明提供了含有編碼上述本發(fā)明的抗體的核巧酸序列的多核巧酸。所述多核巧 酸可W是DNA或RNA，或DNA/RNA嵌合體。所述多核巧酸可W是雙鏈或單鏈的。當(dāng)所述多 核巧酸是雙鏈的時(shí)，它可W是雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA=RNA雜合體。
[0085] 本發(fā)明的多核巧酸涵蓋含有編碼本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)兩者 的核巧酸序列的多核巧酸，和含有編碼本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)的核巧酸序列的多核巧 酸和含有編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)的核巧酸序列的多核巧酸的組合。
[0086] 本發(fā)明的多核巧酸可W基于本發(fā)明的抗體的氨基酸序列的信息、已知序列信息和 本說明書中序列表中描述的序列信息并且通過利用已知的基因重組技術(shù)容易地制備。例 女口，合適的引物基于序列信息設(shè)計(jì)，編碼構(gòu)成本發(fā)明的抗體的元件的DNA通過PCR反應(yīng)擴(kuò) 增，DNA片段通過適當(dāng)?shù)拿钢T如連接酶等連接，由此可W產(chǎn)生本發(fā)明的多核巧酸。或者，編 碼每個(gè)元件的多核巧酸可W基于本發(fā)明的抗體的氨基酸序列的信息通過多核巧酸合成儀 進(jìn)行合成。
[0087] 獲得的編碼本發(fā)明的抗體的多核巧酸可W，根據(jù)目的，直接使用，或者當(dāng)期望時(shí)用 限制性酶消化或添加接頭后使用。所述多核巧酸可W具有ATG作為5'末端側(cè)上的翻譯起 始密碼子，并且可W具有TAA、TGA或TAG作為3'末端側(cè)上的翻譯終止密碼子。該些翻譯起 始密碼子和翻譯終止密碼子可W使用合適的合成的DNA適配體進(jìn)行添加。
[0088]本發(fā)明的多核巧酸優(yōu)選是分離的或純化的。本發(fā)明的分離或純化的多核巧酸具有 通常50 %或更高，優(yōu)選70 %或更高，更優(yōu)選90 %或更高，最優(yōu)選95 %或更高（例如，基本上 100%)的純度（本發(fā)明的多核巧酸的重量與總多核巧酸重量的比率）。
[0089] 本發(fā)明提供了包含上述本發(fā)明的多核巧酸的載體。本發(fā)明的載體涵蓋包含含有編 碼本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)兩者的核巧酸序列的多核巧酸的載體，和包含 含有編碼本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)的核巧酸序列的多核巧酸的載體和包含含有編碼本 發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)的核巧酸序列的多核巧酸的載體的組合。所述載體優(yōu)選是分離的 或純化的。所述載體的實(shí)例包括表達(dá)載體、克隆載體等，其可W根據(jù)對(duì)象來選擇。優(yōu)選地， 所述載體是表達(dá)載體。表達(dá)載體可W表達(dá)本發(fā)明的抗體。表達(dá)載體可W通過將本發(fā)明的多 核巧酸可操作地連接至合適的表達(dá)載體中啟動(dòng)子的下游來產(chǎn)生。載體的種類包括，例如，質(zhì) 粒載體、病毒載體等，其可W根據(jù)待使用的宿主適當(dāng)?shù)剡x擇。
[0090] 作為宿主，使用屬埃希氏菌屬（Escherichia)(大腸桿菌巧scherichia coli) 等）、屬芽抱桿菌屬炬acillus)(枯草芽抱桿菌炬acillus subtilis)等）、酵母（釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)等）、昆蟲細(xì)胞（源自甘藍(lán)夜蛾（Mamestra brassicae)的幼 蟲的建立的細(xì)胞系（草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda)細(xì)胞；Sfcell)等）、昆蟲（家 蠶炬ombyx mori)的幼蟲等）、哺乳動(dòng)物細(xì)胞（大鼠神經(jīng)細(xì)胞，猴細(xì)胞（C0S-7等）、中國倉 鼠細(xì)胞（CH0細(xì)胞等）等）等。
[0091] 哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括，但不限于，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，諸如曬齒類動(dòng)物，諸如小鼠、大鼠、倉 鼠和豚鼠等，兔等，家畜動(dòng)物諸如豬、牛、山羊、馬、綿羊、貂等，伴侶動(dòng)物，諸如狗、貓等，靈長(zhǎng) 類動(dòng)物諸如人、猴、食蟹猴（Macacafasci州laris)、恒河猴（Macacamulatta)、滅猴、猩猩、 黑猩猩等，等。
[0092] 質(zhì)粒載體的實(shí)例包括源自大腸桿菌的質(zhì)粒載體（例如，PBR322、PBR325、PUC12、 pUC13)，源自枯草芽抱桿菌的質(zhì)粒載體（例如，pUB110、pTP5、pC194)，源自酵母的質(zhì)粒載體 (例如，P甜19、p甜15)等，其可W根據(jù)待使用的宿主種類和使用對(duì)象適當(dāng)?shù)剡x擇。
[0093] 病毒載體的種類可W根據(jù)待使用的宿主種類和使用對(duì)象適當(dāng)?shù)剡x擇。例如，當(dāng)昆 蟲細(xì)胞被用作宿主時(shí)，可W使用桿狀病毒載體等。當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞被用作宿主時(shí)，可W使用 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，諸如莫洛尼鼠白血病病毒載體、慢病毒載體、辛德畢斯病毒載體等、腺病 毒載體、瘡疹病毒載體、腺伴隨病毒載體、細(xì)小病毒載體、痘苗病毒載體、仙臺(tái)病毒載體等。
[0094]啟動(dòng)子可W根據(jù)待使用的宿主種類進(jìn)行選擇，并且可W選擇能夠在宿主中起始轉(zhuǎn) 錄的啟動(dòng)子。例如，當(dāng)宿主是屬埃希氏菌屬時(shí)，trp啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子等是優(yōu)選 的。當(dāng)宿主是屬芽抱桿菌屬時(shí)，SPOl啟動(dòng)子、SP02啟動(dòng)子、penP啟動(dòng)子等是優(yōu)選的。當(dāng)宿 主是酵母時(shí)，P冊(cè)5啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子等是優(yōu)選的。當(dāng)宿主是昆蟲細(xì)胞時(shí)，多角體蛋白啟動(dòng) 子、PlO啟動(dòng)子等是優(yōu)選的。當(dāng)宿主是哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，亞基因組（26巧啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng) 子、SRa啟動(dòng)子等是優(yōu)選的。
[0095] 本發(fā)明的載體可W含有用于抗體分泌的信號(hào)序列。作為當(dāng)抗體產(chǎn)生于大腸桿菌的 周質(zhì)中時(shí)抗體分泌的信號(hào)序列，可W使用pelB信號(hào)序列為（Lei,S.P.等人J.Bacteriol. (1987) 169，4379)。
[0096]當(dāng)期望時(shí)，本發(fā)明的載體可W各自W可操作方式含有增強(qiáng)子、剪接信號(hào)、多聚腺巧 酸附加信號(hào)、選擇標(biāo)記、SV40復(fù)制原點(diǎn)（W下有時(shí)簡(jiǎn)稱為SV40ori)等。選擇標(biāo)記的實(shí)例包 括二氨葉酸還原酶（W下有時(shí)簡(jiǎn)稱為化化）基因[甲氨蝶嶺（MT幻抗性]、氨予青霉素抗性 基因（有時(shí)簡(jiǎn)稱為Am。、新霉素抗性基因（有時(shí)簡(jiǎn)稱為Ne〇t，G418抗性）等。
[0097] 通過經(jīng)由本身已知的基因轉(zhuǎn)移方法（例如，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磯酸巧法、顯微注射 法、原生質(zhì)體（proplast)融合法、電穿孔法、DEAE葡聚糖法、通過基因槍（GeneGun)的基 因轉(zhuǎn)移法等）將上述本發(fā)明的載體引入上述宿主，可W產(chǎn)生具有引入其中的載體的轉(zhuǎn)化體 (本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體）。當(dāng)表達(dá)載體被用作待引入的載體時(shí)，轉(zhuǎn)化體可W表達(dá)本發(fā)明的抗體。 本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體等。
[009引本發(fā)明的抗體可W通過經(jīng)由本身已知的方法根據(jù)宿主的種類培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化 體，并從培養(yǎng)物中分離本發(fā)明的抗體來制備。當(dāng)宿主是屬埃希氏菌屬時(shí)，將轉(zhuǎn)化體在通常約 15-43C在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基諸如LB培養(yǎng)基、M9培養(yǎng)基等中培養(yǎng)約3-24小時(shí)。當(dāng)宿主是屬芽 抱桿菌屬時(shí)，將轉(zhuǎn)化體在通常約30-4(TC在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)約6-24小時(shí)。當(dāng)宿主是酵 母時(shí)，將轉(zhuǎn)化體在通常約2(TC-35C在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基諸如Bur化older氏培養(yǎng)基等中培養(yǎng)約 24-72小時(shí)。當(dāng)宿主是昆蟲細(xì)胞或昆蟲時(shí)，將轉(zhuǎn)化體在通常約27C在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基諸如用 約10%牛血清添加的Grace氏昆蟲培養(yǎng)基等中培養(yǎng)約3 - 5天。當(dāng)宿主是動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，將轉(zhuǎn) 化體在通常約3(TC-4(rC在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基諸如用約10%牛血清添加的MEM培養(yǎng)基等中培養(yǎng) 約15 - 60小時(shí)。在任何培養(yǎng)中，必要時(shí)可W進(jìn)行通氣和攬拌。
[0099] 至于通過基因工程的抗體生產(chǎn)方法，例如，可W提及Co,M.S.等人，J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976;Better,M.和Horwitz,A.比，MethodsEnzymol. (1989) 178, 476-496;Pluckthun,A.和Skerra,A.,MethodsEnzymol. (1989) 178, 497-515;Lamoyi,E.,MethodsEnzymol. (1986) 121, 652-663;Rousseaux,J.等 人，MethodsEnzymol. (1986) 121, 663-669;Bird,R.E.和Wa化er,B.W.,Trends Biotechnol. (1991) 9，132-137等。
[0100] 從培養(yǎng)物分離和純化本發(fā)明的抗體不W任何方式限制，并且可W采用通常用于抗 體純化的分離和純化方法。例如，抗體可W通過適當(dāng)?shù)剡x擇和組合層析柱、濾器、超濾、鹽 析、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸觸、免疫沉淀、SDS-聚丙帰醜胺凝膠電泳、等電聚焦、透析、重結(jié) 晶等分離和純化。
[0101] 層析的實(shí)例包括親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層 析等(StrategiesforProteinPuri円cationandCharacterization:ALaboratory CourseManual.EdDanielR.Marshak等人，ColdSpringHarborLaboratoryPress, 1996)。該些層析可W通過使用液相層析，例如，液相層析諸如HPLC、FPLC等進(jìn)行。待用于親 和層析的柱的實(shí)例包括蛋白A柱和蛋白G柱。例如，作為使用蛋白A的柱，可W提到Hyper D、P0R0S、Se地aroseFF(由GEAmershamBiosciences制造）等。本發(fā)明還涵蓋通過該些 純化方法高度純化的抗體。
[0102] 此外，本發(fā)明提供了含有上述本發(fā)明的抗體作為有效成分的藥物組合物。本發(fā)明 的藥物組合物也可用于預(yù)防或治療涉及人CD69的過敏性疾病和炎性疾病。目P，本發(fā)明還提 供了用于過敏性疾病或炎性疾病的預(yù)防劑或治療劑，其含有上述抗體作為有效成分。過敏 性疾病的實(shí)例包括，但不限于，過敏性哮喘、過敏性鼻炎、花粉癥、特應(yīng)性皮炎、専麻疹、食物 過敏、過敏性結(jié)膜炎等。炎性疾病的實(shí)例包括，但不限于，慢性阻塞性肺疾?。–OPD)、肺氣 腫、支氣管炎、間質(zhì)性肺炎、肺纖維化、肺水腫、成人呼吸窘迫綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、賊毒 性休克、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、再灌注損傷、慢性腎小球腎炎、內(nèi)毒素休克、骨關(guān)節(jié)炎、多 發(fā)性硬化癥等。上述過敏性疾病或炎性疾病優(yōu)選是呼吸器官（肺、支氣管、氣道等）中的過 敏性疾病或炎性疾病。呼吸器官（肺、支氣管、氣道等）中過敏性疾病的實(shí)例包括，但不限 于，過敏性哮喘等。呼吸器官（肺、支氣管、氣道等）中炎性疾病的實(shí)例包括，但不限于，慢 性阻塞性肺疾?。–OPD)、肺氣腫、支氣管炎、間質(zhì)性肺炎、肺纖維化、肺水腫、成人呼吸窘迫 綜合征等。
[0103]當(dāng)本發(fā)明的抗體被"包含作為有效成分"時(shí)，意指本發(fā)明的抗體被包含作為至少一 種有效成分，并且不限制其含量。本發(fā)明的藥物組合物可W含有其他一種或多種有效成分 連同本發(fā)明的抗體。
[0104]本發(fā)明的抗體可W根據(jù)常規(guī)方法（例如，Remington'SPharmaceuticalScience, 最新版，MarkPublishingCompany,Easton,U.S.A)進(jìn)行配制。此外，女n果需要，它 可W含有藥學(xué)上可接受的載體和/或添加劑。例如，它可W含有表面活性劑（陽G、Tween 等）、賦形劑、抗氧化劑（抗壞血酸等）、著色劑、調(diào)味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑（磯酸鹽、 巧樣酸鹽、其他有機(jī)酸等）、馨合劑（邸TA等）、息浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、 助流劑、矯味劑等。不限于該些，本發(fā)明的藥物組合物可W適當(dāng)?shù)睾衅渌Ｒ?guī)載體。具 體實(shí)例包括輕質(zhì)無水娃酸、乳糖、結(jié)晶纖維素、甘露醇、淀粉、駿甲基纖維素巧、駿甲基纖 維素軸、輕丙基纖維素、輕丙基甲基纖維素、聚己帰己縮酵二己基氨基己酸醋（polyvinyl acetaldieth}daminoacetate)、聚己帰化咯焼麗、明膠、中鏈脂肪酸H甘油醋、聚氧己帰氨 化當(dāng)麻油60、藏糖、駿甲基纖維素、玉米淀粉、無機(jī)鹽等。它也可W含有其他低分子量多膚、 血清白蛋白、明膠和蛋白，諸如免疫球蛋白等，W及氨基酸。當(dāng)配制用于注射的水溶液時(shí)，將 本發(fā)明的抗體溶解于，例如，含有鹽水、葡萄糖或其他助劑的等滲溶液中。助劑的實(shí)例包括 D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、和氯化軸，并且可W與合適的增溶劑，例如醇（己醇等）、 多元醇（丙二醇、PEG等）、非離子表面活性劑（聚山梨醇醋80、肥0-50)等組合使用。
[0105] 在必要時(shí)，也可W將多膚包括在微膠囊（由輕甲基纖維素、明膠、聚[甲基丙帰酸 甲醋]等制成的微膠囊）中，或配制作為膠體藥物遞送系統(tǒng)（脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳 齊U、納米顆粒和納米膠囊等）（參見Remington'SpharmaceuticalScience第16版&, OsloEd. (1980)等）。此外，配制藥物作為緩釋的藥物的方法也是已知的，并且適用于多 膚（Langer等人，J.Biomed.Mater.Res. (1981) 15: 167-277;Langer,Qiem.Tech. (1982) 12: 98-105;美國專利號(hào) 3,773,919;EP-A-58, 481;Sidman等人，Biopolymers (1983) 22: 547-56;EP號(hào)133,988)。此外，也可W通過將透明質(zhì)酸酶添加至本藥劑或與 本藥劑慘合W增加待皮下施用的液體量（例如，WO2004/078140等）。
[0106] 藥物組合物中本發(fā)明的抗體的含量為，例如，整個(gè)藥物組合物的約0.01 - 100 wt%，優(yōu)選 0. 1 - 99. 9wt〇/〇。
[0107] 盡管本發(fā)明的藥物組合物可W口服和腸胃外施用，但其優(yōu)選腸胃外施用。具體地， 通過注射或經(jīng)皮施用將其施用于患者。作為注射的劑型的實(shí)例，可W通過靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi) 注射、皮下注射等全身或局部施用。也可W通過局部注射、特別是肌內(nèi)注射將其施用于治療 部位或其附近。經(jīng)皮施用的劑型的實(shí)例包括軟膏、凝膠、乳膏、膏藥、貼劑等，其可W全身或 局部施用。此外，施用方法可W根據(jù)患者的年齡和癥狀適當(dāng)?shù)剡x擇。劑量可W選自，例如， 作為本發(fā)明的抗體的0.5mg-2.5mg/kg體重的范圍。然而，本發(fā)明的藥物組合物不受該 些劑量的限制。
[0108] 本發(fā)明提供了可用于分析人CD69在過敏性疾病、炎性疾病等中的功能的非人哺 乳動(dòng)物。具體地，本發(fā)明提供了包含用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)移的 化2細(xì)胞的非人哺乳動(dòng)物，其表達(dá)人CD69。
[0109] 非人哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物諸如小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔等，家畜動(dòng)物諸 如豬、牛、山羊、馬、綿羊等，寵物諸如狗、貓等，靈長(zhǎng)類動(dòng)物諸如猴、猩猩、黑猩猩等。非人哺 乳動(dòng)物優(yōu)選為小鼠。
[0110] Th2細(xì)胞來源的CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物的基因型對(duì)于本發(fā)明的非人哺乳動(dòng)物 的動(dòng)物物種可W是免疫學(xué)自身的（即同系的）或免疫學(xué)非自身的（即，同種異體或異種異 體的）。由于轉(zhuǎn)移的Th2細(xì)胞被長(zhǎng)期植入體內(nèi)，所W它優(yōu)選免疫學(xué)自身的。
[0111] 是CD69缺陷的是指其中防止CD69基因本質(zhì)具有的正常功能的足夠操作的狀態(tài)。 其實(shí)例包括CD69基因的表達(dá)完全不存在，表達(dá)水平降低（其中CD69基因本質(zhì)具有的正常 功能不能充分表現(xiàn)），CD69基因產(chǎn)物的功能的完全喪失，和CD69基因產(chǎn)物的功能降低（其 中CD69基因本質(zhì)具有的正常功能不能表現(xiàn)）。
[0112] CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物優(yōu)選是伴隨基因組DNA的修飾的動(dòng)物，即，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物可W是CD69基因缺陷的雜合子，或CD69基因缺陷的純合子，優(yōu)選 CD69基因缺陷的純合子。
[0113] CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物可W通過W下獲得，例如，用誘導(dǎo)CD69基因的同源重組 的祀向載體轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞W制備引入有CD69基因的等位基因之一缺陷的ES細(xì)胞，從獲得的 ES細(xì)胞制備源自其的引入有CD69基因的等位基因之一缺陷的子代動(dòng)物，并且雜交子代動(dòng) 物。對(duì)于CD69缺陷小鼠的產(chǎn)生，可W提及，例如，Murata,K.等人2003.Int.Immunol. 15: 987-992。
[0114] 抗原的類型沒有特別限制，只要其具有對(duì)CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物的抗原性，并 且可W選擇期望的抗原。抗原的實(shí)例包括具有對(duì)CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物的抗原性的蛋 白、膚、脂質(zhì)、糖鏈等。
[0115] CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物可W通過W足W用于免疫CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物的 量注射抗原來用抗原進(jìn)行免疫。例如，W 1- 3周內(nèi)一次的頻率用抗原免疫CD69缺陷的非 人哺乳動(dòng)物，總共2 -6次。對(duì)于免疫，可W將抗原連同佐劑施用于CD69缺陷的非人哺乳動(dòng) 物。盡管佐劑沒有特別限制，只要它可W增強(qiáng)免疫原性，但可W提到，例如，氨氧化鉛、匙孔 誠血藍(lán)蛋白、葡聚糖、BCG、磯酸鉛、TLR配體（例如，脂多糖（LP巧，CpG)等。氨氧化鉛等優(yōu) 選用于有效誘導(dǎo)Th2細(xì)胞。
[0116] 化2細(xì)胞是指通過抗原刺激從幼稚CD4T細(xì)胞分化且主要產(chǎn)生IL-4的CD4T細(xì)胞。
[0117] 化2細(xì)胞可W通過W下獲得，例如，從用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳動(dòng) 物脾臟或外周血中分離CD4T細(xì)胞，并且在抗原、抗原遞呈細(xì)胞、IL-2和IL-4存在的情況下 培養(yǎng)CD4T細(xì)胞。也可W使用固定的抗TCR抗體或抗CD3抗體來替代抗原?？蒞通過組合 使用固定的抗CD28抗體來更有效地誘導(dǎo)Th2細(xì)胞。
[0118] 獲得的細(xì)胞是否是Th2細(xì)胞可W通過用抗原刺激獲得的細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù) 評(píng)價(jià)其相比于IFN-Y是否主要產(chǎn)生IL-4來證實(shí)。
[011引為了實(shí)現(xiàn)在CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物的化2細(xì)胞中人CD69的表達(dá)，通常，用能夠 在非人哺乳動(dòng)物的化2細(xì)胞中表達(dá)人CD69的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物的 Th2細(xì)胞。作為載體，可W提到質(zhì)粒載體、病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。當(dāng)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體時(shí)，可W將轉(zhuǎn)基因容易地整合至染色體中，并且可W穩(wěn)定地持續(xù)人CD69的表達(dá)，甚至 當(dāng)Th2細(xì)胞增殖時(shí)。因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)選用于本發(fā)明中。對(duì)于通過逆轉(zhuǎn)錄病毒基因 轉(zhuǎn)移至化2細(xì)胞中的細(xì)節(jié)，參見，例如，Kimura,M.等人2001.Immunity15: 275-287。
[0120] 化2細(xì)胞中人CD69的表達(dá)可W通過流式細(xì)胞術(shù)使用抗人CD69抗體來證實(shí)。
[0121] 可W將表達(dá)人CD69的用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物的化2細(xì)胞通 過將Th2細(xì)胞靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射至受體非人哺乳動(dòng)物而轉(zhuǎn)移至受體非人哺乳動(dòng)物中。待 轉(zhuǎn)移的Th2細(xì)胞的數(shù)目沒有特別限制，只要在受體非人哺乳動(dòng)物中可W觀察到轉(zhuǎn)移的化2 細(xì)胞對(duì)所述抗原的應(yīng)答反應(yīng)。當(dāng)受體非人哺乳動(dòng)物是小鼠時(shí)，例如，優(yōu)選轉(zhuǎn)移1，〇〇〇,〇〇〇" 3, 000, 000 個(gè)Th2 細(xì)胞。
[0122] 轉(zhuǎn)移的化2細(xì)胞通過用特定抗原刺激而活化，W產(chǎn)生大量IL-4。因此，當(dāng)本發(fā)明的 非人哺乳動(dòng)物暴露于所述抗原時(shí)，由表達(dá)人CD69的Th2細(xì)胞介導(dǎo)的過敏性反應(yīng)和與其相關(guān) 的炎癥反應(yīng)發(fā)生。本發(fā)明還提供了此類非人哺乳動(dòng)物過敏模型。使用本發(fā)明的非人哺乳動(dòng) 物，可W很容易地在體內(nèi)分析人CD69在過敏性反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中的作用。此外，可W在非 人哺乳動(dòng)物中進(jìn)行抗人CD69抗體對(duì)過敏性疾病和炎性疾病的效力評(píng)價(jià)。
[0123] 本說明書中引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利文獻(xiàn)等，單獨(dú)地且明確地通過 引用并入本文，至其全部?jī)?nèi)容已明確地在本文公開的程度。 實(shí)施例
[0124] 本發(fā)明在下面通過參照實(shí)施例更詳細(xì)地進(jìn)行解釋，所述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被解釋為限 制性的。實(shí)施例中的各種基因操作遵循Molecularcloning第H版（ColdSpring化rbor L油.Press, 2001)中描述的方法。
[0125][實(shí)施例1] 杭原巧杭體的產(chǎn)牛 (1)人CD69重組蛋白的產(chǎn)生 由于人CD69經(jīng)由半脫氨酸68形成同源二聚體，所W將編碼含有半脫氨酸68的 胞外區(qū)（氨基酸序列；62-199)的cDNA(NM_001781)插入用于大腸桿菌周質(zhì)表達(dá)的載 體。將預(yù)先制備的大腸桿菌TGlF(-)菌株的感受態(tài)細(xì)胞狂-感受態(tài)大腸桿菌轉(zhuǎn)化緩沖組 (TransformationBufferSet):由ZYMORESEARCH制造）用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，并且在 37°C 在含有氯霉素（終濃度34yg/mL)的LB瓊脂平板上培養(yǎng)過夜。將該大腸桿菌細(xì)胞接種在 2XYT培養(yǎng)基中，并在37 °C培養(yǎng)3-5小時(shí)（00600=0. 5-0. 8)。添加IPTG(終濃度0. 1ml),并 將混合物在25C培養(yǎng)過夜。通過離也收集培養(yǎng)的大腸桿菌細(xì)胞，并用裂解緩沖液（200ml 測(cè)酸鹽，160ml化Cl, 2ml抓TA, 1mg/ml溶菌酶，P服.0)裂解，并離也裂解物W得到可溶 性級(jí)分。從該可溶性級(jí)分，根據(jù)Strep-化Ctin柱（由IBA制造）的標(biāo)準(zhǔn)方法純化人CD69 同源二聚體蛋白。此外，通過SDS-PAGE證實(shí)純化的人CD69重組蛋白的純度不小于95 %，并 且通過使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒（由PIERCE制造）測(cè)定蛋白濃度。
[0126] (2)人CD69重組蛋白的生物素化 根據(jù)EZ-LinkN服-PE〇4-Biotin(ThermoScientific)的標(biāo)準(zhǔn)方案將純化的人CD69重 組蛋白生物素化，并且通過使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒（由PIERCE制造）測(cè)定濃度。
[0127] (3)通過瞻菌體展示方法選擇人CD69特異性抗體克隆 在4C將生物素化的人CD69重組蛋白固定在鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠 值yn油eadsMyOneStreptavidinTl磁珠，由Invitrogen制造，100y1)上 1 小時(shí)，并且 用1mlPBST(含有0.05%Tween20的PB巧洗涂5次。使用用于人抗體瞻菌體文庫的 HuCALGOLD(由Mo^hoSys制造），根據(jù)WO2007/042309、WO2006/122797 等中描述的方 法進(jìn)行抗體選擇。將人CD69-固定的珠添加至該瞻菌體文庫W結(jié)合抗原特異性抗體。將磁 珠回收并洗涂數(shù)次，并將瞻菌體從磁珠洗脫下來。用洗脫的瞻菌體感染大腸桿菌細(xì)胞，并在 37C培養(yǎng)過夜。從瞻菌體感染的大腸桿菌細(xì)胞搔救瞻菌體的操作遵循一般方法（Molecular cloning第H版ColdSpringHarborL油.Press, 2001)。將上述選擇輪次重復(fù)幾次，W 濃縮展示對(duì)于抗原特異性的抗體的瞻菌體。
[0128] (4)通過化ISA篩選抗原特異性抗體 將濃縮操作后獲得的Fab基因的合并物亞克隆到大腸桿菌表達(dá)載體中。根據(jù)WO2006/122797等中描述的方法，表達(dá)F油抗體，并通過化ISA方法篩選抗原特異性抗體。根 據(jù)Strep-化Ctin柱（由IBA制造）的標(biāo)準(zhǔn)方法從大腸桿菌裂解物的可溶性級(jí)分純化F油抗 體。此外，通過SDS-PAGE證實(shí)純化的抗體的純度，并且通過使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒（由 PIERCE制造）測(cè)定濃度。
[0129] (5)通過細(xì)胞染色評(píng)價(jià)篩選抗體克隆 通過人CD69和小鼠CD69過表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞染色進(jìn)一步評(píng)價(jià)純化的化ISA陽性的F油 抗體克隆的抗原反應(yīng)性。作為抗原，使用在使用化eeSt^eMAX試劑（由Invitrogen制 造）通過標(biāo)準(zhǔn)方法用人CD69或小鼠CD69表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后48小時(shí)用4%PFA固定的CHO-S 細(xì)胞。用50yg/ml純化的F油抗體作為用于染色的一抗，將細(xì)胞在室溫下賠育1小時(shí)，并 且用PBS洗涂3次。用500倍稀釋的Alexa555標(biāo)記的抗人IgG(由Invitrogen制造）作為 二抗，將細(xì)胞在室溫下賠育1小時(shí)，并且用PBS洗涂3次。在英光顯微鏡（1X71，由OLYMPUS 制造）下觀察該些細(xì)胞，并且評(píng)價(jià)染色存在與否。作為結(jié)果，證實(shí)160-C76克隆結(jié)合人CD69 化CD69)和小鼠CD69 (mCD69)兩者（圖1)，并且160-(:7和160-C103僅結(jié)合人CD69,并且 最終獲得總共3個(gè)克隆作為特異性結(jié)合細(xì)胞表面上的天然形式人CD69的抗人CD69抗體克 隆。
[0130] (6)抗人CD69抗體克隆的堿基序列的分析 培養(yǎng)獲得的H個(gè)大腸桿菌克隆（160-^、160-c76和160-C103)，并且將質(zhì)粒回收(QIAprepSpin微量制備試劑盒：由QIAGEN制造），并用于堿基序列分析。表1顯示各個(gè)克 隆的CDR(互補(bǔ)決定區(qū)）的氨基酸序列。

【權(quán)利要求】
1. 特異性結(jié)合人CD69的抗體，其具有抑制過敏性炎癥的活性，并且具有與小鼠CD69的 交叉反應(yīng)性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其在包含SEQIDNO:33顯示的氨基酸序列的表位處結(jié)合人 CD69。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中 (1) 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 7中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQID NO:8中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 9、19或20中顯示的氨基酸序列的 ⑶R3,并且所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDN0:10中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQ IDNO: 11中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的⑶R3， 或 (2) 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 7中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQID NO:8中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 9、19或20中顯示的氨基酸序列的 ⑶R3,并且所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQ IDNO: 11中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的⑶R3， 除了在選自SEQIDNO: 7-9、19和20中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取 代、缺失、插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸，和/或 在選自SEQIDNO: 10-12中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插 入和/或添加1至3個(gè)氨基酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的抗體，其中 (1'）所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 23、27或28中顯示的氨基酸序列，并且所述重 鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 24顯示的氨基酸序列。
5. 特異性結(jié)合人CD69的抗體，其具有抑制過敏性炎癥的活性，并在包含SEQIDNO: 59 或78顯示的氨基酸序列的表位處結(jié)合人CD69。
6. 特異性結(jié)合人CD69的抗體，其具有抑制過敏性炎癥的活性，并且包含輕鏈可變區(qū)和 重鏈可變區(qū)，其中 (3) 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 3中顯示的氨基酸序列的⑶R3,并且 所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQIDN0:5中 顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO:6中顯示的氨基酸序列的⑶R3 ; (4) 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 13中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQID NO: 14中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 15中顯示的氨基酸序列的⑶R3,并 且所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 16中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQIDNO: 17 中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 18中顯示的氨基酸序列的⑶R3 ; (5) 所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 3中顯示的氨基酸序列的⑶R3,并且 所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQIDN0:5中 顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDN0:6中顯示的氨基酸序列的⑶R3， 除了在選自SEQIDNO: 1-3中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、 插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸，和/或 在選自SEQIDN0:4-6中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插入 和/或添加1至3個(gè)氨基酸；或 (6)所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 13中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQID NO: 14中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 15中顯示的氨基酸序列的⑶R3,并 且所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQIDNO: 16中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 17 中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 18中顯示的氨基酸序列的⑶R3， 除了在選自SEQIDN0:13-15中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺 失、插入和/或添加1至3個(gè)氨基酸，和/或 在選自SEQIDNO: 16-18中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插 入和/或添加1至3個(gè)氨基酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的抗體，其中 (3'）所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 21中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區(qū) 包含SEQIDNO: 22顯示的氨基酸序列；或 (4'）所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO: 25中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區(qū) 包含SEQIDNO: 26顯示的氨基酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的抗體，其關(guān)于與人CD69的結(jié)合親和力具有不大于 5xl0_8M的KD 值。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的抗體，其是人抗體。
10. 藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的抗體。
11. 用于過敏性疾病或炎性疾病的預(yù)防劑或治療劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一 項(xiàng)的抗體。
12. 多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的抗體。
13. 載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求12的多核苷酸。
14. 轉(zhuǎn)化體，其包含根據(jù)權(quán)利要求13的載體。
15. 非人哺乳動(dòng)物，其包含用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)移的Th2 細(xì)胞，其中所述Th2細(xì)胞表達(dá)人⑶69。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的非人哺乳動(dòng)物，其中所述非人哺乳動(dòng)物是小鼠。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的抗體，其用于預(yù)防或治療過敏性疾病或炎性疾病。
18. 用于哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療過敏性疾病或炎性疾病的方法，其包括將有效量的根 據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的抗體施用于所述哺乳動(dòng)物。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的抗體用于生產(chǎn)預(yù)防或治療過敏性疾病或炎性疾病的 藥劑的用途。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104379741SQ201380021553
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月23日
【發(fā)明者】古城周久, 宮越陽, 加藤靜惠, 對(duì)比地久美子, 速水友紀(jì), 中村美紀(jì)子, 中山俊憲, 巖村千秋 申請(qǐng)人:基因先端領(lǐng)域株式會(huì)社, 國立大學(xué)法人千葉大學(xué)