一種用于菜豆毒性的快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于菜豆毒性的快速檢測方法，將菜豆處理為浸提液后，測定浸提液中的凝集素含量，利用多元回歸方程Y2＝30.837+4.5X1計(jì)算出菜豆的毒性水平，式中：X1為植物凝集素含量，Y2代表小鼠細(xì)胞生長影響率。對新的菜豆種質(zhì)通過控制在相同條件下的凝集素的測定，求出其Y2值，就可以判別其毒性水平。本方法系統(tǒng)性、綜合性強(qiáng)；方法操作簡便，適應(yīng)性廣，可助其他植物毒性評價(jià)借鑒；能判別未知菜豆毒性；預(yù)測菜豆毒性水平的準(zhǔn)確性高。
【專利說明】-種用于菜豆毒性的快速檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到蔬菜作物毒性高低的評價(jià)，具體地指一種用于菜豆毒性的快速檢測 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 菜豆（Phaseolus vulgaris L.)屬豆科（Leguminosa)、蝶型花亞科 (Papilionideae) -年生草本植物。它是世界上種植面積最大的食用豆類，占全球食用豆產(chǎn) 量的50% (除大豆外）。分為食芙菜豆和糧用普通菜豆，食芙菜豆?fàn)I養(yǎng)豐富，低脂高蛋白， 并富含礦物質(zhì)W及多種維生素，是世界性重要作物。
[0003] 菜豆食用時(shí)如果加工不當(dāng)易導(dǎo)致人體四肢麻木，燒灼型胃疼，頭痛、胸悶等神經(jīng)系 統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重者昏迷，甚至可造成也腎肝多臟器損害或?qū)е虑伤?。我國是菜豆種植和消費(fèi)大 國，食芙菜豆中毒事件時(shí)有發(fā)生，其中集體中毒事件也偶有出現(xiàn)，因此各地衛(wèi)生部口紛紛限 制集體食堂采購菜豆，給菜豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展蒙上了陰影。
[0004] 研究表明菜豆中主要致毒物為植物凝集素和皂巧，膜蛋白酶抑制劑及植酸等可促 進(jìn)中毒的發(fā)生或加重中毒的癥狀。因此，菜豆食物中毒是由豆芙中多種特殊化學(xué)成分引起 的綜合致毒。高溫烹煮可W消除該些致毒物的毒性，但也會破壞其它的營養(yǎng)成分。雖然烹 巧中的高溫處理能去除菜豆的毒性，但不能從根本上解決菜豆食物中毒隱患。種質(zhì)是農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)的源頭，培育植物新品種是提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)的最為簡單有效的方式。因此需要從遺 傳改良著手，降低、剔除或者提高豆類植物自身的有毒成分，育成低毒、無毒或高毒的菜豆 新品種W滿足市場的胚盛需求。
[0005] 當(dāng)前菜豆新品種選育工作目標(biāo)主要集中豐產(chǎn)、熟性、抗性和一般營養(yǎng)成分等方面。 對于毒性方面的相關(guān)報(bào)道很多，也有極少關(guān)于菜豆某種抗?fàn)I養(yǎng)因子毒性的研究，但對于菜 豆綜合毒性的檢測依然缺乏系統(tǒng)的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是要解決上述【背景技術(shù)】的不足，提供一種用于菜豆毒性的快速檢 測方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為；一種用于菜豆毒性的快速檢測方法，其特征在于它是將菜 豆處理為浸提液后，測定浸提液中的凝集素含量，利用多元回歸方程Ys = 30. 837+4. 5Xi計(jì) 算出菜豆的毒性水平，式中：Xi為植物凝集素含量，Y,代表小鼠細(xì)胞生長影響率。
[0008] 優(yōu)選的，所述浸提液處理步驟為；將菜豆鮮芙打碎成漿后，稱取勻漿5g于錐形瓶 中，加入IOml PBS (磯酸鹽緩沖液，抑=7. 4)，12化pm震蕩提取30min，4°C下磁力攬拌過 夜，800化pm離也IOmin取上清，過0. 22 y m微孔濾膜除菌備用。
[0009] 優(yōu)選的，Yg > 50,表不該品種毒性局；50 > Yg > 35,表不該品種毒性中等；Yg《35， 表示該品種毒性低。
[0010] 本發(fā)明克服了傳統(tǒng)的評價(jià)方法不集中、綜合性差、評價(jià)效果不準(zhǔn)確，不能建立毒性 評價(jià)模型等缺點(diǎn)；本發(fā)明系統(tǒng)性、綜合性強(qiáng)；方法操作簡便，適應(yīng)性廣，可助其他植物毒性 評價(jià)借鑒；能判別未知菜豆毒性；預(yù)測菜豆毒性水平的準(zhǔn)確性高。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0012] 菜豆浸提液制備：取開花后15天的菜豆成熟商品芙，將菜豆鮮芙打碎成漿后，稱 取勻漿5g于錐形瓶中，加入IOml PBS (磯酸鹽緩沖液，pH = 7. 4)，12化pm震蕩提取30min， 4°C下磁力攬拌過夜，800化pm離也IOmin取上清，過0. 22 y m微孔濾膜除菌備用。
[0013] 菜豆抗?fàn)I養(yǎng)因子含量和活性的檢測；（1)制備標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞溶液（濃度為8X106， 在490nm處具有最大吸收值），利用植物凝集素對紅細(xì)胞具有凝集作用，使得紅細(xì)胞溶液 吸光度降低，且下降程度同植物凝集素含量成正比，用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度值變 化，求得凝集素含量。（2)參照《酶標(biāo)儀H波長比色法定量測定大豆總皂式》，測定菜豆中 皂巧的含量；（3)參照《大豆制品中膜蛋白酶抑制劑活性的測定》（GB/T 21498-2008/IS0 14902:2001)，測定菜豆中膜蛋白酶抑制劑的活性；(4)參照《植物性食品中植酸的測定》 佑B/T 5009. 153-2003)，測定菜豆中植酸的含量；
[0014] 脾臟淋己細(xì)胞制備；取小鼠一只，引頸椎脫白處死后，浸入75 %酒精消毒3? 5min，提出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)，右側(cè)向上放入解剖盤中，綴子夾起下腹部皮毛，剪刀剪一橫 向開口，左右兩手分別持綴子兩邊撕開，剪開內(nèi)膜，采出脾臟，浸入PBS淋洗1?2次，轉(zhuǎn)入 含1. 5ml 1640的無菌培養(yǎng)皿中待用。取2ml淋己分離液于37C培養(yǎng)箱預(yù)熱30min。將2ml、 5ml注射器針頭彎曲為L型，持2ml注射器吸取0.2ml 1640沿縱軸插入脾中注射。用針頭 在脾兩頭扎孔，L型針頭水平刮出脾細(xì)胞，將脾的殘骸丟掉，分別用5ml和2ml注射器將脾 臟細(xì)胞吹打均勻。將細(xì)胞息浮液沿離也管壁緩慢加入含淋己分離液的離也管中，20(K)rpm離 也30min后，吸取第二層灰白液體轉(zhuǎn)移至EP管中，加入2ml 1640培養(yǎng)液清洗細(xì)胞，SOO^m 離也lOmin，棄上清，反復(fù)2?3次。將細(xì)胞息液加至6孔板中，放入培養(yǎng)箱（37C，5% C〇2) 中培養(yǎng)4她。
[00巧]MTS法檢測細(xì)胞生長情況：取出6孔板吹打均勻，吸取細(xì)胞息液至試管，150化pm離 也3min，加Iml 1640培養(yǎng)基重息。取IOul細(xì)胞息液稀釋10倍至IOOul,再取適量IOul到 細(xì)胞計(jì)數(shù)板，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)得出活細(xì)胞數(shù)后，調(diào)細(xì)胞濃度至8 X IO6個(gè)/ y 1。將細(xì)胞息 浮液鋪板，其中空白對照每孔加入PBS 50 y 1和培養(yǎng)基50 y 1 ;陰性對照每孔加入細(xì)胞息液 50 ill和PBS 50 ill ;待測孔每孔加入細(xì)胞息液50 ill和不同品種的菜豆浸提液50 y 1。將 96孔板邊緣孔W PBS液封，低速離也機(jī)50化pm離也1?2分鐘，于培養(yǎng)箱（37C 5 % C〇2) 中培養(yǎng)4她后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，倒置顯微鏡下觀察，每孔無菌避光加入10 y 1 MTS，包裹錫 紙，SOOrpm離也1?2分鐘，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)化，取出培養(yǎng)板，去掉蓋子，放入酶標(biāo)儀 中，490nm下記錄每孔的吸光度。
[0016] 菜豆毒性預(yù)測模型的建立；結(jié)合抗?fàn)I養(yǎng)因子含量或活性測定結(jié)果及MTS實(shí)驗(yàn)結(jié) 果，W小鼠細(xì)胞生長影響率炸2)為因變量，W抗?fàn)I養(yǎng)因子含量或活性為自變量。通過Spss 軟件采用強(qiáng)行進(jìn)入法得到模型，依據(jù)其回歸系數(shù)表（見表1)，最終得到多元回歸方程：
[0017] 表1回歸系數(shù)
[0018]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于菜豆毒性的快速檢測方法，其特征在于將菜豆處理為浸提液后，測定浸提 液中的凝集素含量，利用多元回歸方程Y 2 = 30. 837+4. 5?計(jì)算出菜豆的毒性水平，式中：Xi 為植物凝集素含量，Y2代表小鼠細(xì)胞生長影響率。
2. 如權(quán)利要求1所述用于菜豆毒性的快速檢測方法，其特征在于所述浸提液處理步 驟為：將菜豆鮮莢打碎成漿后，稱取勻漿5g于錐形瓶中，加入10ml PBS，120rpm震蕩提取 30η?η，4·?下磁力攪拌過夜，8000rpm離心lOmin取上清，過0. 22 μ m微孔濾膜除菌備用。
3. 如權(quán)利要求2所述用于菜豆毒性的快速檢測方法，其特征在于所述Y2 > 50,表示該 品種毒性商；50 > Υ2 > 35,表不該品種毒性中等；Υ2 < 35,表不該品種毒性低。
【文檔編號】G01N33/02GK104237474SQ201410413634
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月20日
【發(fā)明者】陳禪友, 尚蕊, 李佳楠, 吳華, 胡志輝, 郭瑞, 潘磊 申請人:江漢大學(xué)