一種在線快速檢測(cè)樣品總抗氧化性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用高效液相色譜和自由基檢測(cè)系統(tǒng)在 線快速檢測(cè)樣品總抗氧化性的方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]自20世紀(jì)80年代，出于對(duì)人工合成的抗氧化劑的安全性考慮，人們?cè)絹?lái)越傾向于 開(kāi)發(fā)使用天然的抗氧化劑。從草藥、水果和蔬菜中分離植物成分用作食品、化妝品和藥品中 的防腐劑成為研究熱點(diǎn)。例如水果、蔬菜，牛奶，脂肪、蛋黃和海魚(yú)都是很好的抗氧化物質(zhì)來(lái) 源。目前已經(jīng)報(bào)道，具有潛在的抗氧化性的天然抗氧化物質(zhì)有：茶多酚、大豆異黃酮、枸杞多 糖、天然蝦青素、黃體素、硫辛酸、α-亞麻酸（ALA)、番茄紅、維生素E、維生素C、β-胡蘿卜 素、輔酶Q10、超氧化物歧化酶（S0D)、大豆肽、肌肽和谷胱甘肽、金屬硫蛋白、硒，大蒜中的 硫化物，等。
[0004]目前，評(píng)價(jià)生物活性物質(zhì)抗氧化能力的研究已經(jīng)在全世界得到廣泛關(guān)注。隨著高 效液相色譜，質(zhì)譜技術(shù)及以核磁共振等現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展，抗氧化活性研究也出 現(xiàn)了在線抗氧化檢測(cè)系統(tǒng)。大部分報(bào)道是指與HPLC聯(lián)用的抗氧化在線檢測(cè)技術(shù)。例如在線 HPLC-RSD(HighPerformanceLiquidChromatography-RadicalScavengerDetection) 或者HPLC-RSD-NMR/MS分析抗氧化活性系統(tǒng)。HPLC在線（On-line)抗氧化檢測(cè)系統(tǒng)是指通 過(guò)HPLC系統(tǒng)與柱后自由基衍生系統(tǒng)連接起來(lái)，實(shí)現(xiàn)HPLC系統(tǒng)對(duì)樣品中目的化合物質(zhì)的洗 脫及分離，這些化合物洗脫出來(lái)，隨流動(dòng)相進(jìn)入柱后自由基衍生系統(tǒng)，同時(shí)檢測(cè)器檢測(cè)化合 物清除自由基的能力。通常以自由基溶液色譜倒峰圖體現(xiàn)。倒峰圖面積越大，代表自由及 被清除的越多，代表樣品的抗氧化性強(qiáng)。同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)濃度與負(fù)峰面積建立標(biāo) 準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)抗氧化當(dāng)量換算，從而實(shí)現(xiàn)分析樣品的抗氧化活性。相對(duì)與在線檢測(cè)方 法，文中提到的傳統(tǒng)抗氧化研究方法稱為非在（Off-line)法。HPLC聯(lián)用的在線系統(tǒng)克服了 傳統(tǒng)非在線抗氧化劑篩選方法純化步驟繁瑣，化合物提取、純化和抗氧化性測(cè)定多步操作， 費(fèi)時(shí)和費(fèi)力的問(wèn)題。HPLC聯(lián)用的在線系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)高效、快速對(duì)植物或食品中的天然抗氧 化物質(zhì)進(jìn)行分離、定性、定量的研究。高效液相色譜技術(shù)可以減少樣品前處理的樣品純化步 驟，直接檢測(cè)；生物化學(xué)檢測(cè)柱后衍生系統(tǒng)的聯(lián)用，有利于分析色譜系統(tǒng)分離出化合物的生 物活性。王小淞等選取DPPH自由基為檢測(cè) 用自由基，檢測(cè)了黃芩根提取物中的抗氧化活性成分。張雷等、傅茂潤(rùn)等也以相似的的 方法檢測(cè)了茶葉、紫薯中的抗氧化物質(zhì)。DPPH自由基穩(wěn)定，系統(tǒng)組成與使用ABTS自由基類(lèi) 似，但靈敏度不及ABTS自由基。裴世春等、高翔等、耿雪飛等利用ABTS自由基聯(lián)用HPLC 檢測(cè)植物材料中抗氧化物質(zhì)。西北農(nóng)林科技大學(xué)申請(qǐng)了利用ABTS自由基檢測(cè)混合物中抗 氧化活性物質(zhì)的發(fā)明專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)?01110330342. 6)。
[0005]物質(zhì)總抗氧化能力（TotalAntioxidantCapacity)是物質(zhì)清除不同的自由基或 者是物質(zhì)的不同活性成分、清除不同的自由基的有效和。由于樣品總抗氧化活性的好壞， 是篩選天然抗氧化資源的依據(jù)，也是進(jìn)行抗氧化活性物質(zhì)分離和鑒定的理論依據(jù)。評(píng)價(jià)物 質(zhì)的總抗氧化活性是很有必要的。目前國(guó)內(nèi)外常用的測(cè)定總抗氧化活性的方法有DPPH法， ABTS法，ORAC法，F(xiàn)RAP法。但是這些方法對(duì)于大規(guī)模的分析植物樣品存在著操作步驟繁瑣， 耗時(shí)耗力的缺點(diǎn)。大規(guī)模分析樣品的總抗氧化性有望依賴目前已經(jīng)報(bào)道HPLC在線檢測(cè)系 統(tǒng)。ORAC法（由于其實(shí)驗(yàn)過(guò)程中熒光物質(zhì)對(duì)pH敏感）和FRAP法（由于實(shí)驗(yàn)操作繁瑣）， 都太不利于在線抗氧化檢測(cè)。自由基捕獲法，其自由基化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，反應(yīng)迅速適用于HPLC 在線抗氧化檢測(cè)。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了HPLC-DPPH法和HPLC-ABTS法在線檢測(cè)植物樣品抗氧化 性活性。但是目前報(bào)道的HPLC-DPPH/ABTS法的特點(diǎn)是在線分析單個(gè)化合物的抗氧化性，對(duì) 與總混合物的抗氧化活性并不能直接且快速的測(cè)定。關(guān)于HPLC-在線快速檢測(cè)樣品的總抗 氧化活性研究未見(jiàn)報(bào)道。所以，急需要建立一種快速的分析總抗氧化性的測(cè)定方法，并可以 被科研或工業(yè)所利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的分析物質(zhì)總抗氧化性的測(cè)定方法中存在的技術(shù)缺陷， 提供一種能夠快速，準(zhǔn)確地測(cè)定樣品的總抗氧化性的方法，本發(fā)明方法測(cè)定過(guò)程中色譜圖 峰型完整、美觀，無(wú)拖尾現(xiàn)象；測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、快速、選擇性強(qiáng)而且靈敏度高。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為： 一種在線快速檢測(cè)樣品總抗氧化性的方法，是利用HPLC-FRSD分析系統(tǒng)檢測(cè)樣品總抗 氧化性的分析方法，所述HPLC-FRSD分析系統(tǒng)包括相互連接的高效液相色譜分析儀和自由 基反應(yīng)檢測(cè)裝置，所述高效液相色譜分析儀包括依次連接的進(jìn)樣器、四元梯度泵、色譜分析 柱及柱溫箱和光電二極管陣列PAD檢測(cè)器；所述自由基反應(yīng)檢測(cè)裝置包括自由基反應(yīng)模 件、控溫箱、高壓泵和紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器，所述自由基反應(yīng)模件與高效液相色譜儀相連接， 所述控溫箱控制自由基反應(yīng)模件溫度，高壓泵與自由基反應(yīng)模件連接，自由基反應(yīng)模件與 紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器相連接；所述色譜分析柱用C18反相色譜柱，型號(hào)為20X3. 9_，5um;所 述的自由基為化學(xué)自由基；所述的在線快速檢測(cè)樣品總抗氧化性的方法包括如下進(jìn)行的步 驟： (1) 以體積分?jǐn)?shù)為80-90%的甲醇，或者是其它具有相似極性的有機(jī)溶劑或所述有機(jī)溶 劑的混合物作為溶媒，于40-60°C超聲波提取10_50min，再震蕩提取l-15h，得提取液； (2) 將步驟（1)所得的提取液離心、分離，得上清液； (3) 配制一系列濃度梯度的維生素C水溶液作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行在線HPLC-FRSD分析， 建立負(fù)峰面積（Y)和相對(duì)應(yīng)VC濃度（X)的線性方程； (4) 將步驟（2)中所得上清液經(jīng)0. 22微米有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行上樣分析，將HPLC-FRSD 系統(tǒng)測(cè)得的樣品負(fù)峰面積帶入步驟（3)的線性方程，換算成維生素C當(dāng)量，以求得各樣品甲 醇提取物的抗氧化值。
[0008] 進(jìn)一步，所述的一種在線快速檢測(cè)樣品總抗氧化性的方法，所述樣品為植物固體 樣品時(shí)，將植物固體樣品干燥粉碎過(guò)60-100目篩再進(jìn)行步驟（1)的操作。
[0009] 進(jìn)一步，所述的一種在線快速檢測(cè)樣品總抗氧化性的方法，所述化學(xué)自由基選擇DPPH自由基或ABTS自由基。
[0010] 進(jìn)一步，所述的一種在線快速檢測(cè)樣品總抗氧化性的方法，所述DPPH自由基溶液 濃度為0. 2mM，DPPH自由基溶液檢測(cè)波長(zhǎng)為517nm。
[0011] 進(jìn)一步，所述的一種在線快速檢測(cè)樣品總抗氧化性的方法，所述ABTS自由基溶液 的濃度為在400nm時(shí)吸光度為0.70 ± 0.02AU吸光值的濃度。
[0012] 進(jìn)一步，所述的一種在線快速檢測(cè)樣品總抗氧化性的方法，所述高效液相色譜分 析儀使用的流動(dòng)相為〇. 1%(V醋酸：V水=1:999)醋酸水溶液和甲醇的混合液，所述0. 1%醋 酸水溶液體積分?jǐn)?shù)為37%，甲醇體積分?jǐn)?shù)為63%。
[0013] 進(jìn)一步，所述的一種在線快速檢測(cè)樣品總抗氧化性的方法，所述流動(dòng)相的流速為 0. 91mLmin1 ;所述柱溫箱設(shè)置的柱溫為30°C，所述PAD檢測(cè)器PAD檢測(cè)波長(zhǎng)：2D通道分 別設(shè)置283nm和245nm。
[0014] 進(jìn)一步，所述的一種在線快速檢測(cè)樣品總抗氧化性的方法，所述自由基的引入流 速為0. 80mLmin\所述控溫箱設(shè)置的溫度為30°C。
[0015] -種在線快速檢測(cè)柑橘樣品總抗氧化性的方法，是利用HPLC-FRSD分析系統(tǒng)檢測(cè) 柑橘樣品總抗氧化性的分析方法，所述HPLC-FRSD分析系統(tǒng)包括相互連接的高效液相色 譜分析儀和自由基反應(yīng)檢測(cè)裝置，