一種快速檢測(cè)樣品中靶核酸的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)樣品中靶核酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸分子雜交（簡(jiǎn)稱分子雜交，hybridization)是核酸研究中一項(xiàng)最基本的實(shí)驗(yàn) 技術(shù)，其基本原理就是應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì)，使來(lái)源不同的DNA(或RNA)片 段，按堿基互補(bǔ)關(guān)系形成雜交雙鏈分子。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間，也可在RNA與 DNA鏈之間形成。目前，分子雜交技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中最常用的非放射性 基因診斷技術(shù)之一，其不僅可用來(lái)檢測(cè)引起癌變的基因突變和引起各種遺傳性疾?。ㄈ绲?中海貧血）的基因突變，而且可用來(lái)檢測(cè)引起感染性疾病的細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等。
[0003] 按照反應(yīng)進(jìn)行的環(huán)境不同，分子雜交可分為固相雜交和液相雜交兩種類(lèi)型。按照 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同應(yīng)用目的，分子雜交又可分為斑點(diǎn)（或狹縫）雜交、Southern印跡雜交、 Northern雜交、細(xì)胞以及染色體原位雜交等。
[0004] 固相分子雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固相支持物上，一條反應(yīng)核酸 游離在溶液中。按照被檢測(cè)樣品分子所在位置不同，固相分子雜交可分為正向雜交（待測(cè) 樣品分子固定在膜上，檢測(cè)探針在溶液中）和反向雜交（待測(cè)樣品分子在溶液中，而探檢測(cè) 針固定在膜上）兩種。其中，反向雜交是指用標(biāo)記的樣品核酸與未標(biāo)記的固化核酸探針進(jìn) 行雜交。這種雜交方法的優(yōu)點(diǎn)是在一次雜交反應(yīng)中，可同時(shí)檢測(cè)樣品中的多種核酸。
[0005] 現(xiàn)有的反向雜交技術(shù)操作繁瑣，涉及的反應(yīng)溶液和反應(yīng)步驟眾多，尤其當(dāng)涉及檢 測(cè)多個(gè)樣品時(shí)，操作時(shí)間將會(huì)大大加長(zhǎng)而且極易出錯(cuò)。例如，中國(guó)專利申請(qǐng)CN101768628A 中公開(kāi)了一種檢測(cè)核酸點(diǎn)突變的方法，具體公開(kāi)了一種利用寡核苷酸探針對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行 反向雜交以檢測(cè)核酸點(diǎn)突變的方法，但是該方法需要借助價(jià)格高昂熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行雜交 結(jié)果的測(cè)試，不僅操作繁瑣，而且成本較高。因此，亟需要一種快速檢測(cè)樣品中靶核酸的方 法。
[0006] 出于這種考慮，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了研究，目的是解決相關(guān)領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)所暴 露出來(lái)的問(wèn)題，期望提供一種耗時(shí)短、易操作、高通量、成本低的快速檢測(cè)樣品中靶核酸的 方法以及其在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種快速檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，該方法一方面將 核酸反向分子雜交過(guò)程與酶聯(lián)過(guò)程合二為一進(jìn)行，可以在固相支持物表面直接形成堿性磷 酸酶標(biāo)記標(biāo)記核酸雜交體的偶聯(lián)物；另一方面將洗滌與顯色反應(yīng)合二為一進(jìn)行，直接在顯 色溶液中通過(guò)酶促反應(yīng)使底物形成有色產(chǎn)物而顯色，從而在雜交反應(yīng)后無(wú)需經(jīng)過(guò)單獨(dú)的洗 滌步驟就可以快速實(shí)現(xiàn)樣品中靶核酸檢測(cè)的目的。
[0008] 本發(fā)明的又一目的在于提供所述方法在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因中的應(yīng)用。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，其包括如 下步驟：
[0010] A)將固定于固相支持物表面的至少一種核酸探針在包含堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親 和素的雜交液中與生物素標(biāo)記的靶核酸進(jìn)行一步反應(yīng)；
[0011] B)步驟A)中反應(yīng)完成后，直接將固相支持物表面與包含底物的顯色溶液接觸進(jìn) 行顯色反應(yīng)，以檢測(cè)樣品中的靶核酸。
[0012] 本發(fā)明的方法直接將堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素加入到雜交液中，在核酸探針與 靶核酸雜交的過(guò)程中，同步實(shí)現(xiàn)了堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素與生物素的結(jié)合過(guò)程，從而 可以在固相支持物表面形成堿性磷酸酶標(biāo)記核酸雜交體的偶聯(lián)物，省去了傳統(tǒng)反向分子雜 交方法中在雜交反應(yīng)后需要單獨(dú)進(jìn)行酶聯(lián)反應(yīng)的步驟以及其他多個(gè)操作步驟，極大縮短了 傳統(tǒng)方法檢測(cè)靶核酸的耗時(shí)。
[0013] 在本發(fā)明的方法中，所述堿性磷酸酶是一種同源二聚體蛋白，是一種含鋅的金屬 酶。每分子酶至少含2個(gè)Zn原子。酶上包含3種類(lèi)型的金屬結(jié)合位點(diǎn)，即所謂的催化結(jié)合 位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)和調(diào)節(jié)結(jié)合位點(diǎn)。其中兩個(gè)催化結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合則只會(huì)導(dǎo)致一個(gè)亞單 位的磷酸化，即負(fù)協(xié)作亞單位之間發(fā)生相互作用。
[0014] 在本發(fā)明的方法中，所述生物素有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)I和II。其中，I環(huán)為咪唑酮環(huán)， 是其與鏈霉親和素結(jié)合的主要部位；II環(huán)為噻吩環(huán)，C2上有一戊酸側(cè)鏈；生物素分子通過(guò) 其末端的羧基與本發(fā)明所述的靶核酸連接，從而標(biāo)記在靶核酸分子上。
[0015] 在本發(fā)明的方法中，所述鏈霉親和素是由鏈霉菌分泌的一種蛋白質(zhì)，其分子由4 條相同的肽鏈組成，每條肽鏈都能結(jié)合一個(gè)生物素，因此每個(gè)鏈霉親和素分子能結(jié)合4個(gè) 生物素分子。此外，每條肽鏈的氨基酸組成中，甘氨酸和丙氨酸的含量較大，肽鏈中的色氨 酸殘基是連接生物素的活性基團(tuán)。所述鏈霉親和素與生物素二者親和結(jié)合的常數(shù)（K)為 1015L/mol。在本發(fā)明的方法中，靶核酸與核酸探針雜交的同時(shí)，鏈霉親和素與生物素也進(jìn) 行親和結(jié)合，因此雜交液中的堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素分子與固定在固相支持物表面的 核酸探針?lè)肿釉谝徊椒磻?yīng)中競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合生物素標(biāo)記的靶核酸分子。
[0016] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)與創(chuàng)造性勞動(dòng)發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的方法中，將所述堿 性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素直接加入到雜交液中，一方面能夠使得堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和 素與生物素標(biāo)記靶核酸充分的結(jié)合；另一方面還能夠促進(jìn)核酸雜交效率，縮短核酸雜交反 應(yīng)的時(shí)間。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，步驟A)中所述堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素在雜 交液中的濃度為〇· 05~2μg/ml，優(yōu)選0· 1~1. 5μg/ml，更優(yōu)選0· 5~1. 2μg/ml。在 本發(fā)明的方法中，可以列舉的所述堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素在雜交液中的濃度包括但不 限于：〇· 05μg/ml、0. 06μg/ml、0. 07μg/ml、0. 08μg/ml、0. 09μg/ml、0. 1μg/ml、0. 2μg/ ml、0. 3μg/ml、0. 4μg/ml、0. 5μg/ml、0. 6μg/ml、0. 7μg/ml、0. 8μg/ml、0. 9μg/ml、 1μg/ml、L1μg/ml、L2μg/ml、L5μg/ml和 2μg/ml〇
[0018] 在本發(fā)明的方法中，所述堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素在雜交液中的濃度是本發(fā)明 的重要方面。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)與創(chuàng)造性勞動(dòng)發(fā)現(xiàn)，如果堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉 親和素在雜交液中的濃度過(guò)低，那么影響靶核酸檢測(cè)的靈敏度；如果堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉 親和素在雜交液中的濃度過(guò)高，那么容易帶來(lái)非特異性吸附現(xiàn)象，影響靶核酸檢測(cè)結(jié)果的 準(zhǔn)確性。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，步驟A)中所述雜交液包括鋅離子、鎂離子、蛋白、 非離子型表面活性劑和陽(yáng)離子型聚合物；其中，所述蛋白選自白蛋白、酪蛋白和明膠，所述 非離子型表面活性劑選自吐溫和曲拉通，所述陽(yáng)離子型聚合物選自陽(yáng)離子聚丙烯酰胺、多 聚賴氨酸和聚合氯化鋁。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，在所述雜交液中，鋅離子為0. 001~0.lmol/L，鎂 離子為0. 001~0.lmol/L，蛋白占雜交液的1%~10% (w/v)，非離子型表面活性劑占雜交 液的0. 01~2% (v/v)，陽(yáng)離子型聚合物占雜交液的0. 01~0. 5% (w/v);優(yōu)選地，鋅離子 為0· 005~0· 05mol/L，緩離子為0· 005~0· 05mol/L，蛋白占雜交液的1 %~5 % (w/v)，非 離子型表面活性劑占雜交液的〇. 05~1 % (v/v)，陽(yáng)離子型聚合物占雜交液體積的0. 05~ 0. 2% (w/v) 〇
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，所述鋅離子可以選自含鋅離子的可溶性鹽?？捎?作本發(fā)明的所述含鋅離子的可溶性鹽的實(shí)例包括：硫酸鋅、氯化鋅以及其他各種在溶液狀 態(tài)可以解離出鋅離子的鹽。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，所述鎂離子可以選自含鎂離子的可溶性鹽?？捎?作本發(fā)明的所述含鎂離子的可溶性鹽的實(shí)例包括：硫酸鎂、乙酸鎂、氯化鎂以及其他各種在 溶液狀態(tài)可以解離出鎂離子的鹽。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，所述吐溫選自吐溫20 (Tween-20)、吐溫 21(Tween-21)、吐溫 40(Tween-40)、吐溫 60(Tween-60)、吐溫 61(Tween-61)、吐溫 80 (Tween-80)、吐溫81 (Tween-81)和吐溫85 (Tween-85)，其中吐溫20是特別優(yōu)選的。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，所述曲拉通選自曲拉通X-100(TritonX-100)、曲 拉通X-114(TritonX-114)和曲拉通X-200(TritonX-200)，其中，曲拉通X-100是特別優(yōu) 選的。
[0025] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)與創(chuàng)造性勞動(dòng)發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的方法中，酸、堿、鹽 離子或溫度條件的變化都可能會(huì)改變甚至使堿性磷酸酶完全失去活性，因此為了實(shí)現(xiàn)本發(fā) 明的目的之一，雜交液成分的選擇是極為重要的。在本發(fā)明的方法中，發(fā)明人通過(guò)在雜交液 中添加鋅離子、鎂離子、蛋白和非離子型表面活性劑，一方面有助于提高核酸雜交效率，另 一方面防止雜交液中的堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素因吸附而變性，再一方面防止堿性磷酸 酶