交叉引用本實(shí)用申請(qǐng)要求2014年9月24日提交的中國(guó)申請(qǐng)201410495440.9的優(yōu)先權(quán)的利益，所述申請(qǐng)以引用方式并入本文。對(duì)以電子方式提交的序列表的引用創(chuàng)建于2015年9月21日、大小為39千字節(jié)的文件名為“nrt_st25.txt”的序列表以計(jì)算機(jī)可讀形式與本說(shuō)明書(shū)同時(shí)提交。該序列表是本說(shuō)明書(shū)的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。本公開(kāi)總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：許多植物的馴化已與產(chǎn)量顯著增加相關(guān)。自然群體中發(fā)生的大多數(shù)表型變異是連續(xù)的并通過(guò)多種基因影響來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)造成馴化植物中產(chǎn)量顯著不同的特定基因的鑒別已成為農(nóng)業(yè)研究的重要焦點(diǎn)。水稻是全世界一半以上人口的主要膳食組成。亞洲栽培稻(水稻，oryzasatival.)包括兩個(gè)主要亞種秈稻和粳稻。同時(shí)提高水稻的產(chǎn)量和最終加工品質(zhì)仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。粳稻廣泛種植于東亞地區(qū)，其在中國(guó)、日本和韓國(guó)因其更好的食用品質(zhì)和低溫下穩(wěn)定的谷粒產(chǎn)量而單獨(dú)占水稻耕種總面積約39％。然而，較低的氮利用率(nue)是粳稻栽培中長(zhǎng)期存在的問(wèn)題，其意味著更高的氮(n)肥投入要求。硝酸鹽和銨是水稻的主要氮源，并且灌溉的水稻中至多40％的全氮攝取作為硝酸鹽吸收，因?yàn)橄趸饔冒l(fā)生在根圍。因此，通過(guò)增大nue來(lái)提高產(chǎn)量是期望的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明公開(kāi)了增強(qiáng)硝酸鹽攝取和根到苗運(yùn)輸并且上調(diào)硝酸鹽應(yīng)答基因表達(dá)的多核苷酸、相關(guān)的多肽和新基因的所有保守性修飾變體、硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的變異、nrt1.1b/osnpf6.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用近等基因或轉(zhuǎn)基因品系的田間試驗(yàn)確認(rèn)，攜帶nrt1.1b-秈稻等位基因的粳稻品種具有顯著提高的谷粒產(chǎn)量和氮利用率(nue)。結(jié)果表明，nrt1.1b的變異有助于秈稻和粳稻之間的硝酸鹽利用趨異度，并且nrt1.1b-秈稻提高了粳稻的nue。一種改善植物農(nóng)學(xué)特性的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)以下項(xiàng)的表達(dá)：(i)編碼包含seqidno:2的氨基酸序列或與一種seqidno:2具有至少95％同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(ii)在嚴(yán)格雜交條件下與包含seqidno:1的多核苷酸雜交的多核苷酸；(iii)編碼包含與seqidno:2具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，并且其中所述多肽在seqidno:2的對(duì)應(yīng)第327位氨基酸處包含氨基酸甲硫氨酸；(iv)編碼與seqidno:2相比包含氨基酸的一個(gè)或多個(gè)缺失或插入或置換的多肽的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼與seqidno:2具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸的表達(dá)通過(guò)用可操作地連接至異源啟動(dòng)子的重組多核苷酸轉(zhuǎn)化植物來(lái)提高。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼與seqidno:2具有至少95％同一性的多肽的內(nèi)源性多核苷酸的表達(dá)通過(guò)上調(diào)與內(nèi)源性多核苷酸可操作地相關(guān)聯(lián)的調(diào)控元件來(lái)提高。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸的表達(dá)通過(guò)在異源調(diào)控元件下表達(dá)多核苷酸來(lái)提高。在一個(gè)實(shí)施方案中，農(nóng)學(xué)特性選自(i)谷粒產(chǎn)量增加，(ii)營(yíng)養(yǎng)攝入增加，(iii)氮利用率增加，(iv)硝酸鹽攝入增加，(v)根到苗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸增加，以及(vi)生物質(zhì)增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，農(nóng)學(xué)性能為生長(zhǎng)和/或生殖階段過(guò)程中植物生物質(zhì)的增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，粒重相對(duì)于不具有表達(dá)提高的多核苷酸的對(duì)照植物增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是單子葉植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是水稻或玉米。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是雙子葉植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是大豆。一種提高植物的產(chǎn)量或氮利用率的方法，所述方法包括提高編碼水稻硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白nrt1.1b的多核苷酸的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼nrt1.1的多核苷酸獲自水稻亞種秈稻。在一個(gè)實(shí)施方案中，氮利用率通過(guò)增加選自以下的表型來(lái)提高：硝酸鹽含量、對(duì)氯酸鹽的敏感性、每株植物的分蘗數(shù)、細(xì)胞數(shù)目、以及葉綠素含量。在一個(gè)實(shí)施方案中，亞種秈稻是品種ir24。一種提高水稻品種日本晴的稻粒產(chǎn)量的方法，所述方法包括通過(guò)用秈稻品種ir24的供體親本育種來(lái)產(chǎn)生日本晴的近等基因系，并且選擇包含供體親本的nrt1.1等位基因的日本晴等基因系，所述供體親本的nrt1.1等位基因由編碼在seqidno:2的第327位處包含氨基酸甲硫氨酸的多肽的多核苷酸表示。一種標(biāo)記輔助選擇產(chǎn)量提高的植物的方法，所述方法包括：a.對(duì)植物進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，所述植物在編碼包含與seqidno:2具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽的基因組區(qū)域中具有一個(gè)或多個(gè)變異，其中所述多肽在對(duì)應(yīng)的第327位氨基酸處包含甲硫氨酸；以及b.鑒定出與不包含所述甲硫氨酸的植物相比產(chǎn)量增加的植物。一種鑒定水稻植物群體中的與增加的谷粒產(chǎn)量相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)等位基因的方法，所述方法包括：a.在水稻植物群體中評(píng)估(i)基因組區(qū)域，所述基因組區(qū)域編碼多肽，或者(ii)控制所述多肽表達(dá)的調(diào)控區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)等位基因變異，其中所述多肽包含seqidno:2的氨基酸序列或與seqidno:2具有95％同一性的序列；b.獲得所述群體中一個(gè)或多個(gè)水稻植株的增加的產(chǎn)量的表型值；c.將所述基因組區(qū)域中的所述等位基因變異與所述表型相關(guān)聯(lián)；以及d.鑒定出與增加的產(chǎn)量相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)等位基因。一種分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸(i)編碼包含一種seqidno:2的氨基酸序列或與一種seqidno:2具有至少95％同一性的氨基酸序列；(ii)在嚴(yán)格雜交條件下與選自seqidno:1的多核苷酸的片段雜交，其中所述片段包含seqidno:1的至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸；(iii)編碼與seqidno:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；(iv)編碼與seqidno:1相比包含氨基酸的一個(gè)或多個(gè)缺失或插入或置換的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼參與氮利用的調(diào)控的多肽。一種重組表達(dá)盒，其中nrt1.1b多核苷酸可操作地連接至異源調(diào)控元件，其中表達(dá)盒在植物細(xì)胞中是有功能的。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物細(xì)胞包含表達(dá)盒。一種包含重組表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物。一種轉(zhuǎn)基因植物部分，所述轉(zhuǎn)基因植物部分包含可操作地調(diào)控多核苷酸表達(dá)的植物調(diào)控元件，所述多核苷酸編碼包含seqidno:2的氨基酸序列或其變體或直系同源物的多肽，其中所述調(diào)控元件對(duì)所述多核苷酸是異源的。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是與seqidno:2具有至少約70％同一性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。一種育種產(chǎn)量提高的水稻植物的方法，所述方法包括：a.在第一水稻植物中檢測(cè)基因組區(qū)域中的基因變異，所述基因組區(qū)域包括編碼包含seqidno:2或其變體的蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中所述基因變異包括在第327位不為蘇氨酸的氨基酸；以及b.使所述第一水稻植物與不包含所述基因變異的第二水稻植物雜交。一種鑒定與玉米植物群體中增加的產(chǎn)量相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)等位基因的方法，所述方法包括：a.在玉米植物群體中評(píng)估(i)編碼多肽的基因組區(qū)域或者(ii)控制所述多肽表達(dá)的調(diào)控區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)基因變異，其中所述多肽包含與seqidno:2具有至少80％同一性的氨基酸序列；b.獲得所述群體中一個(gè)或多個(gè)玉米植株的產(chǎn)量數(shù)據(jù)；c.將所述編碼多肽的基因組區(qū)域中或者所述控制多肽表達(dá)的調(diào)控區(qū)中的所述一個(gè)或基因變異與產(chǎn)量相關(guān)聯(lián)，由此鑒定出與增加的產(chǎn)量相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)等位基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)基因變異處于多核苷酸的編碼區(qū)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)控區(qū)是啟動(dòng)子元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)量是谷粒產(chǎn)量或種子產(chǎn)量。轉(zhuǎn)基因玉米植物在其基因組中包含穩(wěn)定整合的多核苷酸，所述多核苷酸編碼與seqidno:2具有至少95％同一性并在seqidno:2的第327位處包含甲硫氨酸的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸由異源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因玉米植物與不具有所述多肽的對(duì)照玉米植物相比表現(xiàn)出增加的氮利用率。表1序列說(shuō)明本申請(qǐng)隨附并在此引用作為參考的序列說(shuō)明和序列表符合美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)37c.f.r.§1.821-1.825中關(guān)于專(zhuān)利申請(qǐng)中的核苷酸和/或氨基酸序列公開(kāi)的指導(dǎo)規(guī)則。如根據(jù)此處引用作為參考的nucleicacidsres.13:3021-3030(1985)和biochemicalj.219(2):345-373(1984)中描述的iupac-iubmb標(biāo)準(zhǔn)所定義的，在對(duì)序列表的描述中，一個(gè)字母碼表示核苷酸序列符號(hào)，三個(gè)字母碼則表示氨基酸。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式符合37c.f.r.§1.822所示的規(guī)則。seqidno:多核苷酸/多肽名稱(chēng)說(shuō)明seqidno:1多核苷酸osnrt1.1bdna水稻(秈稻)seqidno:2多肽osnrt1.1b蛋白水稻(秈稻)seqidno:3多核苷酸osnrt1.1bdna水稻(粳稻/日本晴)seqidno:4多肽osnrt1.1b蛋白水稻(粳稻/日本晴)seqidno:5多肽chl1蛋白擬南芥在另一個(gè)方面，本公開(kāi)涉及包含所描述的核酸的重組表達(dá)盒。另外，本公開(kāi)涉及含有該重組表達(dá)盒的載體。此外，含有該重組表達(dá)盒的載體可有利于該核酸在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。本公開(kāi)還涉及能夠表達(dá)本公開(kāi)的多核苷酸的宿主細(xì)胞。有多種宿主細(xì)胞可以使用，如但不限于微生物、哺乳動(dòng)物、植物或昆蟲(chóng)細(xì)胞。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及含有本公開(kāi)的核酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。優(yōu)選的含有本公開(kāi)多核苷酸的植物包括但不限于玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、西紅柿和稷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物為玉米植物或植物細(xì)胞。另一個(gè)實(shí)施方案是得自可操作地連接至在植物中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子的本公開(kāi)的轉(zhuǎn)基因硝酸鹽攝取相關(guān)聯(lián)的多肽的轉(zhuǎn)基因種子。本公開(kāi)的植物與對(duì)照植物相比可具有提高的谷粒品質(zhì)。附圖說(shuō)明圖1示出nrt1.1b變異有助于硝酸鹽利用的差異。(a)親本植物即日本晴(nip)、亞洲栽培水稻(oryzasatival.)亞種秈稻ir24水稻品種、以及csssl(ni10-1)的氯酸鹽敏感性測(cè)試。比例尺為2cm。(b)用5mm15n-硝酸鹽標(biāo)記的親本植物和ni10-1的苗中的15n積聚測(cè)定。p值分別由日本晴與ir24、日本晴與ni10-1之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。(c)通過(guò)氯酸鹽敏感性分離體的遺傳連鎖分析精細(xì)作圖。線下方的數(shù)字指示重組體的數(shù)目。(d)nrt1.1b基因結(jié)構(gòu)和日本晴與ir24之間的等位基因變異。(e)日本晴和nil的氯酸鹽敏感性測(cè)試。比例尺為2cm。(f)用5mm15n-硝酸鹽標(biāo)記的日本晴和nil的苗中的15n積聚測(cè)定。p值由日本晴與nil之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。(g)用5mm15n-硝酸鹽標(biāo)記的nrt1.1b-日本晴(nip-2/3/7)或nrt1.1b-ir24(ir-1/3/6)轉(zhuǎn)基因植物(camv35s啟動(dòng)子)、ev1即pcambia2300-camv35s空載體轉(zhuǎn)基因植物的苗中的15n積聚測(cè)定。p值由nrt1.1b-日本晴轉(zhuǎn)基因植物與nrt1.1b-ir24轉(zhuǎn)基因植物之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。b、f和g中的值是平均±sd(n＝4)。圖2示出nrt1.1b的功能特征和組織定位測(cè)定。(a)利用15n-硝酸鹽在注入nrt1.1b-日本晴(nbnip)、nrt1.1b-ir24(nbir)、和chl1的爪蟾卵母細(xì)胞中的硝酸鹽攝入測(cè)定。chl1用作陽(yáng)性對(duì)照。類(lèi)似的結(jié)果另外獲自不同蛙的卵母細(xì)胞。值是平均±sd(n＝10)。p值由nrt1.1b-日本晴注射的卵母細(xì)胞與nrt1.1b-ir24注射的卵母細(xì)胞之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。(b)nrt1.1b的硝酸鹽誘導(dǎo)測(cè)定。kcl用作陰性對(duì)照。值是平均±sd(n＝3)。(c-h)nrt1.1b啟動(dòng)子::gus轉(zhuǎn)基因植物的根(c-e)、葉鞘(f)、葉片(g)和稈(h)的gus染色，在e、g和h中示出橫截面。比例尺：c中為3mm，d中為0.6mm，e中為0.3mm，f-g中為1mm。i和j：用反義探針和有義探針(陰性對(duì)照)在根部段的rna原位雜交。箭頭指出鄰近木質(zhì)部的表皮細(xì)胞和中柱細(xì)胞。比例尺為0.4mm。圖3展示了可影響硝酸鹽攝入、硝酸鹽根到苗的運(yùn)輸和硝酸鹽應(yīng)答基因的表達(dá)的nrt1.1b的變異。(a)用5mm15n-硝酸鹽標(biāo)記的日本晴(nip)和nil的硝酸鹽攝入活性測(cè)定。(b)用5mm15n-硝酸鹽標(biāo)記的日本晴和nil的硝酸鹽根到苗的運(yùn)輸測(cè)定。(c，d)日本晴和nil的苗和根中的osnia1和osnia2的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)分析。轉(zhuǎn)錄物水平用定量rt-pcr測(cè)定。值是平均±sd(a和b中平行測(cè)定4次，c和d中平行測(cè)定3次)。p值由日本晴與nil之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。圖4示出nrt1.1b的系統(tǒng)發(fā)育分析。(a)從950份各種不同的水稻種質(zhì)(4種主要的水稻亞種，即秈稻、粳稻、aus、以及以不同顏色標(biāo)記的中間型)產(chǎn)生的nrt1.1b的系統(tǒng)發(fā)生圖示出秈稻與粳稻之間的趨異度。(b)nrt1.1bsnp1等位基因的祖先狀態(tài)重建。左側(cè)：稻屬中nrt1.1b的系統(tǒng)發(fā)育。右側(cè)：稻屬中nrt1.1b直系同源物的基因型。示出了來(lái)自發(fā)生率為45％或更高的1,000次偽復(fù)制的具有自展值的節(jié)點(diǎn)。(c)秈稻、粳稻和普通野生稻(o.rufipogon)群體中的snp1的單核苷酸多樣性和代表性基因型(seqidno:99-109，分別起始于短舌野稻(o.barthii)并終止于斑點(diǎn)野生稻(o.punctata))。psa為群體特異性等位基因。圖5示出nrt1.1b-秈稻基因滲入提高nue。(a)發(fā)芽后在具有不同硝酸鹽供應(yīng)(400μm、1mm和2mm)的水培溶液中生長(zhǎng)3個(gè)月的日本晴(nip)和nil的宏觀形態(tài)學(xué)。比例尺為20cm。(b)在低氮(ln)或高氮(hn)供應(yīng)下于田間(北京)生長(zhǎng)的日本晴和nil的宏觀形態(tài)學(xué)。比例尺為20cm。(c)在低氮或高氮供應(yīng)下于田間(北京)生長(zhǎng)的日本晴和nil的每個(gè)植株的總谷粒。比例尺為6cm。(d)在北京低氮供應(yīng)下日本晴和nil的每株植物的分蘗數(shù)、每株植物的谷粒產(chǎn)量、每塊樣地的實(shí)際產(chǎn)量和nue。值是平均±sd(對(duì)每株植物的分蘗數(shù)和每株植物的谷粒產(chǎn)量平行測(cè)定30次，對(duì)每塊樣地的實(shí)際產(chǎn)量和nue平行測(cè)定6次)。p值由日本晴與nil之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。將硝酸鹽用作田間栽培的主要氮肥，1kgn/100m2作為低氮條件并且2kgn/100m2作為高氮條件。圖6展示出nrt1.1b-秈稻轉(zhuǎn)基因植物示出比nrt1.1b-粳稻轉(zhuǎn)基因植物高的nue。(a)在低氮供應(yīng)下含有由camv35s啟動(dòng)子控制的nrt1.1b-粳稻(nip-3)或nrt1.1b-秈稻(ir-3)的轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)性狀(每株植物的分蘗數(shù)、每株植物的谷粒產(chǎn)量、每塊樣地的實(shí)際產(chǎn)量和nue)。(b)在低氮供應(yīng)下含有由其天然啟動(dòng)子控制的nrt1.1b-粳稻(gnip-2)或nrt1.1b-秈稻(gir-3)的轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)性狀。值是平均±sd(對(duì)每株植物的分蘗數(shù)和每株植物的谷粒產(chǎn)量平行測(cè)定20次，對(duì)每塊樣地的實(shí)際產(chǎn)量和nue平行測(cè)定6次)。p值由nrt1.1b-粳稻與nrt1.1b-秈稻轉(zhuǎn)基因植物之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。ev1為pcambia2300-camv35s空載體轉(zhuǎn)基因植物。ev2為pcambia2300空載體轉(zhuǎn)基因植物。硝酸鹽用作田間栽培的主要氮肥，1kgn/100m2作為低氮條件。利用其它轉(zhuǎn)基因植物(nip-2和ir-1；gnip-1和gir-4)的田間試驗(yàn)也獲得類(lèi)似結(jié)果。圖7顯示出秈稻品種示出比粳稻品種高的硝酸鹽吸收和氯酸鹽敏感性。(a)用5mm15n-硝酸鹽標(biāo)記的34個(gè)秈稻和粳稻栽培品種的苗中的15n積聚測(cè)定。dw(干重)。(b)用2mm15n-銨標(biāo)記的34個(gè)秈稻和粳稻栽培品種的苗中的15n積聚測(cè)定。dw(干重)。(c)134個(gè)秈稻和粳稻品種之間的氯酸鹽敏感性比較結(jié)果。p值由秈稻和粳稻品種之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。圖8示出nrt1.1b-ir24等位基因是半顯性的并且具有更高硝酸鹽攝入活性。(a)csssl(ni10-1)的圖形化基因型。黑條：來(lái)自日本晴的基因組區(qū)域；紅條：來(lái)自ir24的基因組區(qū)域；(b)從ni10-1×日本晴產(chǎn)生f2代群體的示意圖。(c)在氯酸鹽處理下f2代群體的分離體。比例尺為2cm。(d)在氯酸鹽處理下f2代植株的統(tǒng)計(jì)分析。(e)nil基因型的示意圖。黑條：來(lái)自日本晴的基因組區(qū)域；紅條：來(lái)自ir24的基因組區(qū)域；(f)用5mm15n-硝酸鹽標(biāo)記的日本晴和nil的根中的15n積聚測(cè)定。f中的值是平均±sd(n＝4)。p值由日本晴與nil之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。圖9示出轉(zhuǎn)基因植物和nil中nrt1.1b的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)分析。(a)選擇具有類(lèi)似的nrt1.1b轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平的含有由camv35s啟動(dòng)子控制的nrt1.1b-日本晴(nip-2/3/7)或nrt1.1b-ir24(ir-1/3/6)的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行進(jìn)一步研究。(b)選擇具有類(lèi)似的nrt1.1b轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平的含有由其天然啟動(dòng)子控制的nrt1.1b-日本晴(gnip-1/2)或nrt1.1b-ir24(gir-3/4)的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行進(jìn)一步研究。(c)用5mm15n-硝酸鹽標(biāo)記的nrt1.1b-日本晴(gnip-1/2)或nrt1.1b-ir24(gir-3/4)轉(zhuǎn)基因植物的苗中的15n積聚分析。a-c中的p值由nrt1.1b-日本晴轉(zhuǎn)基因植物與nrt1.1b-ir24轉(zhuǎn)基因植物之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。(d)日本晴(nip)、nil和ir24中nrt1.1b的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)測(cè)定。轉(zhuǎn)錄物水平由定量rt-pcr(qrt-pcr)測(cè)定。d中的p值由日本晴與nil之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。值是平均±sd(對(duì)qrt-pcr平行測(cè)定3次，對(duì)15n測(cè)定平行測(cè)定4次)。ev1為pcambia2300-camv35s空載體轉(zhuǎn)基因植物。ev2為pcambia2300空載體轉(zhuǎn)基因植物。圖10示出nrt1.1b為chl1的推定同系物。(a)基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk)的預(yù)測(cè)的nrt1.1b的跨膜形貌的示意性圖。黃色圓柱體和黑色連接線分別表示跨膜區(qū)和親水區(qū)。星號(hào)指示日本晴與ir24之間的氨基酸突變位點(diǎn)。(b)通過(guò)clustalx比對(duì)示出與nrt1.1b相關(guān)性的功能性識(shí)別的植物ptr蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。(c)nrt1.1b與chl1的比對(duì)。暗色字母指示相同/高度保守的氨基酸殘基或高度相似的氨基酸殘基的嵌段。圖11示出水稻原生質(zhì)體中nrt1.1b-日本晴(nbnip)和nrt1.1b-ir24(nbir)的亞細(xì)胞定位。左側(cè)：egfp(綠色)熒光的圖像；中間：egfp(綠色)熒光和葉綠素(紅色)熒光的重疊圖像；右側(cè)：明視場(chǎng)圖像。將p35s-egfp用作對(duì)照。比例尺為10μm。圖12示出nrt1.1b突變體的鑒定和功能表征。(a)在內(nèi)含子中攜帶t-dna插入的nrt1.1b突變體(zhonghua11(zh11)背景，粳稻品種)的示意圖。黑白框分別表示編碼區(qū)和非翻譯區(qū)(utr)。三角形表示t-dna插入。f1和r1表示nrt1.1b的引物，并且r2表示t-dna的引物。lb和rb分別表示t-dna的左邊界和右邊界。(b)野生型zh11和nrt1.1b突變體中nrt1.1b(f1+r1)和旁側(cè)序列(f1+r2)的片段的pcr擴(kuò)增。所用引物列出于表2中。(c)zh11和nrt1.1b突變體中的nrt1.1b轉(zhuǎn)錄水平的rt-pcr分析。將水稻actin1用作內(nèi)參。所用引物列出于表2中。(d)用200μm或5mm15n-硝酸鹽標(biāo)記的zh11和nrt1.1b突變體的苗和根中的15n積聚測(cè)定。dw(干重)。(e)具有200μm或5mm15n-硝酸鹽的zh11和nrt1.1b突變體的硝酸鹽攝入活性測(cè)定。(f)具有200μm或5mm15n-硝酸鹽的zh11和nrt1.1b突變體的硝酸鹽根到苗運(yùn)輸測(cè)定。d-f中的值是平均±sd(n＝4)。p值由zh11和nrt1.1b突變體之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。圖13示出nrt1.1b參與調(diào)控硝酸鹽應(yīng)答基因的表達(dá)。(a)zh11和nrt1.1b突變體中osnia1、osnia2、osnrt2.1、osnrt2.2、osnrt2.3a和osnrt1.5a的硝酸鹽誘導(dǎo)測(cè)定。y-軸指出硝酸鹽(5mm)誘導(dǎo)2小時(shí)的轉(zhuǎn)錄物增加的倍數(shù)(b)日本晴(nip)和nil中osnrt2.1、osnrt2.2、osnrt2.3a和osnrt1.5a的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)分析。轉(zhuǎn)錄物水平由qrt-pcr測(cè)定。值是平均±sd(n＝3)。p值由zh11與nrt1.1b突變體(a)、日本晴與nil(b)之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。所用引物列出于表2中。圖14示出nrt1.1b在秈稻和粳稻亞種之間分歧并且在秈稻中進(jìn)行人工選擇。(a)單核苷酸多樣性(snd)測(cè)定顯示出nrt1.1b的cds區(qū)域中的兩種群體特異性等位基因(psa)。經(jīng)由定制的perl腳本對(duì)22kb序列集計(jì)算snd。(b)秈稻和粳稻中nrt1.1b的snp分析。t(藍(lán)色)或c(綠色)指出核苷酸置換，從而導(dǎo)致錯(cuò)義突變。(c)nrt1.1b基因周?chē)倪x擇性掃描信號(hào)(中心位于nrt1.1b的22kb區(qū)域)。y-軸指示π值。(d)nrt1.1b的連鎖不平衡(ld)分析。y-軸指示ld統(tǒng)計(jì)的ωmax值。水平紅線代表ld統(tǒng)計(jì)的全基因組臨界值(fdr≤0.05)。nrt1.1b的基因模型縮放為序列坐標(biāo)，c和d中的白框和藍(lán)框分別表示非翻譯區(qū)和編碼區(qū)，并且黑線表示內(nèi)含子區(qū)域。(e)中心位于nrt1.1b的22kb區(qū)域中的核苷酸多樣性(π)的多重比較結(jié)果。序列被分為3個(gè)區(qū)域。區(qū)域1為6kb下游序列，區(qū)域2為中心位于nrt1.1b的10kb序列，并且區(qū)域3為6kb上游序列，它們分別由b中x軸下方的黃色、紅色和綠色條表示。后附不同字母(a和b)的每行內(nèi)平均π值彼此顯著不同(方法示于表中，α＝0.05)。圖15示出日本晴(nip)和nil的實(shí)際樣地產(chǎn)量(a)和nue(b)，將尿素作為田間的氮肥。田間試驗(yàn)在北京于不同氮水平下進(jìn)行，將尿素作為唯一的氮肥(2014)。植株之間的間距為20cm，并且出產(chǎn)的樣地尺寸為4m2。值是平均±sd(n＝6)。p值由日本晴與nil之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。圖16示出在水培下nil的葉綠素含量(a)、光合速率(b)、以及生物質(zhì)(c)相對(duì)于日本晴(nip)增加。使用在不同硝酸鹽供應(yīng)水平(400μm、1mm和2mm)下于水培中生長(zhǎng)3個(gè)月的水稻植物來(lái)研究這些性狀。值是平均±sd(n＝10)。p值由日本晴與nil之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。圖17示出低氮供應(yīng)(ln)下日本晴(nip)和nil的農(nóng)學(xué)性狀(每株植物的分蘗數(shù)、每株植物的谷粒產(chǎn)量、每塊樣地的實(shí)際產(chǎn)量和nue)的田間試驗(yàn)。(a)在上海低氮供應(yīng)(1kgn/100m2)下田間試驗(yàn)中日本晴和nil的農(nóng)學(xué)性狀。(b)在湖南省長(zhǎng)沙市低氮供應(yīng)(0.6kgn/100m2)下田間試驗(yàn)中日本晴和nil的農(nóng)學(xué)性狀。值是平均±sd(對(duì)每株植物的分蘗數(shù)和每株植物的谷粒產(chǎn)量平行測(cè)定30次，并且對(duì)每塊樣地的實(shí)際產(chǎn)量和nue平行測(cè)定6次)。p值由日本晴與nil之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。將硝酸鹽用作田間栽培的主要氮肥。圖18示出在高氮供應(yīng)(hn)下田間生長(zhǎng)的日本晴(nip)和nil的農(nóng)學(xué)性狀。在北京(a)、上海(b)和長(zhǎng)沙(c)，采用hn供應(yīng)在田間生長(zhǎng)的日本晴和nil的每株植物的分蘗數(shù)、每株植物的谷粒產(chǎn)量、每塊樣地的實(shí)際產(chǎn)量和nue。值是平均±sd(對(duì)每株植物的分蘗數(shù)和每株植物的谷粒產(chǎn)量平行測(cè)定30次，對(duì)每塊樣地的實(shí)際產(chǎn)量和nue平行測(cè)定6次)。p值由日本晴與nil之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。將硝酸鹽用作主要氮肥，2kgn/100m2作為高氮條件。圖19示出高氮供應(yīng)下nrt1.1b-秈稻/粳稻轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)性狀(每株植物的分蘗數(shù)、每株植物的谷粒產(chǎn)量、每塊樣地的實(shí)際產(chǎn)量和nue)的田間試驗(yàn)。(a)在高氮供應(yīng)下含有由camv35s啟動(dòng)子控制的nrt1.1b-粳稻(nip-3)或nrt1.1b-秈稻(ir-3)的轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)性狀。(b)在高氮供應(yīng)下含有由天然啟動(dòng)子控制的nrt1.1b-粳稻(gnip-2)或nrt1.1b-秈稻(gir-3)的轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)性狀。值是平均±sd(對(duì)每株植物的分蘗數(shù)和每株植物的谷粒產(chǎn)量平行測(cè)定20次，對(duì)每塊樣地的實(shí)際產(chǎn)量和nue平行測(cè)定6次)。p值由nrt1.1b-粳稻與nrt1.1b-秈稻轉(zhuǎn)基因植物之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。ev1為pcambia2300-camv35s空載體轉(zhuǎn)基因植物。ev2為pcambia2300空載體轉(zhuǎn)基因植物。將硝酸鹽用作主要氮肥，2kgn/100m2作為高氮條件。圖20示出kongyu131和xiushui134以及對(duì)應(yīng)的csssl的氯酸鹽敏感性和硝酸鹽吸收測(cè)定。(a)kongyu131和csssl-ki(nil作為供體親本并且kongyu131作為輪回親本，bc4f2)的氯酸鹽敏感性測(cè)定。比例尺為2cm。(b)xiushui134和csssl-xi(nil作為供體親本并且xiushui134作為輪回親本，bc4f2)的氯酸鹽敏感性測(cè)定。比例尺為3cm。(c)用5mm15n-硝酸鹽標(biāo)記的kongyu131和csssl-ki的苗中的15n積聚測(cè)定。(d)用5mm15n-硝酸鹽標(biāo)記的xiushui134和csssl-xi的苗中的15n積聚測(cè)定。dw(干重)。值是平均±sd(n＝4)。p值由受體親本和對(duì)應(yīng)的csssl之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。具體實(shí)施方式谷粒產(chǎn)量的增加是許多作物植物包括例如稻中期望的特征，并且自谷類(lèi)食物被最初馴化以后一直處于選擇之中。一種產(chǎn)生種子的方法，所述方法包括：(a)將第一植物與第二植物雜交，其中第一植物和第二植物中的至少一者包含重組dna構(gòu)建體，其中重組dna構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一種異源調(diào)控元件的多核苷酸，其中基于clustalv或clustalw比對(duì)方法利用相應(yīng)的默認(rèn)參數(shù)，多核苷酸編碼具有與seqidno:2相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽；以及(b)選擇步驟(a)的雜交的種子，其中所述種子包含重組dna構(gòu)建體。當(dāng)與不包含重組dna構(gòu)建體的對(duì)照植物相比時(shí)，從種子生長(zhǎng)的植物可表現(xiàn)出選自以下的至少一種性狀：增加的非生物脅迫耐受性、增加的產(chǎn)量、增加的氮攝入、增加的營(yíng)養(yǎng)攝入、增加的生物質(zhì)、以及改變的根構(gòu)造。多肽能夠在至少一種植物組織中，或者在非生物脅迫的至少一種條件期間，或者這兩者中過(guò)表達(dá)。植物可選自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、粟、甘蔗和柳枝稷。一種產(chǎn)生植物的方法，所述植物表現(xiàn)出選自以下的至少一種性狀的增加：增加的非生物脅迫耐受性、增加的氮攝入、增加的營(yíng)養(yǎng)攝入、增加的產(chǎn)量、增加的生物質(zhì)、以及改變的根構(gòu)造，其中所述方法包括從包含重組dna構(gòu)建體的種子生長(zhǎng)植物，其中重組dna構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一種異源調(diào)控元件的多核苷酸，其中基于clustalv或clustalw比對(duì)方法利用相應(yīng)的默認(rèn)參數(shù)，該多核苷酸編碼具有與seqidno:2相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中當(dāng)與不包含重組dna構(gòu)建體的對(duì)照植物相比時(shí)，所述植物表現(xiàn)出選自以下的至少一種性狀：增加的氮脅迫耐受性、增加的產(chǎn)量、增加的生物質(zhì)、以及改變的根構(gòu)造。在一個(gè)實(shí)施方案中，nrt1.1b多肽在如參考seqidno:2的對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處包含氨基酸變異，其中在seqidno:2的第327位處，氨基酸不為蘇氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，第327位處的蘇氨酸被甲硫氨酸替代。osnrt1.1b(秈稻)多肽可在至少一種植物組織中，或者在非生物脅迫的至少一種條件期間，或者這兩者中過(guò)表達(dá)。植物可選自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、粟、甘蔗和柳枝稷。除非另外指明，否則本公開(kāi)的實(shí)踐將采用植物學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)和重組dna技術(shù)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)處于本領(lǐng)域技能范圍內(nèi)。這類(lèi)技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整的解釋。參見(jiàn)例如langenheim和thimann，(1982)botany:plantbiologyanditsrelationtohumanaffairs,johnwiley；cellcultureandsomaticcellgeneticsofplants，第1卷，vasil編輯，(1984)；stanier等人，(1986)themicrobialworld，第5版，prentice-hall；dhringra和sinclair，(1985)basicplantpathologymethods，crcpress；maniatis等人，(1982)molecularcloning:alaboratorymanual；dnacloning，第i卷和第ii卷，glover編輯，(1985)；oligonucleotidesynthesis，gait編輯，(1984)；nucleicacidhybridization，hames和higgins編輯，(1984)和叢書(shū)methodsinenzymology，colowick和kaplan編輯，academicpress,inc.，sandiego，ca。所謂“擴(kuò)增”意指構(gòu)建核酸序列的多個(gè)拷貝或與該核酸序列互補(bǔ)的多個(gè)拷貝，該構(gòu)建是利用所述核酸序列中的至少一者作為模板進(jìn)行。擴(kuò)增系統(tǒng)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)系統(tǒng)、連接酶鏈反應(yīng)(lcr)系統(tǒng)、基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba,cangene,mississauga,ontario)、q-β復(fù)制酶系統(tǒng)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(tas)和鏈置換擴(kuò)增(sda)。參見(jiàn)例如diagnosticmolecularmicrobiology:principlesandapplications，persing等人編輯，americansocietyformicrobiology，washington，dc(1993)。擴(kuò)增的產(chǎn)物稱(chēng)為擴(kuò)增子。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)知道，本公開(kāi)不僅僅涵蓋特定的示例性序列。在給定位點(diǎn)產(chǎn)生化學(xué)等同的氨基酸，但不影響所編碼多肽的功能特性的核酸片段變化是本領(lǐng)域熟知的。例如，疏水氨基酸丙氨酸的密碼子可被編碼另一個(gè)疏水性較小的殘基例如甘氨酸，或疏水性較大的殘基例如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的密碼子置換。類(lèi)似地，還可預(yù)期一個(gè)帶負(fù)電的殘基置換為另一個(gè)，例如天冬氨酸置換為谷氨酸，或一個(gè)帶正電的殘基置換為另一個(gè)，例如賴(lài)氨酸置換為精氨酸的變化產(chǎn)生功能等同的產(chǎn)物。還可預(yù)期使多肽分子的n-端和c-端部分改變的核苷酸變化不會(huì)改變多肽的活性。每個(gè)所推薦的改變均在本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)內(nèi)，正如確定所編碼產(chǎn)物的生物活性的保留。本文所公開(kāi)的蛋白質(zhì)也可以是包含這樣氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列包含選自seqidno:2或其變體的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、置換、插入和/或添加。置換可以是保守的，意指某氨基酸殘基被另一個(gè)具有類(lèi)似物理和化學(xué)特性的殘基替代。保守置換的非限制性示例包括含脂族基團(tuán)的氨基酸殘基例如ile、val、leu或ala之間的替代，以及極性殘基之間的替代，例如lys-arg、glu-asp或gln-asn替代。來(lái)源于氨基酸缺失、置換、插入和/或添加的蛋白質(zhì)可在編碼其野生型蛋白質(zhì)的dna受到例如熟知的定點(diǎn)誘變時(shí)制備(參見(jiàn)例如nucleicacidresearch，第10卷，第20期，第6487-6500頁(yè)，1982年，該文獻(xiàn)全文據(jù)此以引用方式并入)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)氨基酸”旨在意指可通過(guò)定點(diǎn)誘變?nèi)笔?、置換、插入和/或添加的氨基酸的可能數(shù)量。定點(diǎn)誘變可以例如如下使用與待突變的單鏈?zhǔn)删wdna互補(bǔ)，不同的是具有特定錯(cuò)配(即，所需突變)的合成寡核苷酸引物實(shí)現(xiàn)。也就是說(shuō)，上述合成寡核苷酸用作引起互補(bǔ)鏈通過(guò)噬菌體合成的引物，然后所得的雙鏈dna用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化細(xì)菌培養(yǎng)物置于瓊脂上，從而允許噬菌斑從含噬菌體的單個(gè)細(xì)胞形成。因此，理論上，50％的新菌落包含突變?yōu)閱捂湹氖删w，而其余50％具有原始序列。在允許與具有上述所需突變的dna完全相同的dna雜交，但不與具有原始鏈的dna雜交的溫度下，允許所得的噬菌斑與通過(guò)激酶處理標(biāo)記的合成探針雜交。隨后，拾取與探針雜交的噬菌斑并培養(yǎng)以收集其dna。允許生物活性肽例如酶的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、插入和/或添加，同時(shí)保持其活性的技術(shù)包括上述定點(diǎn)誘變，以及其它技術(shù)，例如用誘變劑處理基因的那些，以及其中基因選擇性裂解以移除、置換、插入或添加所選的一個(gè)或多個(gè)核苷酸然后連接的那些。本文所公開(kāi)的蛋白質(zhì)也可以是由包含這樣的核苷酸序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)，該核苷酸序列包含選自編碼seqidno:1的序列的核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、置換、插入和/或添加。核苷酸缺失、置換、插入和/或添加可通過(guò)定點(diǎn)誘變或上述其它技術(shù)實(shí)現(xiàn)。本文所公開(kāi)的蛋白質(zhì)也可以是由包含這樣的核苷酸序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)，該核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與選自編碼seqidno:1的序列的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈雜交。術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下”意指兩個(gè)序列在中等或高度嚴(yán)格條件下雜交。更具體地講，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以例如根據(jù)dna的長(zhǎng)度輕松地確定中等嚴(yán)格條件。基本條件在sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual，第三版，第6和7章，coldspringharborlaboratorypress，2001中示出，并且包括使用硝化纖維素濾器的預(yù)洗滌溶液5xssc、0.5％sds、1.0mmedta(ph8.0)，約50％甲酰胺、2xssc至6xssc、約40-50℃的雜交條件(或其它類(lèi)似雜交溶液，例如stark溶液，約50％甲酰胺、約42℃)以及例如約40-60℃、0.5-6xssc、0.1％sds的洗滌條件。優(yōu)選地，中等嚴(yán)格條件包括在約50℃和6xssc下雜交(和洗滌)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可以例如根據(jù)dna的長(zhǎng)度輕松地確定高度嚴(yán)格條件。一般來(lái)講，此類(lèi)條件包括與中等嚴(yán)格條件相比，在較高溫度和/或較低鹽濃度下雜交和/或洗滌(例如在約65℃，6xssc至0.2xssc，優(yōu)選地6xssc，更優(yōu)選地2xssc，最優(yōu)選地0.2xssc下雜交)。例如，高度嚴(yán)格條件可包括如上所定義的雜交，并且在大約65-68℃、0.2xssc、0.1％sds下洗滌。在雜交和洗滌緩沖液中sspe(1xsspe為0.15mnacl、10mmnah2po4和1.25mmedta，ph7.4)可代替ssc(1xssc為0.15mnacl和15mm檸檬酸鈉)；在雜交完成后進(jìn)行洗滌15分鐘。使用商購(gòu)獲得的雜交試劑盒也是可能的，其不使用放射性物質(zhì)作為探針。具體示例包括用ecl直接標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)雜交。嚴(yán)格條件包括例如使用包括在試劑盒中的雜交緩沖液在42℃下雜交4小時(shí)，該緩沖液補(bǔ)充有5％(w/v)阻斷試劑和0.5mnacl，并且在0.4％sds、0.5xssc中55℃下洗滌20分鐘兩次，在2xssc中室溫下洗滌5分鐘一次。就特定核酸而言，所謂“編碼”意指包含翻譯成特定蛋白的信息。編碼蛋白質(zhì)的核酸可以包含在所述核酸的翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列(例如內(nèi)含子)或可以缺少這種居間的非翻譯序列(例如，如在cdna中)。據(jù)以編碼蛋白質(zhì)的信息是通過(guò)使用密碼子來(lái)確定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遺傳密碼來(lái)編碼。然而，當(dāng)使用這些生物體表達(dá)核酸時(shí)，可使用如在某些植物、動(dòng)物和真菌線粒體、細(xì)菌山羊支原體(mycoplasmacapricolum)(yamao等人，(1985)proc.natl.acad.sci.usa82:2306-9)或纖毛蟲(chóng)大核(ciliatemacronucleus)中存在的通用密碼的變體。當(dāng)通過(guò)合成法制備或改變核酸時(shí)，可利用將在其中表達(dá)核酸的預(yù)期宿主的已知密碼子偏好性。例如，盡管本公開(kāi)的核酸序列在單子葉植物物種和雙子葉植物物種兩者中都可表達(dá)，但可對(duì)序列進(jìn)行修飾以解決單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好性和gc含量偏好性，因?yàn)檫@些偏好性已被證實(shí)不同(murray等人，(1989)nucleicacidsres.17:477-98)，其以引用方式并入本文)。因而，具體氨基酸的玉米偏好密碼子可由來(lái)自玉米的已知基因序列得出。關(guān)于來(lái)自玉米植物的28種基因的玉米密碼子的用法在murray等人(出處同上)的表4中列出。如本文所用，針對(duì)核酸的“異源”為起源于外來(lái)物種的核酸，或者，如果起源于相同物種的話，則為通過(guò)蓄意的人為干預(yù)對(duì)其天然形式在組成和/或基因座方面進(jìn)行了實(shí)質(zhì)性修飾的核酸。異源還可指示特定核酸與其基因組中的天然位置相比對(duì)其在基因組中的位置是外來(lái)的。例如，可操作地連接至異源結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子是來(lái)自不同于衍生該結(jié)構(gòu)基因的物種的物種，或者如果是來(lái)自相同的物種，則對(duì)一者或二者對(duì)其初始形式進(jìn)行了實(shí)質(zhì)性的修飾。異源蛋白質(zhì)可起源于外來(lái)物種，或者，如果起源于相同物種，則通過(guò)蓄意的人為干預(yù)對(duì)其天然形式進(jìn)行了實(shí)質(zhì)性的修飾。所謂“宿主細(xì)胞”意指包含本公開(kāi)的異源核酸序列、含有載體并能支持該表達(dá)載體的復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌(e.coli)，或真核細(xì)胞如酵母、昆蟲(chóng)、植物、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞或雙子葉植物細(xì)胞，包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麥、苜蓿、水稻、棉花、卡諾拉、大麥、小米和番茄。特別優(yōu)選的單子葉宿主細(xì)胞是玉米宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“雜交復(fù)合體”包括指涉由兩條相互選擇性雜交的單鏈核酸序列形成的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)。在將核酸插入細(xì)胞中的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入”意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并包括指涉將核酸摻入真核或原核細(xì)胞中，其中該核酸可摻入細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體dna)中，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mrna)。術(shù)語(yǔ)“分離的”指諸如核酸或蛋白之類(lèi)的物質(zhì)，該物質(zhì)實(shí)質(zhì)上或基本上不含在其天然存在的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的通常與其相伴隨或與其相互作用的組分。分離的物質(zhì)任選包含未發(fā)現(xiàn)在其天然環(huán)境中與其一起的物質(zhì)。本文所定義的“分離的”核酸也稱(chēng)為“異源”核酸。除非另有規(guī)定，否則術(shù)語(yǔ)“硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的核酸”意指包含編碼完全長(zhǎng)度或部分長(zhǎng)度硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多肽的多核苷酸(“硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多核苷酸”)的核酸。如本文所用，“核酸”包括指涉單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否則涵蓋在以下方面具有天然核苷酸的基本性質(zhì)的已知類(lèi)似物：其以與天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式雜交至單鏈核酸。所謂“核酸文庫(kù)”意指分離的dna或rna分子的集合，其包含且基本上代表特定生物體的基因組的整個(gè)被轉(zhuǎn)錄的部分。示例性核酸文庫(kù)諸如基因組文庫(kù)和cdna文庫(kù)的構(gòu)建，在諸如以下的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)參考文獻(xiàn)中有教導(dǎo)：berger和kimmel，(1987)guidetomolecularcloningtechniques，來(lái)自叢書(shū)methodsinenzymology，第152卷，academicpress，inc.，sandiego，ca；sambrook等人，(1989)，molecularcloning:alaboratorymanual，第2版，第1-3卷；以及currentprotocolsinmolecularbiology,ausubel等人編輯，currentprotocols,greenepublishingassociates,inc.和johnwiley&sons,inc.之間合作(1994年補(bǔ)編)。本文所用的“可操作地連接”包括指涉第一序列(諸如啟動(dòng)子)與第二序列之間的功能性連接，其中該啟動(dòng)子序列引發(fā)和介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于該第二序列的dna的轉(zhuǎn)錄。一般來(lái)講，可操作地連接意指被連接的核酸序列是連續(xù)的，并且如果有必要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)的話，是連續(xù)的且在相同的閱讀框內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“植物”包括指涉整個(gè)植物、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子和植物細(xì)胞和它們的子代。如本文所用，植物細(xì)胞包括但不限于種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子?？捎糜诒竟_(kāi)方法中的植物種類(lèi)通常與適用于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物種類(lèi)一樣寬泛，包括單子葉植物和雙子葉植物兩者，包括以下屬的物種：南瓜屬(cucurbita)、薔薇屬(rosa)、葡萄屬(vitis)、胡桃屬(juglans)、草莓屬(fragaria)、百脈根屬(lotus)、苜蓿屬(medicago)、驢食草屬(onobrychis)、三葉草屬(trifolium)、胡蘆巴屬(trigonella)、豇豆屬(vigna)、柑桔屬(citrus)、亞麻屬(linum)、老鸛草屬(geranium)、木薯屬(manihot)、胡蘿卜屬(daucus)、擬南芥屬(arabidopsis)、蕓苔屬(brassica)、蘿卜屬(raphanus)、白芥屬(sinapis)、顛茄屬(atropa)、辣椒屬(capsicum)、曼陀羅屬(datura)、天仙子屬(hyoscyamus)、番茄屬(lycopersicon)、煙草屬(nicotiana)、茄屬(茄屬)、碧冬茄屬(petunia)、毛地黃屬(digitalis)、馬珠草屬(majorana)、菊苣屬(ciahorium)、向日葵屬(helianthus)、萵苣屬(lactuca)、雀麥屬(bromus)、天門(mén)冬屬(asparagus)、金魚(yú)草屬(antirrhinum)、萱草屬(heterocallis)、nemesis、天竺葵屬(pelargonium)、黍?qū)?panieum)、狼尾草屬(pennisetum)、毛茛屬(ranunculus)、千里光屬(senecio)、蛾蝶花屬(salpiglossis)、黃瓜屬(cucumis)、布洛華麗屬(browaalia)、大豆屬(glycine)、豌豆屬(pisum)、菜豆屬(phaseolus)、黑麥草屬(lolium)、稻屬(oryza)、燕麥屬(avena)、大麥屬(hordeum)、黑麥屬(secale)、蔥屬(allium)和小麥屬(triticum)。特別優(yōu)選的植物是玉米(zeamays)。如本文所用，“多核苷酸”包括指涉脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其類(lèi)似物，所述類(lèi)似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性質(zhì)：在嚴(yán)格雜交條件下其所雜交的核苷酸序列與天然存在的核苷酸所雜交的核苷酸序列實(shí)質(zhì)上相同，和/或可翻譯成與天然存在的核苷酸所翻譯的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或異源結(jié)構(gòu)基因或調(diào)控基因的全長(zhǎng)序列或其亞序列。除非另外指明，否則該術(shù)語(yǔ)包括指涉特定序列及其互補(bǔ)序列。因而，為了穩(wěn)定性或?yàn)榱似渌驅(qū)χ麈溸M(jìn)行了修飾的dna或rna是如該術(shù)語(yǔ)在本文所意指的“多核苷酸”。此外，包含稀有堿基(如次黃嘌呤核苷)或修飾堿基(如三苯甲基化的堿基)(僅舉兩個(gè)示例)的dna或rna是多核苷酸(如該術(shù)語(yǔ)在本文所用的)。應(yīng)當(dāng)理解，已對(duì)dna和rna進(jìn)行了很多種修飾，這些修飾起到本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多有用目的。本文所用的術(shù)語(yǔ)多核苷酸涵蓋多核苷酸的這類(lèi)經(jīng)化學(xué)修飾、酶修飾或代謝修飾的形式，以及病毒和細(xì)胞(包括特別是簡(jiǎn)單細(xì)胞和復(fù)雜細(xì)胞)特征性的dna和rna的化學(xué)形式。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類(lèi)似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。本文所用的“啟動(dòng)子”包括指涉dna的在轉(zhuǎn)錄起始的上游并涉及rna聚合酶和其它蛋白的識(shí)別和結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的區(qū)域?！爸参飭?dòng)子”是能夠引發(fā)在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。示例性的植物啟動(dòng)子包括但不限于從植物、植物病毒和包含在植物細(xì)胞中表達(dá)的基因的細(xì)菌獲得的那些啟動(dòng)子，所述細(xì)菌諸如農(nóng)桿菌(agrobacterium)或根瘤菌(rhizobium)。示例為優(yōu)先起始在某些組織，例如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞或厚壁組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子稱(chēng)為“組織優(yōu)選的”。“細(xì)胞類(lèi)型”特異性啟動(dòng)子主要驅(qū)動(dòng)在一種或多種器官中的某些細(xì)胞類(lèi)型(例如，根或葉中的維管細(xì)胞)中的表達(dá)?！罢T導(dǎo)型”或“調(diào)控型”啟動(dòng)子是處于環(huán)境控制下的啟動(dòng)子?？蓪?shí)現(xiàn)通過(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的示例包括無(wú)氧條件或光的存在。另一類(lèi)型的啟動(dòng)子是發(fā)育調(diào)控的啟動(dòng)子，例如在花粉發(fā)育過(guò)程中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子。組織偏好的、細(xì)胞類(lèi)型特異性的、發(fā)育調(diào)控的和誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子構(gòu)成了“非組成型”啟動(dòng)子類(lèi)別?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境條件下活躍的啟動(dòng)子。合適的組成型啟動(dòng)子包括例如遍在蛋白啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和gos2啟動(dòng)子(depater等人，(1992)，theplantjournal，2:837–844)。如本文所用，“重組的”包括指涉已通過(guò)導(dǎo)入異源核酸進(jìn)行修飾的細(xì)胞或載體，或者源于經(jīng)這樣修飾過(guò)的細(xì)胞的細(xì)胞。因而，例如，重組細(xì)胞表達(dá)不以天然(非重組)形式的細(xì)胞內(nèi)的相同形式存在的基因，或因?yàn)樾钜馊藶楦深A(yù)而表達(dá)原本異常表達(dá)、表達(dá)不足或根本不表達(dá)的天然基因，或可具有減低的或消除的天然基因表達(dá)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組的”不涵蓋通過(guò)自然發(fā)生事件(例如自發(fā)突變、天然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)進(jìn)行的細(xì)胞或載體的改變，所述事件為例如在沒(méi)有蓄意人為干預(yù)的情況下發(fā)生的那些。如本文所用，“重組表達(dá)盒”是具有一系列特定核酸元件的通過(guò)重組法或合成法產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其允許特定核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。重組表達(dá)盒可摻入質(zhì)粒、染色體、線粒體dna、質(zhì)體dna、病毒或核酸片段中。通常，除了別的序列以外，表達(dá)載體的重組表達(dá)盒部分還包含待轉(zhuǎn)錄的核酸和啟動(dòng)子。如本文所用，“轉(zhuǎn)基因植物”包括指涉植物，在其基因組內(nèi)包含通過(guò)轉(zhuǎn)化過(guò)程獲得的穩(wěn)定整合的異源多核苷酸，其中整合的多核苷酸處于植物中的基因組位置處，在該處異源多核苷酸通常不以其天然狀態(tài)存在。一般來(lái)講，異源多核苷酸穩(wěn)定地整合在基因組內(nèi)使得該多核苷酸得以傳遞到連續(xù)世代。異源多核苷酸可單獨(dú)整合進(jìn)基因組中，或者作為重組表達(dá)盒的一部分整合進(jìn)基因組中。“轉(zhuǎn)基因”在本文中用來(lái)包括其基因型已因異源核酸的存在而被改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初如此改變的轉(zhuǎn)基因以及那些通過(guò)從最初的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行有性雜交或無(wú)性繁殖而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因在內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過(guò)常規(guī)植物育種方法或通過(guò)諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類(lèi)的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)的改變。如本文所用，“載體”包括指涉用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。載體常常是復(fù)制子。表達(dá)載體容許插入其中的核酸的轉(zhuǎn)錄。以下術(shù)語(yǔ)用于說(shuō)明兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系：(a)“參考序列”、(b)“比較窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分比”和(e)“實(shí)質(zhì)同一性”。如本文所用，“參考序列”是用作序列比較基準(zhǔn)的確定的序列。參考序列可以是指定序列的子集或者全部；例如，為全長(zhǎng)cdna或基因序列的片段或完整的cdna或基因序列。如本文所用，“比較窗口”意在包括指涉多核苷酸序列的連續(xù)和指定的區(qū)段，其中該多核苷酸序列可與參考序列比較，并且其中該比較窗口中的該多核苷酸序列的部分相比于參考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。通常，比較窗口長(zhǎng)度為至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸，任選可為30、40、50、100個(gè)或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，為避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的與參考序列的高度相似性，通常引入空位罰分并從匹配數(shù)扣除空位罰分。將核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)以作比較的各種方法是本領(lǐng)域熟知的。局部同源性算法(bestfit)(smith和waterman,(1981)adv.appl.math2:482)可以對(duì)用于比較的序列進(jìn)行最佳比對(duì)；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443-53的同源比對(duì)算法(gap)；相似性搜索方法(tfasta和fasta)(pearson和lipman,(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:2444；這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施包括，但不限于：intelligenetics(加州山景城(mountainview,california))的pc/gene程序中的clustal、wisconsingeneticssoftware第8版(可得自geneticscomputergroup(程序(accelrys公司(加州圣地亞哥(sandiego,ca)))中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta。clustal程序由如下文獻(xiàn)詳細(xì)說(shuō)明：higginsh和sharp，(1988)gene73:237-44；higgins和sharp，(1989)cabios5:151-3；corpet等人，(1988)nucleicacidsres.16:10881-90；huang等人，(1992)computerapplicationsinthebiosciences8:155-65以及pearson等人，(1994)meth.mol.biol.24:307-31。用于多序列的最佳全局比對(duì)的優(yōu)選程序是pileup(feng和doolittle，(1987)j.mol.evol.,25:351-60，其類(lèi)似于higgins和sharp，(1989)cabios5:151-53描述的方法，藉此將其以引用方式并入本文)?？捎糜跀?shù)據(jù)庫(kù)相似性搜索的blast家族程序包括：blastn，用于核苷酸查詢(xún)序列針對(duì)核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行查詢(xún)；blastx，用于核苷酸查詢(xún)序列針對(duì)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行查詢(xún)；blastp，用于蛋白查詢(xún)序列針對(duì)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行查詢(xún)；tblastn，用于蛋白查詢(xún)序列針對(duì)核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行查詢(xún)；以及tblastx，用于核苷酸查詢(xún)序列針對(duì)核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行查詢(xún)。參見(jiàn)currentprotocolsinmolecularbiology19章，ausubel等人編輯，greenepublishingandwiley-interscience,newyork(1995)。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解的，blast搜索假定蛋白可以隨機(jī)序列建模。然而，許多真實(shí)蛋白包含非隨機(jī)序列區(qū)，該非隨機(jī)序列可為同聚段、短周期重復(fù)或富含一種或多種氨基酸的區(qū)域。這種低復(fù)雜性區(qū)域可在不相關(guān)的蛋白質(zhì)之間比對(duì)，盡管該蛋白質(zhì)的其它區(qū)域完全不相似?？刹捎枚喾N低復(fù)雜性過(guò)濾程序來(lái)減少這種低復(fù)雜性比對(duì)。例如，可單獨(dú)使用或聯(lián)合使用seg(wooten和federhen，(1993)，comput.chem.17:149-63)和xnu(claverie和states,(1993)comput.chem.17:191-201)低復(fù)雜性過(guò)濾程序。在兩條核酸或多肽序列的情形中，如本文所用的“序列同一性”或“同一性”包括指涉當(dāng)在指定的比較窗口上進(jìn)行比對(duì)以獲得最大對(duì)應(yīng)時(shí)兩個(gè)序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分比針對(duì)蛋白使用時(shí)，認(rèn)識(shí)到不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基由具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基置換，因此不會(huì)改變分子的功能性質(zhì)。如果序列差別在于保守置換，則可上調(diào)序列同一性百分比以校正置換的保守性質(zhì)。差異在于這種保守置換的序列被稱(chēng)為具有“序列相似性”或“相似性”。作出這個(gè)調(diào)整的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常，這涉及將保守置換評(píng)定為部分錯(cuò)配而不是完全錯(cuò)配，從而增加序列同一性百分比。因此，例如，如果相同的氨基酸給予1分，非保守置換給予0分，則保守置換給予0至1之間的分?jǐn)?shù)。例如，根據(jù)meyers和miller，(1988)，computerapplic.biol.sci.4:11-17的算法計(jì)算保守置換的分?jǐn)?shù)，例如如在程序pc/gene(intelligenetics，mountainview，california，us)中所實(shí)現(xiàn)的。本文所用的“序列同一性百分比”意指通過(guò)在比較窗口上比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列所確定的數(shù)值，其中多核苷酸序列在該比較窗口中的部分與參考序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即，空位)，以便兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。該百分比是這樣計(jì)算的：確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。術(shù)語(yǔ)多核苷酸序列的“實(shí)質(zhì)同一性”意指利用所描述的比對(duì)程序之一采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)與參考序列比較時(shí)，多核苷酸包含具有50-100％之間的序列同一性，優(yōu)選至少50％的序列同一性，優(yōu)選至少60％的序列同一性，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％且最優(yōu)選至少95％序列同一性的序列。技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可通過(guò)考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等等適當(dāng)調(diào)整這c些值以確定兩個(gè)核苷酸序列所編碼的蛋白的相應(yīng)同一性。用于這些目的的氨基酸序列的實(shí)質(zhì)同一性通常意指55-100％之間的序列同一性，優(yōu)選至少55％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％、80％、90％，最優(yōu)選至少95％。直系同源物和旁系同源物上述同源序列可包含直系同源序列或旁系同源序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知有若干不同方法用于鑒別和定義這些功能上同源的序列。描述了定義直系同源物和旁系同源物的三種一般性方法；可通過(guò)以下所述的一種或多種方法來(lái)鑒定直系同源物、旁系同源物或同系物。非編碼區(qū)中的變體核苷酸序列硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列用于產(chǎn)生變體核苷酸序列，所述變體核苷酸序列具有5’-非翻譯區(qū)、3’-非翻譯區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列，其與相應(yīng)的seqidno:1的起始核苷酸序列具有大約70％、75％、80％、85％、90％和95％同一性。這些變體然后與種質(zhì)中與谷粒品質(zhì)和/或谷粒產(chǎn)量相關(guān)的構(gòu)成性狀的天然變異相關(guān)聯(lián)。該相關(guān)聯(lián)的變體用作標(biāo)記單倍型來(lái)選擇所期望的性狀。osnrt1.1b相關(guān)聯(lián)的多肽的變體氨基酸序列產(chǎn)生了osnrt1.1b相關(guān)聯(lián)的多肽的變體氨基酸序列。在本實(shí)施例中，改變一個(gè)氨基酸。具體而言，觀察開(kāi)放閱讀框以確定適當(dāng)?shù)陌被岣淖?。通過(guò)參考蛋白質(zhì)比對(duì)(與其它直系同源基因和來(lái)自各種物種的其它基因家族成員的比對(duì))來(lái)選擇氨基酸進(jìn)行改變。選擇據(jù)認(rèn)為不處于高選擇壓力下(不是高度保守的)且相當(dāng)易于用具有類(lèi)似化學(xué)特性(即，類(lèi)似功能性側(cè)鏈)的氨基酸進(jìn)行置換的氨基酸。利用蛋白比對(duì)，可對(duì)適當(dāng)?shù)陌被徇M(jìn)行改變。一旦鑒定出目標(biāo)氨基酸，即遵循本文所述的程序。使用這個(gè)方法產(chǎn)生出具有約70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的變體。這些變體然后與種質(zhì)中與谷粒品質(zhì)和/或谷粒產(chǎn)量相關(guān)的構(gòu)成性狀的天然變異相關(guān)聯(lián)。該相關(guān)聯(lián)的變體用作標(biāo)記單倍型來(lái)選擇所期望的性狀。用于構(gòu)建核酸的合成方法分離的本公開(kāi)的核酸也可以通過(guò)直接化學(xué)合成制備，例如用磷酸三酯方法(narang等人，(1979)meth.enzymol.68:90-9；磷酸二酯方法(brown等人，(1979)meth.enzymol.68:109-51；二乙基亞磷酰胺方法(beaucage等人，(1981)tetra.letts.22(20):1859-62；beaucage等人(出處同上)描述的固相亞磷酰胺三酯方法，如使用自動(dòng)化合成儀，例如needham-vandevanter人，(1984)nucleicacidsres.12:6159-68中所述，以及美國(guó)專(zhuān)利4,458,066的固相支持體方法?；瘜W(xué)合成通常產(chǎn)生單鏈寡核苷酸。這可通過(guò)與互補(bǔ)序列雜交或通過(guò)將該單鏈作為模板用dna聚合酶進(jìn)行聚合來(lái)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈dna。技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，雖然dna的化學(xué)合成局限于約100個(gè)堿基的序列，但可通過(guò)連接較短的序列來(lái)獲得較長(zhǎng)的序列。utr和密碼子偏好性總體來(lái)說(shuō)，已發(fā)現(xiàn)翻譯效率受rna的5'非編碼或非翻譯區(qū)(5'utr)中的特定序列元件的調(diào)控。正序列模體包括翻譯起始共有序列(kozak,(1987)nucleicacidsres.15:8125)和5<g>7甲基gpppgrna帽結(jié)構(gòu)(drummond等人，(1985)nucleicacidsres.13:7375)。負(fù)元件包括穩(wěn)定的分子內(nèi)5'utr莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(muesing等人，(1987)，cell，48:691)和5'utr中的aug序列或前面有適當(dāng)aug的短開(kāi)放閱讀框(kozak(出處同上)、rao等人，(1988)，mol.andcell.biol.8:284)。因此，本公開(kāi)提供了用于調(diào)節(jié)異源編碼序列的翻譯的5'和/或3'utr區(qū)。植物轉(zhuǎn)化方法有多種用于將外來(lái)基因?qū)胫参镏械姆椒ㄊ且阎牟⒖捎脕?lái)將硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多核苷酸插入植物宿主中，這包括生物學(xué)和物理學(xué)的植物轉(zhuǎn)化方案。參見(jiàn)例如miki等人，“procedureforintroducingforeigndnaintoplants”，載于methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology，glick和thompson編輯，crcpress,inc.，bocaraton，第67-88頁(yè)(1993)。所選擇的方法隨宿主植物而變化，包括化學(xué)轉(zhuǎn)染方法如磷酸鈣介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微生物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(horsch等人，(1985)science227:1229-31)、電穿孔、顯微注射和基因槍轟擊。用于植物細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化和植物再生的表達(dá)盒和載體以及體外培養(yǎng)方法是已知的并可獲得。參見(jiàn)例如gruber等人，“vectorsforplanttransformation”，載于methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology(出處同上)，第89-119頁(yè)。可通過(guò)一種或多種通常用于直接遞送進(jìn)細(xì)胞中的技術(shù)將分離的多核苷酸或多肽導(dǎo)入植物中。取決于要進(jìn)行基因修飾的生物體、細(xì)胞、植物或植物細(xì)胞的類(lèi)型(即單子葉植物或雙子葉植物)，這種方式可不同。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的合適方法包括顯微注射(crossway等人，(1986)，biotechniques，4:320-334和美國(guó)專(zhuān)利6,300,543)、電穿孔(riggs等人，(1986)，proc.natl.acad.sci.usa83:5602-5606)，直接基因轉(zhuǎn)移(paszkowski等人，(1984)emboj.3:2717-2722)以及彈道粒子加速(參見(jiàn)例如sanford等人，美國(guó)專(zhuān)利4,945,050；wo91/10725和mccabe等人，(1988)，biotechnology，6:923-926)。還可參見(jiàn)tomes等人，“directdnatransferintointactplantcellsviamicroprojectilebombardment”，第197-213頁(yè)，載于plantcell,tissueandorganculture,fundamentalmethods，gamborg和phillips編輯，springer-verlagberlinheidelbergnewyork，1995；美國(guó)專(zhuān)利5,736,369(分生組織)；weissinger等人，(1988)，ann.rev.genet.22:421-477；sanford等人，(1987)，particulatescienceandtechnology，5:27-37(洋蔥)；christou等人，(1988)plantphysiol.87:671-674(大豆)；datta等人，(1990)，biotechnology，8:736-740(水稻)；klein等人，(1988)，proc.natl.acad.sci.usa85:4305-4309(玉米)；klein等人，(1988)，biotechnology，6:559-563(玉米)；wo91/10725(玉米)；klein等人，(1988)，plantphysiol.，91:440-444(玉米)；fromm等人，(1990)，biotechnology，8:833-839)和gordon-kamm等人，(1990)，plantcell，2:603-618)(玉米)；hooydaas-vanslogteren和hooykaas，(1984)，nature(london)，311:763-764)；bytebierm等人，(1987)，proc.natl.acad.sci.usa84:5345-5349(百合科)；dewet等人，(1985)，載于theexperimentalmanipulationofovuletissues，chapman等人編輯，第197-209頁(yè)；longman,ny(花粉)；kaeppler等人，(1990)，plantcellreports，9:415-418；以及kaeppler等人，(1992)，theor.appl.genet.84:560-566(頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；美國(guó)專(zhuān)利5,693,512(超聲處理)；d'halluin等人，(1992)，plantcell，4:1495-1505(電穿孔)；li等人，(1993)，plantcellreports，12:250-255；以及christou和ford，(1995)，annalsofbotany，75:407-413(水稻)；osjoda等人，(1996)，naturebiotech.14:745-750；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化(美國(guó)專(zhuān)利5,981,840)；碳化硅晶須方法(frame等人，(1994)，plantj.，6:941-948)；激光方法(guo等人，(1995)，physiologiaplantarum，93:19-24)；超聲處理方法(bao等人，(1997)，ultrasoundinmedicine&biology，23:953-959；finer和finer，(2000)，lettapplmicrobiol.30:406-10；amoah等人，(2001)，jexpbot，52:1135-42)；聚乙二醇方法(krens等人，(1982)，nature，296:72-77)；單子葉和雙子葉植物細(xì)胞的原生質(zhì)可以用電穿孔(fromm等人，(1985)，proc.natl.acad.sci.usa，82:5824-5828)和顯微注射(crossway等人，(1986)，mol.gen.genet.，202:179-185)進(jìn)行轉(zhuǎn)化；將這些文獻(xiàn)全部以引用方式并入本文。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體導(dǎo)入植物中的最廣泛使用的方法是基于農(nóng)桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的。根瘤農(nóng)桿菌(a.tumefaciens)和毛根農(nóng)桿菌(a.rhizogenes)是植物病原性土壤細(xì)菌，其能遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。根瘤農(nóng)桿菌和毛根農(nóng)桿菌各自的ti和ri質(zhì)粒攜帶負(fù)責(zé)植物的遺傳轉(zhuǎn)化的基因。參見(jiàn)例如kado，(1991)，crit.rev.plantsci.10:1。有關(guān)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)和方法的描述在以下文獻(xiàn)中提供：gruber等人(出處同上)；miki等人，出處同上和moloney等人，(1989)，plantcellreports，8:238。相似地，可將基因插入源于根瘤農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌各自的ti或ri質(zhì)粒的t-dna區(qū)中。因而，可使用這些質(zhì)粒，如上構(gòu)建表達(dá)盒。已知有許多控制序列，其在偶聯(lián)至異源編碼序列并轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主生物體中時(shí)，在初始編碼序列的組織/器官特異性方面顯示出基因表達(dá)的保真性。參見(jiàn)例如benfey和chua，(1989)，science，244:174-81。用于這些質(zhì)粒中的特別合適的控制序列是用于基因在各種目標(biāo)植物中的組成型葉特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。其它可用的控制序列包括來(lái)自胭脂堿合酶基因(nos)的啟動(dòng)子和終止子。nos啟動(dòng)子和終止子存在于質(zhì)粒parc2中，該質(zhì)?？傻米悦绹?guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，指定的atcc存放號(hào)為67238。如果使用這樣一種系統(tǒng)，則來(lái)自ti或ri質(zhì)粒的毒力(vir)基因也必須存在，或者與t-dna部分一起，或者通過(guò)其中vir基因存在于單獨(dú)載體上的雙元系統(tǒng)。這類(lèi)系統(tǒng)、其中所用的載體、以及轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法描述在美國(guó)專(zhuān)利4,658,082；1993年11月16日提交的美國(guó)專(zhuān)利5,262,306中引用的、1986年10月1提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)913,914以及simpson等人，(1986)，plantmol.biol.，6:403-15(也在'306專(zhuān)利中引用)中，將所有上述參考文獻(xiàn)以引用的方式全文并入本文。一旦轉(zhuǎn)化，可將這些細(xì)胞用于再生轉(zhuǎn)基因植物。例如，整個(gè)植物可通過(guò)使該植物產(chǎn)生傷口，然后將載體導(dǎo)入該傷口位點(diǎn)中來(lái)用這些載體進(jìn)行感染?？墒怪参锏娜魏尾糠之a(chǎn)生傷口，包括葉、莖和根?；蛘?，可將外植體形式的植物組織諸如子葉組織或葉圓片用這些載體接種，并在可促進(jìn)植物再生的條件下培養(yǎng)。可將通過(guò)用毛根農(nóng)桿菌或根瘤農(nóng)桿菌(含有編碼伏馬毒素降解酶的基因)接種植物組織而轉(zhuǎn)化的根或苗用作植物組織來(lái)源，以通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生或器官發(fā)生來(lái)再生伏馬毒素抗性轉(zhuǎn)基因植物。用于再生植物組織的此類(lèi)方法的示例公開(kāi)于shahin，(1985)，theor.appl.genet.，69:235-40；美國(guó)專(zhuān)利4,658,082；simpson等人(出處同上)；和均于1986年10月1日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)no.913,913和913,914，如公布于1993年11月16日的美國(guó)專(zhuān)利no.5,262,306引用，將上述文獻(xiàn)的全部公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文。直接基因轉(zhuǎn)移盡管農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的宿主范圍廣泛，但一些主要的谷類(lèi)作物物種和裸子植物總體上對(duì)該基因轉(zhuǎn)移模式而言是頑拗的，盡管最近已在水稻中獲得了一定的成功(hiei等人，(1994)，theplantjournal，6:271-82)。已開(kāi)發(fā)了幾種植物轉(zhuǎn)化的方法(統(tǒng)稱(chēng)為直接基因轉(zhuǎn)移)作為對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的替代方案。一般適用的植物轉(zhuǎn)化方法是微拋射體(microprojectile)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中dna攜帶在測(cè)得為約1-4μm的微拋射體的表面上。用基因槍裝置(biolisticdevice)將表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織中，該基因槍裝置將微拋射體加速至300-600m/s的速度，該速度足以穿透植物細(xì)胞壁和膜(sanford等人，(1987)，part.sci.technol.5:27；sanford，(1988)，trendsbiotech，6:299；sanford，(1990)，physiol.plant，79:206以及klein等人，(1992)，biotechnology，10:268)。物理遞送dna至植物的另一種方法是如zang等人，(1991)，biotechnology，9:996中所述的對(duì)靶細(xì)胞的超聲處理。或者，脂質(zhì)體或原生質(zhì)球融合已用于將表達(dá)載體導(dǎo)入植物中。參見(jiàn)例如deshayes等人，(1985)，emboj.，4:2731和christou等人，(1987)，proc.natl.acad.sci.usa，84:3962。利用cacl2沉淀、聚乙烯醇或聚-l-鳥(niǎo)氨酸直接將dna攝入原生質(zhì)體中也已有報(bào)道。參見(jiàn)例如hain等人，(1985)，mol.gen.genet.，199:161和draper等人，(1982)，plantcellphysiol.，23:451。原生質(zhì)體和完整細(xì)胞和組織的電穿孔也已有描述。參見(jiàn)例如donn等人，(1990)，abstractsoftheviithint’l.congressonplantcellandtissuecultureiaptc(《第vii屆植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)iaptc會(huì)議摘要》)，a2-38，第53頁(yè))；d’halluin等人，(1994)，plantcell，4:1495-505)和spencer等人，(1992)，plantmol.biol.，24:51-61。1.基于多核苷酸的方法：在本公開(kāi)的一些實(shí)施方案中，用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物，該表達(dá)盒能夠表達(dá)可抑制本公開(kāi)的osnrt1.1b的表達(dá)的多核苷酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指基因產(chǎn)物的生物合成，包括所述基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，出于本公開(kāi)的目的，能夠表達(dá)可抑制至少一種硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多肽的表達(dá)的多核苷酸的表達(dá)盒，是能夠產(chǎn)生可抑制本公開(kāi)的至少一種硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多肽的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的rna分子的表達(dá)盒。蛋白或多肽從dna分子的“表達(dá)”或“產(chǎn)生”指該編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯而產(chǎn)生該蛋白或多肽，而蛋白或多肽從rna分子“表達(dá)”或“產(chǎn)生”指該rna編碼序列翻譯而產(chǎn)生蛋白或多肽?？梢种苚snrt1.1b的表達(dá)的多核苷酸的示例在下面給出。i.有義抑制/共抑制在本公開(kāi)的一些實(shí)施方案中，osnrt1.1b表達(dá)的抑制可通過(guò)有義抑制或共抑制獲得。對(duì)于共抑制，將表達(dá)盒設(shè)計(jì)為表達(dá)這樣的rna分子，該rna分子以“有義”取向?qū)?yīng)于編碼osnrt1.1b的信使rna的全部或部分。該rna分子的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致天然基因的表達(dá)減少。因此，對(duì)用該共抑制表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的多個(gè)植株系進(jìn)行篩選以鑒別那些顯示出對(duì)硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多肽表達(dá)的最大抑制的植株。用于共抑制的多核苷酸可對(duì)應(yīng)于編碼硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多肽的序列的全部或部分、osnrt1.1b轉(zhuǎn)錄物的5'和/或3'非翻譯區(qū)的全部或部分、或者編碼osnrt1.1b的轉(zhuǎn)錄物的編碼序列和非翻譯區(qū)二者的全部或部分。在其中該多核苷酸包含硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多肽的編碼區(qū)的全部或部分的一些實(shí)施方案中，將表達(dá)盒設(shè)計(jì)為消除該多核苷酸的起始密碼子，使得不會(huì)翻譯出蛋白產(chǎn)物。共抑制可用來(lái)抑制植物基因的表達(dá)以產(chǎn)生對(duì)于由這些基因編碼的蛋白而言具有不可檢測(cè)的蛋白水平的植物。參見(jiàn)例如broin等人，(2002)plantcell，14:1417-1432。共抑制還可用來(lái)抑制同一植物中的多種蛋白的表達(dá)。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,942,657。使用共抑制來(lái)抑制植物中的內(nèi)源性基因的表達(dá)的方法在以下文獻(xiàn)和專(zhuān)利中有描述：flavell等人，(1994)，proc.natl.acad.sci.usa，91:3490-3496；jorgensen等人，(1996)，plantmol.biol.，31:957-973；johansen和carrington，(2001)，plantphysiol.，126:930-938；broin等人，(2002)，plantcell，14:1417-1432；stoutjesdijk等人，(2002)，plantphysiol.，129:1723-1731；yu等人，(2003)，phytochemistry，63:753-763和美國(guó)專(zhuān)利5,034,323、5,283,184和5,942,657，將這些文獻(xiàn)和專(zhuān)利的每一個(gè)以引用方式并入本文。共抑制的效率可通過(guò)在表達(dá)盒中在有義序列的3'和多腺苷酸化信號(hào)的5'位置包括poly-dt區(qū)來(lái)提高。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利公布2002/0048814，將其以引用的方式并入本文。通常，這種核苷酸序列與內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄物的序列具有實(shí)質(zhì)上的序列同一性，優(yōu)選的是高于約65％的序列同一性，更優(yōu)選的是高于約85％的序列同一性，最優(yōu)選的是高于約95％的序列同一性。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,283,184和5,034,323，將它們以引用的方式并入本文。ii.反義抑制在本公開(kāi)的一些實(shí)施方案中，對(duì)硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多肽表達(dá)的抑制可通過(guò)反義抑制獲得。對(duì)于反義抑制，將表達(dá)盒設(shè)計(jì)為表達(dá)與編碼該硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多肽的信使rna的全部或部分互補(bǔ)的rna分子。該反義rna分子的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致天然基因的表達(dá)減少。因此，對(duì)用該反義抑制表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的多個(gè)植株系進(jìn)行篩選以鑒別那些顯示出對(duì)硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多肽表達(dá)的最大抑制的植株。iii.雙鏈rna干擾在本公開(kāi)的一些實(shí)施方案中，對(duì)osnrt1.1b表達(dá)的抑制可通過(guò)雙鏈rna(dsrna)干擾來(lái)獲得。對(duì)于dsrna干擾，有義rna分子(如上文針對(duì)共抑制所描述)和與該有義rna分子完全或部分互補(bǔ)的反義rna分子在同一細(xì)胞中表達(dá)，從而導(dǎo)致對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性信使rna的表達(dá)的抑制。有義和反義分子的表達(dá)可通過(guò)將表達(dá)盒設(shè)計(jì)為同時(shí)包含有義序列和反義序列來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛘?，可將單獨(dú)的表達(dá)盒分別用于有義序列和反義序列。使用dsrna干擾來(lái)抑制內(nèi)源性植物基因的表達(dá)的方法在以下文獻(xiàn)和專(zhuān)利中有描述：waterhouse等人，(1998)，proc.natl.acad.sci.usa，95:13959-13964，liu等人，(2002)，plantphysiol.，129:1732-1743以及wo99/49029、wo99/53050、wo99/61631和wo00/49035，將這些文獻(xiàn)和專(zhuān)利的每一個(gè)以引用方式并入本文。iv.發(fā)夾rna干擾和含內(nèi)含子的發(fā)夾rna干擾在本公開(kāi)的一些實(shí)施方案中，對(duì)osnrt1.1b表達(dá)的抑制可通過(guò)發(fā)夾rna(hprna)干擾或含內(nèi)含子的發(fā)夾rna(ihprna)干擾來(lái)獲得。這些方法在抑制內(nèi)源性基因表達(dá)方面是高度有效的。參見(jiàn)，waterhouse和helliwell，(2003)，nat.rev.genet.，4:29-38以及其中引用的參考文獻(xiàn)。對(duì)于hprna干擾，將表達(dá)盒設(shè)計(jì)為表達(dá)這樣的rna分子，該rna分子自身雜交而形成包括單鏈環(huán)區(qū)和堿基配對(duì)莖的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。該堿基配對(duì)莖區(qū)包含對(duì)應(yīng)于編碼要對(duì)其表達(dá)進(jìn)行抑制的基因的內(nèi)源性信使rna的全部或部分的有義序列和與該有義序列完全或部分互補(bǔ)的反義序列。另選地，堿基配對(duì)莖區(qū)可對(duì)應(yīng)于控制待抑制的基因的表達(dá)的啟動(dòng)子序列的一部分。因此，該分子的堿基配對(duì)莖區(qū)通常確定了rna干擾的特異性。hprna分子在抑制內(nèi)源性基因表達(dá)中很高效，它們誘導(dǎo)的rna干擾被植物后代繼承。參見(jiàn)例如chuang和meyerowitz，(2000)，proc.natl.acad.sci.usa，97:4985-4990；stoutjesdijk等人，(2002)，plantphysiol.，129:1723-1731以及waterhouse和helliwell，(2003)，nat.rev.genet.，4:29-38。使用hprna干擾來(lái)抑制或沉默基因表達(dá)的方法在例如以下文獻(xiàn)和專(zhuān)利中有描述：chuang和meyerowitz，(2000)，proc.natl.acad.sci.usa，97:4985-4990；stoutjesdijk等人，(2002)，plantphysiol.，129:1723-1731；waterhouse和helliwell，(2003)，nat.rev.genet.，4:29-38；pandolfini等人，bmcbiotechnology，3:7；以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)2003/0175965，每個(gè)文獻(xiàn)和專(zhuān)利以引用方式并入本文。hprna構(gòu)建體沉默體內(nèi)基因表達(dá)的效率的瞬時(shí)測(cè)定法已在以下文獻(xiàn)中描述：panstruga等人，(2003)，mol.biol.rep.，30:135-140，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。對(duì)于ihprna，干擾分子具有與hprna相同的總體結(jié)構(gòu)，但該rna分子另外包含內(nèi)含子，該內(nèi)含子能夠在表達(dá)該ihprna的細(xì)胞中被剪接。內(nèi)含子的使用使得發(fā)夾rna分子中的環(huán)的尺寸在剪接后最小化，這可提高干擾的效率。參見(jiàn)例如smith等人，(2000)，nature，407:319-320。事實(shí)上，smith等人證實(shí)使用ihprna介導(dǎo)的干擾，內(nèi)源性基因表達(dá)受到100％抑制。使用ihprna干擾來(lái)抑制內(nèi)源性植物基因的表達(dá)的方法例如在smith等人，(2000)，nature，407:319-320；wesley等人，(2001)，plantj.，27:581-590；wang和waterhouse，(2001)，curr.opin.plantbiol.，5:146-150；waterhouse和helliwell，(2003)，nat.rev.genet.，4:29-38；helliwell和waterhouse，(2003)，methods，30:289-295和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)2003/0180945中有描述，以上每個(gè)文獻(xiàn)和專(zhuān)利以引用方式并入本文。還可對(duì)用于hprna干擾的表達(dá)盒進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得有義序列和反義序列不對(duì)應(yīng)于內(nèi)源性rna。在這個(gè)實(shí)施方案中，該有義和反義序列在這樣的環(huán)序列的旁側(cè)，該環(huán)序列包含對(duì)應(yīng)于靶基因的內(nèi)源性信使rna的全部或部分的核苷酸序列。因而，是環(huán)區(qū)決定了rna干擾的特異性。參見(jiàn)例如wo02/00904；mette等人，(2000)，emboj，19:5194-5201；matzke等人，(2001)curr.opin.genet.devel.，11:221-227；scheid等人，(2002)，proc.natl.acad.sci.,usa，99:13659-13662；aufsaftz等人，(2002)，proc.nat’l.acad.sci.，99(4):16499-16506；sijen等人，curr.biol.(2001)11:436-440)，將這些文獻(xiàn)和專(zhuān)利以引用方式并入本文。v.擴(kuò)增子介導(dǎo)的干擾擴(kuò)增子表達(dá)盒包含源自植物病毒的序列，該序列含有靶基因的全部或部分但通常不含有該天然病毒的基因的全部。存在于表達(dá)盒的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的病毒序列使得該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能引導(dǎo)其自身的復(fù)制。由擴(kuò)增子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物相對(duì)于靶序列(即硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多肽的信使rna)可以是有義或反義的。利用擴(kuò)增子來(lái)抑制內(nèi)源植物基因的表達(dá)的方法例如在如下文獻(xiàn)中有描述：angell和baulcombe，(1997)，emboj.，16:3675-3684、angell和baulcombe，(1999)，plantj.，20:357-362以及美國(guó)專(zhuān)利6,646,805，將這些參考文獻(xiàn)的每一個(gè)以引用的方式并入本文。vii.小干擾rna或微rna在本公開(kāi)的一些實(shí)施方案中，osnrt1.1b表達(dá)的抑制可通過(guò)表達(dá)編碼微rna(mirna)的基因經(jīng)rna干擾獲得。mirna是由約22個(gè)核糖核苷酸組成的調(diào)控劑，mirna在抑制內(nèi)源性基因表達(dá)方面很高效。參見(jiàn)例如javier等人，(2003)，nature，425:257-263，將該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。對(duì)于mirna干擾，將表達(dá)盒設(shè)計(jì)成表達(dá)模仿內(nèi)源性mirna基因的rna分子。該mirna基因編碼可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的rna，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)含有與另一內(nèi)源性基因(靶序列)互補(bǔ)的22核苷酸序列。為抑制硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的表達(dá)，所述22個(gè)核苷酸序列選自硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄物序列并包含所述硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的序列有義方向的22個(gè)核苷酸和與所述有義序列互補(bǔ)的相應(yīng)的反義序列的21個(gè)核苷酸。mirna分子在抑制內(nèi)源性基因的表達(dá)上很高效，并且它們誘導(dǎo)的rna干擾被植物后代繼承。vi.調(diào)節(jié)生殖組織發(fā)育提供了用于調(diào)節(jié)生殖組織發(fā)育的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于調(diào)節(jié)植物中的花發(fā)育的方法。所謂“調(diào)節(jié)花發(fā)育”意指與其中硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多肽的活性或水平還未受調(diào)節(jié)的對(duì)照植物相比，植物的生殖組織的結(jié)構(gòu)的任何改變?！罢{(diào)節(jié)花發(fā)育”還包括與其中硝酸鹽攝入相關(guān)聯(lián)的多肽的活性或水平未受調(diào)節(jié)的對(duì)照植物相比，植物生殖組織發(fā)育的時(shí)刻的任何改變(即花發(fā)育時(shí)刻的延遲或提前)。宏觀改變可包括在環(huán)境脅迫時(shí)的如下變化：生殖器官的尺寸、形狀、數(shù)目或位置，這些結(jié)構(gòu)形成的發(fā)育時(shí)間段，或者維持或發(fā)展經(jīng)過(guò)開(kāi)花過(guò)程的能力。微觀改變可包括構(gòu)成生殖器官的細(xì)胞的類(lèi)型或形狀的改變。一般來(lái)講，修改或改變宿主內(nèi)源性基因組dna的方法是可用的。這包括改變宿主天然dna序列或預(yù)先存在的轉(zhuǎn)基因序列，所述轉(zhuǎn)基因序列包括調(diào)控元件、編碼和非編碼序列。這些方法也可用于使核酸靶向基因組中預(yù)先工程化的靶識(shí)別序列。例如，本文所述的經(jīng)過(guò)遺傳修飾的細(xì)胞或植物使用“定制的”或工程化核酸內(nèi)切酶如大范圍核酸酶生成，所述大范圍核酸酶的產(chǎn)生用于修飾植物基因組(參見(jiàn)例如wo2009/114321；gao等人，(2010)，plantjournal，1:176-187)。另一個(gè)定點(diǎn)工程化通過(guò)使用與限制性酶的限制特性結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域識(shí)別。參見(jiàn)例如urnov等人，(2010)，natrevgenet.，11(9):636-46；shukla等人，(2009)，nature，459(7245):437-41。類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子(tal)效應(yīng)物-dna修飾酶(tale或talen)也用于植物基因組中進(jìn)行工程改變。參見(jiàn)例如us20110145940；cermak等人，(2011)，nucleicacidsres.，39(12)；以及boch等人，(2009)，science，326(5959):1509-12。還可使用細(xì)菌ii型crispr(規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列)/cas(crispr-相關(guān)聯(lián)的)系統(tǒng)進(jìn)行植物基因組的位點(diǎn)特異性修飾。參見(jiàn)例如belhaj等人，(2013)，plantmethods，9:39；crispr/cas系統(tǒng)允許靶向裂解由可定制的小非編碼rna引導(dǎo)的基因組dna。基于nrt1.1b編碼序列、直系同源物/同系物的多肽序列和基因組dna序列的公開(kāi)，可易于進(jìn)行定點(diǎn)誘變以產(chǎn)生表達(dá)更高水平內(nèi)源性nrt1.1b多肽或其直系同源物的植物。還涵蓋對(duì)于本文公開(kāi)的或?qū)嵤┓桨傅膎rt1.1b多肽或?qū)τ谄渥凅w或片段的抗體。本公開(kāi)的抗體包括多克隆和單克隆抗體以及它們的片斷，所述片斷保留了其與本文所公開(kāi)的nrt1.1b多肽結(jié)合的能力?？贵w、單克隆抗體或其片段如果能夠與分子發(fā)生特異性反應(yīng)從而使該分子結(jié)合于該抗體、單克隆抗體或其片段，則被認(rèn)為能夠結(jié)合該分子。術(shù)語(yǔ)“抗體”(ab)或“單克隆抗體”(mab)意在包括能夠結(jié)合半抗原的完整分子以及其片段或結(jié)合區(qū)或域(比如，fab和f(ab).sub.2片段)。此類(lèi)片段通常由蛋白水解裂解(比如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)產(chǎn)生?；蛘?，半抗原結(jié)合片段可通過(guò)應(yīng)用重組dna技術(shù)或通過(guò)合成化學(xué)產(chǎn)生。用于制備本公開(kāi)抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。例如參見(jiàn)antibodies,alaboratorymanual,edharlowanddavidlane(eds.)coldspringharborlaboratory,n.y.(1988)(《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，edharlow和davidlane編輯，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988年)以及其中引用的參考文獻(xiàn)。說(shuō)明免疫學(xué)一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考著作包括：klein,j.immunology:thescienceofcell-noncelldiscrimination,johnwiley&sons,n.y.(1982)；dennett等人，monoclonalantibodies,hybridoma:anewdimensioninbiologicalanalyses,plenumpress,n.y.(1980)以及campbell，“monoclonalantibodytechnology”，載于laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology，第13卷，burdon等人(編輯)，elsevier，amsterdam(1984)。還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,196,265；4,609,893；4,713,325；4,714,681；4,716,111；4,716,117和4,720,459。ptip-50多肽或ptip-65多肽抗體或其抗原結(jié)合部分可通過(guò)多種技術(shù)產(chǎn)生，包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如kohler和milstein，(1975)nature256:495的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。也可采用用于產(chǎn)生單克隆抗體的其它技術(shù)，比如b淋巴細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)化或致癌性轉(zhuǎn)化。用于制備雜交瘤的動(dòng)物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。用于分離供融合用的免疫脾細(xì)胞的免疫方案和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。融合伴侶(例如，鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合程序也是已知的。本公開(kāi)的抗體和單克隆抗體可通過(guò)將本文所公開(kāi)的nrt1.1b多肽用作抗原來(lái)制備。提供了用于在樣品中檢測(cè)本文所公開(kāi)的nrt1.1b多肽的存在或檢測(cè)編碼本文所公開(kāi)的nrt1.1b多肽的核苷酸序列的存在的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒提供了基于抗體的試劑以用于檢測(cè)組織樣品中本文所公開(kāi)的nrt1.1b多肽的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒提供了可用于檢測(cè)編碼本文所公開(kāi)的nrt1.1b多肽的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的存在的標(biāo)記核酸探針。該試劑盒連同執(zhí)行檢測(cè)方法的適當(dāng)試劑和對(duì)照以及試劑盒使用說(shuō)明一起提供。如上面所論述的，技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)用于調(diào)節(jié)植物中的花發(fā)育的適當(dāng)啟動(dòng)子。用于這個(gè)實(shí)施方案的示例性啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、苗偏好啟動(dòng)子和花偏好啟動(dòng)子。所關(guān)注的基因可反映涉及作物開(kāi)發(fā)的那些的商業(yè)市場(chǎng)和利益。所關(guān)注的作物和市場(chǎng)在變化，隨著發(fā)展中國(guó)家開(kāi)放了世界市場(chǎng)，也將出現(xiàn)新的作物和技術(shù)。另外，隨著我們對(duì)農(nóng)學(xué)性狀和特性諸如產(chǎn)量和雜種優(yōu)勢(shì)的理解逐漸深入，選擇進(jìn)行轉(zhuǎn)化的基因會(huì)相應(yīng)變化。所關(guān)注的基因的大體類(lèi)別包括例如涉及信息的那些基因(如鋅指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及看家的那些基因(如熱休克蛋白)。轉(zhuǎn)基因的更具體類(lèi)別例如包括編碼對(duì)農(nóng)藝學(xué)、昆蟲(chóng)抗性、病害抗性、除草劑抗性、不育性、籽粒特性和商業(yè)產(chǎn)品重要的性狀的基因。一般而言，所關(guān)注的基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的那些基因以及影響仁大小、蔗糖載量等的那些基因。在某些實(shí)施方案中，可將本公開(kāi)的核酸序列與所關(guān)注的其它多核苷酸序列聯(lián)合(“堆疊”)使用，以便產(chǎn)生具有所需表型的植物。參考如下非限制性實(shí)施例可更好地理解本公開(kāi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，可以在不脫離本文所公開(kāi)的并受權(quán)利要求書(shū)保護(hù)的發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的情況下實(shí)施本發(fā)明的其它實(shí)施方案。實(shí)施例實(shí)施例1——nrt1.1b/osnpf6.5的鑒定硝酸鹽和銨吸收利用范圍較大的水稻品種進(jìn)行分析，包括34個(gè)秈稻和粳稻栽培品種。在15n-硝酸鹽標(biāo)記之后秈稻中的15n積聚顯著高于粳稻(圖7a)，而在15n-銨標(biāo)記之后秈稻和粳稻之間15n積聚的差異在統(tǒng)計(jì)意義上不顯著(圖7b)。該分析指出，秈稻實(shí)際上具有比粳稻更高的硝酸鹽吸收活性。為鑒定與該種硝酸鹽使用趨異度相關(guān)的基因變異，使用氯酸鹽即硝酸鹽的毒性類(lèi)似物來(lái)進(jìn)行定位作圖。在采用氯酸鹽敏感性測(cè)定對(duì)134個(gè)稻品種測(cè)試之后，秈稻品種可因顯著更高的氯酸鹽敏感性而在顯型上與粳稻品種區(qū)分開(kāi)(圖7c)。因此，通過(guò)使用作為供體的氯酸鹽敏感性較高的秈稻品種ir24以及作為受體的氯酸鹽敏感性較低的粳稻品種日本晴開(kāi)發(fā)的317bc2f5品系用于氯酸鹽毒性篩選。獲得了氯酸鹽敏感性相對(duì)較高的七個(gè)品系，表現(xiàn)出最高氯酸鹽敏感性的其中一者被選擇用于產(chǎn)生染色體單片段代換系(csssl)ni10-1，該ni10-1攜帶日本晴背景中的來(lái)自ir24的10號(hào)染色體上的單代換片段(圖8a)。在15n-硝酸鹽標(biāo)記之后ni10-1具有比日本晴顯著更高的氯酸鹽敏感性和15n積聚(圖1a，b)。ni10-1的基因滲入片段包含先前定位的主要的氯酸鹽敏感性數(shù)量性狀基因座qchr10。遺傳分析顯示出ni10-1的氯酸鹽敏感性表型被分離為半顯性性狀(圖8b-d)。由ni10-1與日本晴之間的雜交進(jìn)行精細(xì)作圖，并且候選基因縮窄到介于標(biāo)記m10-21和m10-23之間的約15kb區(qū)域(圖1c)。編碼硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(稱(chēng)為nrt1.1b/osnpf6.5)的基因座loc_os10g40600是定位至該區(qū)域的唯一基因。csssl鑒定和nil構(gòu)建。將從bc2f5群體鑒別的氯酸鹽敏感性最高的品系與作為受體親本的日本晴回交兩次，以產(chǎn)生csssl。使用均勻遍布于12號(hào)染色體上的123個(gè)基于pcr的多態(tài)性插入缺失標(biāo)記來(lái)鑒定和選擇包含目標(biāo)供體片段的候選品系。從包含來(lái)自ir24的10號(hào)染色體的單片段的bc4f4群體中鑒定出氯酸鹽敏感性cssslni10-1。將ni10-1×日本晴f1代雜交體與日本晴回交，以產(chǎn)生攜帶nrt1.1b-ir24的nil(bc6f4)。nil中基因滲入片段的尺寸在m-12與m-19之間為約400kb。用于csssl鑒定和nil產(chǎn)生的引物列出于表2中。nrt1.1b的精細(xì)作圖。采用來(lái)源于ni10-1×日本晴的f2代群體進(jìn)行精細(xì)作圖。從采用氯酸鹽測(cè)定鑒定的f2代群體的所關(guān)注的個(gè)體中，選擇3,018個(gè)氯酸鹽敏感性分離體進(jìn)行遺傳連鎖分析。用于精細(xì)作圖的引物列出于表2中。氯酸鹽敏感性測(cè)定。首先使幼苗在發(fā)芽后于含2mmkno3的改良kimurab溶液中培養(yǎng)4天。隨后用2mm氯酸鹽將幼苗處理4天，并使其在改良的kimurab溶液(2mmkno3)中恢復(fù)2天。氯酸鹽敏感性計(jì)算為氯酸鹽對(duì)植株高度的抑制百分率：(對(duì)照處理高度–氯酸鹽處理高度/對(duì)照處理高度)×100。用于測(cè)定15n積聚的15n-硝酸鹽/銨標(biāo)記。15n-硝酸鹽標(biāo)記之后的15n積聚測(cè)定利用15n標(biāo)記的kno3(98％原子15n-kno3，sigma-aldrich)進(jìn)行。首先將幼苗在含5mmkno3的改良kimurab溶液中培養(yǎng)10天。隨后，用含5mm15n-kno3的改良kimurab處理幼苗24小時(shí)(對(duì)于34個(gè)水稻栽培種，用15n-kno3處理幼苗3小時(shí))。第三，將幼苗轉(zhuǎn)移到未標(biāo)記的溶液中3分鐘，0.1mmcaso4中2分鐘，以除去根表面上的15n-no3-。收集根和苗并在70℃下干燥。最后，研磨樣品并使用同位素比質(zhì)譜儀利用元素分析儀(thermofinnigandeltaplusxp；flashea1112)測(cè)定15n含量。對(duì)nrt1.1b突變體和zhonghua11野生型而言，在具有較低(200μmkno3)或較高(5mmkno3)硝酸鹽的改良kimurab溶液中培養(yǎng)幼苗10天，接著，用含200μm或5mm15n-標(biāo)記的kno3的改良kimurab處理幼苗24小時(shí)，然后進(jìn)行分析。對(duì)15n-銨標(biāo)記后的15n積聚測(cè)定而言，將幼苗首先在含1mm(nh4)2so4(作為n源)的改良kimurab溶液中栽培10天，并且用2mm15n標(biāo)記的nh4cl(98％原子15n-nh4cl，sigma-aldrich)處理3小時(shí)，并且如上所述測(cè)定15n含量。表2該研究中使用的引物.實(shí)施例2——nrt1.1bsnp分析序列分析顯示出日本晴和ir24之間的nrt1.1b的編碼序列(cds)內(nèi)的兩種單核苷酸多態(tài)性(snp)。snp1(c.980c>t)導(dǎo)致錯(cuò)義突變，日本晴中的蘇氨酸(thr)對(duì)應(yīng)于ir24中的甲硫氨酸(met)(p.thr327met置換)，而snp2為同義核苷酸置換(c.1335g>c)(圖1d)。還在用于qchr10作圖的親本jx17和zyq8之間檢測(cè)到nrt1.1b中的snp1和snp2(表3)，確認(rèn)了nrt1.1b對(duì)應(yīng)于qchr10的先前推測(cè)。nrt1.1b-日本晴/ir24的氨基酸置換發(fā)生在中心胞質(zhì)環(huán)(ccl)中，這對(duì)于運(yùn)輸功能至關(guān)重要。這引導(dǎo)我們假設(shè)，由snp1所導(dǎo)致的nrt1.1b變異可能造成日本晴和ir24之間的氯酸鹽敏感性和硝酸鹽利用趨異度。rna提取、cdna制備以及qrt-pcr.使用trizol試劑(invitrogen)提取總rna。將寡(dt)18用作引物，使用經(jīng)dnasei處理的約2μg總rna來(lái)合成第一鏈cdna。將第一鏈cdna的產(chǎn)物用作pcr的模板。就qrt-pcr而言，將sybrgreeni添加到反應(yīng)混合物中，并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)在chromo4實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)系統(tǒng)(bio-rad,cfx96)上運(yùn)行。采用opticon監(jiān)控器軟件(bio-rad)分析數(shù)據(jù)。對(duì)各個(gè)基因進(jìn)行三次平行測(cè)定。在所有分析中，將水稻actin1用作內(nèi)參。用于qrt-pcr的引物列出于表2中。免疫印跡分析.將nrt1.1b粳稻/秈稻-egfp轉(zhuǎn)基因幼苗在發(fā)芽后于kimurab溶液中栽培10天，然后用200μmchx處理。在chx處理之后，在0、1、2和4小時(shí)收集轉(zhuǎn)基因植物的苗，并且利用2×sds緩沖液(4％sds、10％β-巰基乙醇、125mmtris-hcl(ph6.8)、20％甘油和0.002％bpb)，使用相同量的植物材料來(lái)提取總蛋白質(zhì)。通過(guò)sds/page分析蛋白質(zhì)樣品并且用抗-gfp抗體(abmart，m20004)進(jìn)行免疫印跡。群體序列集.中心都位于nrt1.1b的兩個(gè)群體序列集22kb和1mb獲自稻hapmap3數(shù)據(jù)集22，每個(gè)序列的缺失率≤80％?？偣?39和422個(gè)秈稻、327和308個(gè)粳稻、以及438和439個(gè)普通野生稻品種分別保留在22kb和1mb群體中。22kb序列集用于群體特異性等位基因(psa)檢測(cè)和核苷酸多樣性分析。1mb序列集用于ld統(tǒng)計(jì)。另外，提取來(lái)自水稻hapmap3的中心位于nrt1.1b的12kb區(qū)域中的snp并且用于nrt1.1b品種系統(tǒng)發(fā)育重建。nrt1.1b的系統(tǒng)發(fā)育重建.使用phylip3.695構(gòu)建水稻品種的鄰接品種樹(shù)。使用evolview29使所得的樹(shù)可視化并注釋。從短舌野稻、非洲栽培稻(o.glaberrima)、普通野生稻、大穎野生稻(o.glumaepatula)、南方野稻(o.meridionalis)、長(zhǎng)雄野生稻(o.longistamainata)和斑點(diǎn)野生稻中測(cè)序稻屬中nrt1.1b的直系同源物。用于nrt1.1b測(cè)序的引物列出于表2中。另外，來(lái)自普通野生稻acc.w1943ver.2、稻屬粳稻變種日本晴ver.tigr7.0、稻屬秈稻變種9311和稻屬秈稻變種pa64s的nrt1.1b的直系同源物通過(guò)blast搜索獲自引用的在線數(shù)據(jù)庫(kù)。多序列比對(duì)在mega6.06中通過(guò)muscle31獲得。采用jukes-cantor模型使用鄰近相加的方法通過(guò)mega6.06重建稻屬中的nrt1.1b的系統(tǒng)發(fā)育，對(duì)于缺失數(shù)據(jù)成對(duì)刪除并且自展偽復(fù)制1,000次。在mega6.06中通過(guò)比對(duì)瀏覽器重建snp1等位基因的祖先狀態(tài)。nrt1.1b的cds中群體特異性等位基因(psa)的檢測(cè)通過(guò)經(jīng)由定制的perl腳本對(duì)22kb序列集的單核苷酸多樣性(snd)計(jì)算來(lái)識(shí)別psa。將π值高于0.3的snp歸類(lèi)為psa。位于cds區(qū)域中的psa是nrt1.1b功能趨異度的可能候選。等位基因頻率大于0.3的亞群中的基因型被稱(chēng)為代表性的基因型(psa)。人工選擇的評(píng)估人工選擇通過(guò)22kb序列集的核苷酸多樣性(π)來(lái)評(píng)估。核苷酸多樣性(包括單核苷酸多樣性，snd)通過(guò)定制的perl腳本來(lái)計(jì)算(可根據(jù)要求得到)。22kb序列集內(nèi)的上部6kb區(qū)域、中間10kb區(qū)域(在中心具有nrt1.1b)和下部6kb區(qū)域之間的平均核苷酸多樣性的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異在各個(gè)水稻亞群中實(shí)施。基于方差結(jié)果分析(anova，p＝0.0167)，在秈稻亞群中實(shí)施fisher的最小顯著差數(shù)法(lsd)?；赼nova結(jié)果(分別p＝0.1807和0.4354)，在粳稻和野生水稻普通野生稻亞群上實(shí)施ryan-einot-gabriel-welschq(regwq)方法。所有anova測(cè)試假設(shè)均勻性檢驗(yàn)(leven的測(cè)試，p>0.25)結(jié)果所示的相同方差。使用omegaplus-m34(-minwin10-maxwin5000-grid2000-imputen-binary-threads20和-所有參數(shù))在1mb序列集上進(jìn)行ωmax參數(shù)33估計(jì)的ld統(tǒng)計(jì)。代表最新正向掃描的前5％ωmax截?cái)嘀祻奈垂_(kāi)的研究得到。ld統(tǒng)計(jì)值范圍是來(lái)自nrt1.1b區(qū)域的數(shù)據(jù)點(diǎn)的最左和最右邊界范圍的平均值，對(duì)于秈稻、粳稻和野生水稻普通野生稻其分別為744.6kb、914.7kb和156.6kb。除非另有說(shuō)明，否則統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試使用sas9.3進(jìn)行。實(shí)施例3——nrt1.1b等位基因的驗(yàn)證為驗(yàn)證假說(shuō)，進(jìn)一步檢查近等基因系(nil)，包括日本晴背景中的nrt1.1b-ir24等位基因(圖8e)。相比于日本晴，nil在15n-硝酸鹽標(biāo)記之后表現(xiàn)出氯酸鹽敏感性(圖1e)和15n積聚(圖1f和圖8f)的顯著增加。受camv35s啟動(dòng)子或其相應(yīng)的天然啟動(dòng)子控制的nrt1.1b-日本晴/ir24的轉(zhuǎn)基因分析顯示出，在15n-硝酸鹽標(biāo)記后nrt1.1b-ir24轉(zhuǎn)基因植物中的15n積聚高于nrt1.1b-日本晴轉(zhuǎn)基因植物(圖1g和圖9a-c)。此外，nil或ir24中nrt1.1b的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)類(lèi)似于或甚至低至日本晴(圖9d)，排除了基因表達(dá)差異導(dǎo)致這兩個(gè)nrt1.1b等位基因功能性變異的可能性。實(shí)施例4——nrt1.1b編碼ptr(肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)結(jié)構(gòu)域-包含蛋白質(zhì)nrt1.1b編碼ptr(肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)結(jié)構(gòu)域-包含蛋白質(zhì)(圖10a)。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示出nrt1.1b與chl1(atnrt1.1；圖10b，c)共享最近共同祖先，雙親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和傳感蛋白。使用水稻原生質(zhì)體中的nrt1.1b-egfp融合蛋白的進(jìn)一步研究顯示出nrt1.1b定位至原生質(zhì)膜(圖11)。另外，使用爪蟾卵母細(xì)胞的15n-硝酸鹽攝入測(cè)定示出，在較低(200μm)和較高(10mm)硝酸鹽濃度兩者下硝酸鹽攝入在注射有nrt1.1bcrna的卵母細(xì)胞中更高，并且nrt1.1b-ir24注射的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出比nrt1.1b-日本晴注射的卵母細(xì)胞相對(duì)更高的硝酸鹽攝入活性(圖2a)。這表明在較低和較高硝酸鹽濃度兩者下nrt1.1b具有硝酸鹽運(yùn)輸活性，并且nrt1.1b-ir24相對(duì)于nrt1.1b-日本晴具有更高的活性。nrt1.1b表達(dá)基本上由硝酸鹽誘導(dǎo)(圖2b)。nrt1.1b啟動(dòng)子::β-葡糖苷酸酶(gus)轉(zhuǎn)基因植物的檢查示出主要在根毛、表皮和維管組織中檢測(cè)出gus活性(圖2c-h)。原位雜交示出，nrt1.1b轉(zhuǎn)錄物在鄰近根中木質(zhì)部的表皮細(xì)胞和中柱細(xì)胞中豐度最大(圖2i，j)。這些發(fā)現(xiàn)提供的有力支持在于，nrt1.1b直接參與硝酸鹽攝入和硝酸鹽運(yùn)輸。附加確認(rèn)采用功能喪失的突變型nrt1.1b獲得，其在硝酸鹽攝入和硝酸鹽根到苗運(yùn)輸兩者中具有缺陷(圖12)。因此，可能nrt1.1b中天然存在的基因變異也可影響這些過(guò)程?？梢灶A(yù)知，硝酸鹽攝入活性和根到苗運(yùn)輸在nil中增強(qiáng)(圖3a，b)，這解釋了在nil中15n-硝酸鹽標(biāo)記后更高的15n積聚。值得注意的是，兩種編碼硝酸還原酶的基因osnia1和osnia2(硝酸鹽同化的關(guān)鍵組分)在nil中被顯著上調(diào)(圖3c，d)，而硝酸鹽對(duì)其的誘導(dǎo)在nrt1.1b突變體中受到很大的阻遏(圖13a)。這指出nrt1.1b可能在硝酸鹽信號(hào)傳導(dǎo)16-18中用作類(lèi)似于chl1的傳感蛋白/轉(zhuǎn)運(yùn)受體，并且其變異可改變硝酸鹽應(yīng)答基因的表達(dá)。因此，nrt1.1b的基因變異可影響硝酸鹽利用的不同步驟，包括根攝入，根到苗運(yùn)輸，以及同化作用。亞細(xì)胞定位測(cè)定.經(jīng)由克隆到二元載體pcambia2300-camv35s-egfp中將nrt1.1b-日本晴/ir24的cds與增強(qiáng)的綠熒光蛋白(egfp)框內(nèi)融合。所得的載體轉(zhuǎn)化到稻原生質(zhì)體中，如先前25所述。egfp圖像用共聚焦顯微鏡(leica，tcssp5)觀察。所用引物列出于表2中。非洲蟾蜍卵母細(xì)胞中的15n-硝酸鹽攝入測(cè)定將nrt1.1b-日本晴/ir24的cds擴(kuò)增并克隆到非洲蟾蜍卵母細(xì)胞表達(dá)載體pcs2+中限制性位點(diǎn)bamhi和ecori之間，然后用apai線性化。根據(jù)制造商規(guī)程，使用mmessagemmachine盒(ambion，am1340)在體外合成帶帽mrna。在第v-vi階段使非洲蟾蜍卵母細(xì)胞注入含46ngnrt1.1bcrna的46nl核酸酶-游離水。在注入后，將卵母細(xì)胞在nd-96培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)并使用其進(jìn)行15no3-攝入測(cè)定。分別使用200μm和10mm15n-kno3在卵母細(xì)胞中進(jìn)行高和低親和性攝入測(cè)定，如先前26所述。所用引物列出于表2中。啟動(dòng)子::gus和rna原位雜交測(cè)定.從日本晴擴(kuò)增nrt1.1b的起始密碼子atg的1.9kb上游dna片段并克隆到pcambia2391z中以產(chǎn)生nrt1.1b啟動(dòng)子::gus，并且將所得的載體轉(zhuǎn)化到zhonghua11中。對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的根、葉鞘、葉片和稈的組織取樣以進(jìn)行g(shù)us表達(dá)的組織化學(xué)檢測(cè)。根據(jù)先前描述的方法27進(jìn)行rna原位雜交。用于載體構(gòu)建和探針擴(kuò)增的引物列出于表2中。15n-硝酸鹽攝入活性和根到苗運(yùn)輸測(cè)定利用15n-kno3測(cè)定對(duì)硝酸鹽攝入活性進(jìn)行測(cè)定。在5mm15n-kno3攝入3小時(shí)后測(cè)定整個(gè)植株的15n含量。攝入活性計(jì)算為每單位時(shí)間每單位根重量的15n攝入量。在5mm15n-kno3標(biāo)記3小時(shí)之后，通過(guò)苗與根之間的15n積聚(15nmm/gdw)比率測(cè)定根到苗的硝酸鹽運(yùn)輸。就nrt1.1b突變體和zhonghua11而言，攝入和根到苗運(yùn)輸測(cè)定分別使用200μm和5mm15n-kno3進(jìn)行。實(shí)施例5——nrt1.1b家族的系統(tǒng)發(fā)育分析使用950份稻種質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育分析示出nrt1.1b在秈稻和粳稻亞種之間明顯分歧(圖4a)。基于單核苷酸多樣性，snp1和snp2僅僅被鑒定為nrt1.1b的cds中的兩種群體特異性等位基因(圖14a)。134個(gè)水稻品種中nrt1.1b的重新定序進(jìn)一步證實(shí)，秈稻品種具有ir24基因型，而粳稻品種具有日本晴基因型(圖14b和表3)，這與觀察到的秈稻品種相對(duì)于粳稻品種具有更高的硝酸鹽吸收和氯酸鹽敏感性相一致(圖7a，c)。稻屬中nrt1.1b直系同源物的評(píng)估顯示出nrt1.1b-秈稻是后來(lái)得到的等位基因(圖4b)。秈稻中的snp1僅保留來(lái)自具有兩個(gè)基因型(c/t)的其直接祖先普通野生稻-i的一個(gè)基因型(t)，而粳稻中的snp1僅保留來(lái)自其直接祖先普通野生稻-iii的基因型(c)(圖4c)，這指出nrt1.1b-秈稻已經(jīng)歷定向選擇。nrt1.1b的核苷酸多樣性(π)分析示出秈稻和粳稻分別保留普通野生稻多樣性的6.5％和2.5％。核苷酸多樣性的減少可能是陽(yáng)性選擇、遺傳漂變或瓶頸效應(yīng)的結(jié)果。然而，nrt1.1b-秈稻的π顯著高于其旁側(cè)區(qū)域(圖14c，e)，消除了遺傳漂變和瓶頸效應(yīng)的可能性并且指示出陽(yáng)性選擇。此外，粳稻亞群中任一區(qū)域的π沒(méi)有顯著差別，但卻低于其野生相應(yīng)物(圖14c，e)，這可由瓶頸效應(yīng)解釋。秈稻中nrt1.1b周?chē)娘@著更高的連鎖不平衡統(tǒng)計(jì)值(ωmax)進(jìn)一步支持了nrt1.1b-秈稻的陽(yáng)性選擇的假說(shuō)(圖14d)。這些結(jié)果顯示出nrt1.1b可能在秈稻馴養(yǎng)期間經(jīng)受人工選擇，隨后導(dǎo)致更高的硝酸鹽利用率或nue。表3：用于15n-硝酸鹽/銨吸收、氯酸鹽敏感性測(cè)定和nrt1.1b重新定序分析的水稻品種用編號(hào)標(biāo)記的水稻種質(zhì)用于15n-硝酸鹽/銨吸收測(cè)定。實(shí)施例6–nrt1.1表達(dá)和增大的nue為測(cè)試nrt1.1b-秈稻可提高nue的假說(shuō)，進(jìn)一步研究nil的生長(zhǎng)性能和谷粒產(chǎn)量。在將硝酸鹽用作唯一氮源水培下，nil特別是在相對(duì)較低的硝酸鹽條件下相對(duì)于日本晴表現(xiàn)出顯著的優(yōu)點(diǎn)：增加的葉綠素含量、光合速率、以及生物質(zhì)產(chǎn)量(400μm和1mm；圖5a和圖16)。我們將硝酸鹽用作主要氮肥在三個(gè)地點(diǎn)即北京(e116o，n40o)、上海(e121o，n31o)和長(zhǎng)沙(e112o，n28o)進(jìn)一步進(jìn)行大規(guī)模田間試驗(yàn)。在低氮供應(yīng)下，nil中每株植物的分蘗數(shù)顯著增加，這導(dǎo)致每株植物的谷粒產(chǎn)量增加26.1-29.4％，每塊樣地的實(shí)際產(chǎn)量增加30.3-33.4％，而土壤23，24中由每單位可用氮的谷粒產(chǎn)量定義的nue也提高約30％(圖5b-d和圖7)。然而，對(duì)于每個(gè)穗的種子數(shù)目、結(jié)實(shí)率和千粒重，并沒(méi)有觀察到顯著差異(表4)。在高氮供應(yīng)(標(biāo)準(zhǔn)氮水平)下，nil中每株植物的分蘗數(shù)、每株植物的谷粒產(chǎn)量以及每塊樣地的實(shí)際產(chǎn)量也分別增加8.3-11.3％、9.3-10.9％和7.0-13.2％，并且平均nue提高約10％(圖5b，c和圖7)。田間試驗(yàn)還示出，在低氮(圖6)和高氮條件(圖7)兩者下，nrt1.1b-秈稻轉(zhuǎn)基因植物具有比nrt1.1b-粳稻轉(zhuǎn)基因植物更好的生長(zhǎng)性能(圖7)和更高的nue。另外，當(dāng)將nrt1.1b-秈稻導(dǎo)入kongyu131和xiushui134中時(shí)，將兩種優(yōu)質(zhì)的粳稻栽培品種分別廣泛栽培于中國(guó)東北和長(zhǎng)江流域，在15n-硝酸鹽標(biāo)記后氯酸鹽敏感性和15n積聚兩者也顯著增加(圖7)，這指示廣泛范圍的粳稻背景中的nrt1.1b-秈稻的應(yīng)用價(jià)值。因此，這些結(jié)果展示nrt1.1b可為作物育種的nue提高中的重要參與物質(zhì)。由nrt1.1b多態(tài)性導(dǎo)致的nue差異可由硝酸鹽利用的多個(gè)方面的改變?cè)斐伞３跛猁}攝入和根到苗運(yùn)輸之外，我們的數(shù)據(jù)還表明nrt1.1b也在硝酸鹽信號(hào)化中起重要作用，其可能對(duì)nue測(cè)定具有更顯著的貢獻(xiàn)(補(bǔ)充的注釋)。植物材料和生長(zhǎng)條件.就短期水培而言，使水稻幼苗在生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)，條件為12小時(shí)光照(30℃)/12小時(shí)黑夜(28℃)光周期，約200μmm-2s-1光子密度和70％濕度。對(duì)于生長(zhǎng)性能測(cè)定，日本晴和nil的長(zhǎng)期生長(zhǎng)水培在人工氣候室中進(jìn)行，條件為12小時(shí)光照(28℃)/12小時(shí)黑夜(25℃)光周期，約300μmm-2s-1光子密度和40％濕度。使用具有不同硝酸鹽濃度的改良的kimurab溶液(400μm/1mm/2mmkno3，1mmkcl，0.36mmcacl2，0.54mmmgso4，0.18mmkh2po4，40μmfe(ii)-edta，18.8μmh3bo3，13.4μmmncl2，0.32μmcuso4，0.3μmznso4，0.03μmna2moo4和1.6mmna2sio3，ph6.0)進(jìn)行水培。對(duì)于各個(gè)生長(zhǎng)條件，進(jìn)行3次平行測(cè)定。nrt1.1b突變體(zhonghua11背景，粳稻品種)獲自上海t-dna插入群體。分析nrt1.1b突變體、zhonghua11(zh11)、nrt1.1b粳稻-egfp轉(zhuǎn)基因植物(ng-nip6，nrt1.1b背景)、以及nrt1.1b秈稻-egfp轉(zhuǎn)基因植物(ng-ir4，nrt1.1b背景)中nrt1.1b的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)分析。轉(zhuǎn)錄物水平用qrt-pcr測(cè)定。ng-nip6和ng-ir4示出比nrt1.1b突變體更高的氯酸鹽敏感性，并且ng-ir4還表現(xiàn)出比ng-nip6更高的氯酸鹽敏感性，這證實(shí)了nrt1.1b粳稻-egfp和nrt1.1b秈稻-egfp融合蛋白的功能。對(duì)于不同時(shí)間點(diǎn)免疫印跡分析用chx(200μm)處理的對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因植物中的nrt1.1b粳稻-egfp和nrt1.1b秈稻-egfp。麗春紅(ponseaus)染色指示加載的蛋白量。如由免疫印跡分析所示，并未在nrt1.1b粳稻-egfp和nrt1.1b秈稻-egfp之間觀察到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的顯著差異。水稻的田間栽培.在以下三個(gè)實(shí)驗(yàn)站點(diǎn)，在2013年的常規(guī)水稻栽培季節(jié)期間進(jìn)行日本晴和nil的大規(guī)模田間試驗(yàn)：遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所(instituteofgeneticsanddevelopmentalbiology，北京)，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院(shanghaiacademyofagriculturalsciences，上海)，以及中國(guó)國(guó)家雜交水稻工程技術(shù)研究中心(chinanationalhybridriceresearchanddevelopmentcenter，湖南省長(zhǎng)沙市)。在中國(guó)大多數(shù)地區(qū)中，水稻栽培的正常氮供應(yīng)為約2kgn/100m2。因此，對(duì)于低氮(80％硝酸鹽與20％銨混合)條件，我們?cè)诒本┖蜕虾Ｊ褂?kgn/100m2，在長(zhǎng)沙使用0.6kgn/100m2，并且對(duì)于高n(80％硝酸鹽與20％銨混合)條件在所有三個(gè)地點(diǎn)使用2kgn/100m2。kno3和(nh4)2so4分別用作硝酸鹽和銨的來(lái)源。p2o5用作磷肥(0.5kgp/100m2)。植株之間的間距為20cm并且用于產(chǎn)量測(cè)試的樣地尺寸為3.24m2，包含100個(gè)植株。六次平行測(cè)定用于樣地產(chǎn)量測(cè)定。在以上提及的北京的相同栽培條件下，在2014年用轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行田間試驗(yàn)(將硝酸鹽用作主要氮肥)。農(nóng)學(xué)性狀分析.根據(jù)單植株基礎(chǔ)測(cè)量重要的農(nóng)學(xué)性狀，包括植株高度、每個(gè)穗的種子數(shù)目、結(jié)實(shí)率、每株植物的分蘗數(shù)、以及每株植物的谷粒產(chǎn)量。植株高度測(cè)定為主分蘗的高度。對(duì)于結(jié)實(shí)率測(cè)量，手工分離主穗的實(shí)粒和空粒(實(shí)粒/實(shí)粒+空粒)×100。收集單個(gè)植株的總實(shí)粒，在烘箱中于50℃干燥，以進(jìn)行每個(gè)植株的谷粒產(chǎn)量測(cè)量。隨機(jī)挑選實(shí)粒用于千粒重測(cè)量。收集單塊樣地中的所有谷粒并且如上所述處理以進(jìn)行實(shí)際產(chǎn)量測(cè)量。過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體.從cdna模板擴(kuò)增nrt1.1b-日本晴/ir24(1,791bp)的cds并克隆到二元載體pcambia2300-camv35s中，以產(chǎn)生nrt1.1b過(guò)表達(dá)載體。經(jīng)由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將所得的載體和空載體導(dǎo)入到粳稻品種zhonghua11中。另外，將包含啟動(dòng)子和編碼區(qū)的nrt1.1b-日本晴/ir24的基因組片段克隆到二元載體pcambia2300中。將所得的載體和空載體轉(zhuǎn)化到zhonghua11中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物以用于nrt1.1b-日本晴/ir24的功能分析。用于載體構(gòu)建的引物列出于表2中。葉綠素含量和光合速率測(cè)定.相對(duì)葉綠素含量用soilandplantanalyzerdevelopment(spad)葉綠素儀測(cè)定。利用li-6400便攜式光合作用系統(tǒng)(licor，usa)研究光合速率，固定的條件為1,200μm光子m-2s-1，400μmco2m-1和25℃。表4：田間日本晴(nip)和nil的農(nóng)學(xué)性狀將硝酸鹽用作主要氮肥。ln：低n，在北京(bj)和上海(sh)1kg/100m2，在長(zhǎng)沙(cs)0.6kg/100m2；hn：高n，在北京、上海和長(zhǎng)沙2kg/100m2。值為平均±sd(對(duì)于植株高度平行測(cè)定30次，并且對(duì)于每個(gè)穗的種子數(shù)目、結(jié)實(shí)率和千粒重平行測(cè)定6次)。p值由studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。實(shí)施例7：nrt1.1b的自然變異有助于秈稻與粳稻之間的硝酸鹽利用趨異度關(guān)鍵基因的自然變異強(qiáng)調(diào)了不同品種之間的發(fā)育和生理差異，并且作物中的這些基因可能在育種程序中具有很大的價(jià)值。秈稻和粳稻亞種之間的硝酸鹽吸收和利用率的顯著差異給出了這樣的機(jī)會(huì)：從水稻中分離控制硝酸鹽利用率/nue的自然變異基因。此處，我們的工作展示出硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白nrt1.1b的自然變異有助于該種硝酸鹽利用趨異度，這主要基于兩個(gè)結(jié)果：首先，nrt1.1b在cds中具有錯(cuò)義核苷酸變異的秈稻與粳稻亞種之間分歧(采用950份水稻種質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育分析)；第二，nrt1.1b-秈稻變異增強(qiáng)硝酸鹽利用的不同步驟，包括根攝入，根到苗運(yùn)輸，以及同化作用。這還為粳稻育種的硝酸鹽利用率/nue提高提供潛在的基因座。采用nil和轉(zhuǎn)基因植物的大規(guī)模田間試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)nrt1.1b-秈稻在粳稻nue提高中的應(yīng)用價(jià)值。我們需注意，nil中分蘗數(shù)的增加是谷粒產(chǎn)量提高的主要原因，而其它農(nóng)學(xué)性狀并未顯著改變(圖5d，圖7，11，和表4)。雖然一些農(nóng)學(xué)性狀稍有改變，但與nrt1.1b-粳稻轉(zhuǎn)基因植物相比，增加的分蘗數(shù)還是nrt1.1b-秈稻轉(zhuǎn)基因植物的主要生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)(圖6，圖7，和表5)。當(dāng)比較高氮(hn)和低氮(ln)之間的農(nóng)學(xué)性狀時(shí)，與響應(yīng)于氮可用性的谷粒產(chǎn)量相比，分蘗數(shù)的增加還是對(duì)于改善最有效的因素。這些結(jié)果指示，谷粒產(chǎn)量提高中nrt1.1b-秈稻的效應(yīng)符合由增大的氮可用性所引起的那些，這進(jìn)一步證實(shí)其在nue提高中的作用。因?yàn)閚rt1.1b主要參與硝酸鹽利用，由此，將硝酸鹽用作主要氮肥(80％硝酸鹽+20％銨)進(jìn)行該研究的大多數(shù)田間試驗(yàn)。當(dāng)將尿素用作氮肥時(shí)，nil中的nue也顯著增加(圖15)，然而，增加的水平(約15％)低于將硝酸鹽用作氮肥(約30％)的水平，因?yàn)樵谔镩g僅一部分尿素可通過(guò)硝化作用轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，這也支持了硝酸鹽利用率測(cè)定中所提出的nrt1.1b的作用。實(shí)施例8——nrt1.1b的變異改變硝酸鹽攝入和運(yùn)輸活性以及硝酸鹽信號(hào)化。除改善硝酸鹽攝入和運(yùn)輸活性(圖3a，b)之外，硝酸還原酶基因(osnia1和osnia2)的表達(dá)也通過(guò)nrt1.1b-秈稻顯著上調(diào)(圖3c，d)，這指示nrt1.1b變體還影響硝酸鹽應(yīng)答基因的表達(dá)。幾種硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(osnrt2.1、osnrt2.2、osnrt2.3a和osnrt1.5a)的表達(dá)分析示出它們也在nil中上調(diào)(圖13b)。然而，nrt1.1b突變體中的硝酸鹽誘導(dǎo)測(cè)定顯示出僅osnia1和osnia2(而非這些硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因)受到顯著阻遏(圖13a)，指示osnia1和osnia2可能為nrt1.1b-介導(dǎo)的硝酸鹽信號(hào)化中的下游基因。因此，nrt1.1b-秈稻的變異可能激活nrt1.1b下游基因的表達(dá)。就這些硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因而言，其上調(diào)可歸因于經(jīng)由nil中更高硝酸鹽積聚的前饋效應(yīng)。雖然這些硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的上調(diào)可部分有助于nil中更高的硝酸鹽積聚，但是nrt1.1b-秈稻的更高轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性應(yīng)當(dāng)是nil中增強(qiáng)的硝酸鹽攝入和運(yùn)輸?shù)闹饕颍驗(yàn)檫@些硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因僅略微上調(diào)。基于這些結(jié)果，據(jù)推論nrt1.1b-秈稻變異不僅改善硝酸鹽攝入和運(yùn)輸活性，還激活某些硝酸鹽應(yīng)答基因的表達(dá)，這很大程度上解釋了硝酸鹽利用率測(cè)定中nrt1.1b的重要作用。因?yàn)閚rt1.1b是chl1的近同系物，數(shù)據(jù)還指示nrt1.1b可能用作硝酸鹽傳感蛋白/轉(zhuǎn)運(yùn)受體。nrt1.1b的自然變異可影響硝酸鹽感應(yīng)和信號(hào)化，這有助于秈稻中更高的nue?？赡艿氖牵齩snia1和osnia2之外，參與硝酸鹽利用的某些其它未鑒定的組分還可由nrt1.1b-秈稻變異來(lái)上調(diào)。nue測(cè)定中的nrt1.1b作用可取決于其在硝酸鹽信號(hào)化中的功能。nrt1.1b的單氨基酸置換(327t/m)發(fā)生在中心胞質(zhì)環(huán)(ccl)。結(jié)構(gòu)柔韌性可通過(guò)這種氨基酸置換來(lái)改變，其隨后導(dǎo)致運(yùn)輸活性/信號(hào)化改變。nrt1.1b-秈稻/粳稻的晶體結(jié)構(gòu)分析可確認(rèn)該假說(shuō)。另外，氨基酸置換還可導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改變。對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中nrt1.1b(秈稻/粳稻)-egfp融合蛋白的穩(wěn)定性進(jìn)行分析并且發(fā)現(xiàn)，在nrt1.1b的兩個(gè)變體之間不存在顯著的差異，這排除了這種可能性。實(shí)施例9：人工選擇nrt1.1b-秈稻和栽培水稻中的硝酸鹽利用趨異度在秈稻馴養(yǎng)期間，nrt1.1b可為人工選擇的目標(biāo)。一種可能的解釋是，更好的生長(zhǎng)性能或更高的產(chǎn)量可為先祖選擇的主要性狀。因?yàn)樘貏e是在氮濃度相對(duì)較低的土壤下，氮極大地確定了生長(zhǎng)性能和谷粒產(chǎn)量，所以可選擇nue更高的水稻以用于進(jìn)一步栽培。極有可能在秈稻馴養(yǎng)最開(kāi)始時(shí)選擇硝酸鹽利用活性較高的后來(lái)得到的等位基因nrt1.1b-秈稻，因?yàn)閹缀跛械亩i稻品種都攜帶nrt1.1b-秈稻基因座。而在粳稻中，此類(lèi)人工選擇不可能發(fā)生，因?yàn)橥蛔兊牡任换虿淮嬖谟谄渲苯幼嫦戎?。這也對(duì)秈稻和粳稻亞種之間硝酸鹽利用趨異度的起因給出了適當(dāng)解釋。因?yàn)閚rt1.1b在秈稻和粳稻之間高度分歧，表明所有的粳稻品種可通過(guò)基因滲入nrt1.1b-秈稻來(lái)改善。將硝酸鹽用作主要氮肥。ln：低氮，1kgn/100m2；hn：高氮，2kgn/100m2。使用含有受camv35s啟動(dòng)子控制的nrt1.1b-粳稻(nip-3)/秈稻(ir-3)的轉(zhuǎn)基因植物以及含有受其天然啟動(dòng)子控制的nrt1.1b-粳稻(gnip-2)/秈稻(gir-3)的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行農(nóng)學(xué)性狀研究。p值由nrt1.1b-粳稻與nrt1.1b-秈稻轉(zhuǎn)基因植物之間的studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生。ev1為pcambia2300-camv35s空載體轉(zhuǎn)基因植物。ev2為pcambia2300空載體轉(zhuǎn)基因植物。表5：田間nrt1.1b-秈稻/粳稻轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)性狀。已結(jié)合各個(gè)具體的和優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)描述了本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，在保持在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)的情況下可以作出許多變化和修改。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所<120>植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其用途<130>nrt1.1b<150>cn201410495440.9<151>2014-09-24<160>109<170>patentin版本3.5<210>1<211>1791<212>dna<213>水稻<400>1atggcgatggtgttgccggagacggcggcggaggggaaggcgctgacggacgcgtggg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