一種快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，由黃色葡萄球菌引起的食物中毒是越來越多的，據(jù)美國疾病控制中心報(bào)告表示，由金黃色葡萄球菌引起的細(xì)菌性食物中毒是居首位的，占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33 %，加拿大甚至高達(dá)45 %。金黃色葡萄球菌是食物中毒、菌群失調(diào)性腹瀉的主要病原體，其不僅在食品污染中占據(jù)著十分重要的位置，同時(shí)也是臨床上非常重要的感染病原體之一，它與艾滋病、乙型肝炎并列為世界的三大感染頑疾。
[0003]現(xiàn)今，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測(cè)法、核酸檢測(cè)法和分離鑒定法等，其中，分離鑒定法耗時(shí)耗力，而其它兩種方法要求均微生物信號(hào)的轉(zhuǎn)化、富集，近年來，利用量子點(diǎn)的熒光特性以及功能磁珠的快速分離富集的方法被廣泛的應(yīng)用，但是，該法的檢測(cè)效率高低部分取決于磁珠的捕獲效率，降低了檢測(cè)信號(hào)的富集。而本發(fā)明中描述的使用無菌注射器和濾膜組合進(jìn)行信號(hào)富集，由于是對(duì)所有菌體的攔截，這就保證了檢測(cè)信號(hào)的有效富集，同時(shí)對(duì)于過濾而出的CdTe量子點(diǎn)和抗體的復(fù)合物可進(jìn)行重復(fù)循環(huán)使用，增加了抗體的利用率，最大化減少損失，降低成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明創(chuàng)造旨在提供一種快速富集與CdTe量子點(diǎn)熒光結(jié)合上的金黃色葡萄球菌的方法，并以量子點(diǎn)的熒光顏色為檢測(cè)信號(hào)來檢測(cè)金黃色葡萄球菌的存在。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明創(chuàng)造的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0006]采用無菌注射器與0.45um濾膜的組合，是將微孔濾膜連接在注射器上，將菌體和抗體及量子點(diǎn)的混合物過膜，對(duì)量子點(diǎn)熒光信號(hào)進(jìn)行富集。
[0007]本發(fā)明的富集方法對(duì)通過抗體用量子點(diǎn)標(biāo)記金黃色葡萄球菌中的熒光信號(hào)有很強(qiáng)的富集功能。
[0008]本發(fā)明還公開了富集方法的檢測(cè)操作步驟:
[0009](1)以谷胱甘肽為穩(wěn)定劑水相開放體系合成(MTe量子點(diǎn)；
[0010](2)EDC活化CdTe量子點(diǎn)的羧基，與金黃色葡萄球菌特有基因IsdA的兔抗抗體25°C共培養(yǎng)lh，連接，超濾，設(shè)置空白對(duì)照；
[0011](3)取lml對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌，離心，PBS洗滌，加入步驟(2)得到的CdTe量子點(diǎn)和抗體的復(fù)合物，30-33°C共同培養(yǎng)l_4h，同時(shí)取lml對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌，離心，PBS洗滌，不加入步驟⑵得到的CdTe量子點(diǎn)和抗體的復(fù)合物，30-33°C培養(yǎng)l_4h，作為空白對(duì)照；
[0012](4)將共培養(yǎng)的混合物吸入lml的無菌注射器中，用0.45um的濾膜過濾，回收過濾液，然后更換針頭，分別用PBS、PBST洗滌三次，紫外下觀察是否有熒光，若有熒光則說明有金黃色葡萄球菌，反之則無，空白對(duì)照組經(jīng)洗滌均無熒光。將0.45 μ m濾膜放入無菌注射器組合應(yīng)用。共培養(yǎng)的混合物就是指30-33°C下，量子點(diǎn)抗體復(fù)合物、金葡菌共同培養(yǎng)l_4h后的混合物
[0013]本發(fā)明利用量子點(diǎn)熒光作為信號(hào)，無菌注射器和濾膜組合進(jìn)行信號(hào)分離放大，紫外光快速檢測(cè)。該法可用于對(duì)微生物化學(xué)信號(hào)的進(jìn)行富集，適用于各種微生物化學(xué)發(fā)光信號(hào)的富集，具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
[0014]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明創(chuàng)造所述的快速富集與金黃色葡萄球菌結(jié)合上的CdTe量子點(diǎn)熒光的方法及應(yīng)用在金黃色葡萄球菌檢測(cè)中具有以下優(yōu)勢(shì):
[0015]本法采用量子點(diǎn)作為檢測(cè)信號(hào)，并用無菌注射器和濾膜組合進(jìn)行信號(hào)富集，借助紫外進(jìn)行檢測(cè)，此法快速，簡便，準(zhǔn)確。首先CdTe量子點(diǎn)具有非常穩(wěn)定的光學(xué)特性，這就保證了最終檢測(cè)信號(hào)的穩(wěn)定性；其次，抗體的特異性以及專一性決定了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，最后，僅用注射器和濾膜即可進(jìn)行富集，快捷，簡單。由于是對(duì)所有菌體的攔截，這就保證了檢測(cè)信號(hào)的有效富集，同時(shí)對(duì)于過濾而出的CdTe量子點(diǎn)和抗體的復(fù)合物可進(jìn)行重復(fù)循環(huán)使用，增加了抗體的利用率，最大化減少損失，降低成本。本法可衍生應(yīng)用于其它微生物檢測(cè)，相對(duì)于國標(biāo)檢測(cè)的方法，本法更為快速，簡便，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0016]構(gòu)成本發(fā)明創(chuàng)造的一部分的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的進(jìn)一步理解，本發(fā)明創(chuàng)造的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明創(chuàng)造，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的不當(dāng)限定。在附圖中:
[0017]圖1 CdTe量子點(diǎn)紫外熒光發(fā)光圖。
[0018]圖2為本發(fā)明創(chuàng)造實(shí)施例所述的無菌注射器與濾膜的實(shí)際操作組合。
[0019]圖3為本發(fā)明創(chuàng)造實(shí)施例所述的金黃色葡萄球菌經(jīng)膜富集后的量子點(diǎn)熒光的紫外發(fā)光圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]為了使本發(fā)明上述特征和優(yōu)點(diǎn)更加清楚和容易理解，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0021]下述實(shí)施例中所述CdTe量子點(diǎn)為自己合成，合成方法為稱量80mgTe粉和50mg的NaHB4置于干燥的燒瓶中，均勻混合，加入lml超純水，橡皮塞封口，在橡皮塞上插入一針頭，室溫下反應(yīng)6小時(shí)。
[0022]IsdA兔抗抗體、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存，其他(lml無菌注射器、
0.45um濾膜、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉)均為市售，使用前需滅菌。
[0023]實(shí)施例1
[0024]本發(fā)明提供一種快速富集與金黃色葡萄球菌結(jié)合上的CdTe量子點(diǎn)熒光的方法，具體操作方法如下:
[0025](1)稱取26.6mg的二水醋酸鎘，加入50mL去離子水，36.84mg的谷胱甘肽與醋酸鎘溶液混合，調(diào)節(jié)pH至10.5 ;稱取5.08mg的亞碲酸鉀，加入50mL去離子水，將兩種溶液混合，100°C回流lh，合成谷胱甘肽修飾的CdTe量子點(diǎn)，使用前，使用30kDa的超濾管濃縮20倍；
[0026](2)吸取100 μ 1 EDC (4mg/ml)加入200ul CdTe量子點(diǎn)中，活化30min，然后與分別與300ul金黃色葡萄球菌特有基因IsdA的兔抗抗體25°C共培養(yǎng)lh，連接，lOOkDa超濾管超濾，設(shè)置CdTe量子點(diǎn)空白對(duì)照組；
[0027](3)取lml對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌，離心，PBS洗滌，加入200 μ 1 CdTe量子點(diǎn)和抗體的復(fù)合物，33°C共培養(yǎng)lh，設(shè)置CdTe量子點(diǎn)及IsdA的兔抗抗體復(fù)合物空白對(duì)照；
[0028](4)將共培養(yǎng)的混合物吸入lml的無菌注射器中，用0.45um的濾膜過濾(實(shí)際操作組合如圖3所示)，回收過濾液，然后更換針頭，分別用PBS、PBST洗滌三次，紫外下觀察是否有熒光，若有熒光則說明有金黃色葡萄球菌，反之則無，空白對(duì)照組經(jīng)洗滌均無熒光。
[0029]為了更好地理解本發(fā)明提供的快速富集與金黃色葡萄球菌結(jié)合上的CdTe量子點(diǎn)熒光的方法的效果，對(duì)實(shí)驗(yàn)用量子點(diǎn)材料的光學(xué)特性進(jìn)行表征，并對(duì)最終的結(jié)果進(jìn)行了紫外檢測(cè)。
[0030]圖1為CdTe量子點(diǎn)的熒光特性。由圖1可知，試驗(yàn)用CdTe量子點(diǎn)發(fā)黃色熒光，最佳發(fā)射波長為555nm，CdTe量子點(diǎn)的發(fā)射峰對(duì)稱且窄，同時(shí)(MTe量子點(diǎn)的焚光強(qiáng)度可達(dá)到28000左右，保證的續(xù)實(shí)驗(yàn)的信號(hào)強(qiáng)度。
[0031]圖3為金黃色葡萄球菌富集后的紫外檢測(cè)結(jié)果圖。從左往右依次為量子點(diǎn)空白組、CdTe量子點(diǎn)及IsdA的兔抗抗體復(fù)合物空白組、300ul抗體組。由此可以看出該富集檢測(cè)方法可行，結(jié)果中量子點(diǎn)熒光有差別，可能是量子點(diǎn)濃縮的影響。
[0032]以上所述僅為本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明創(chuàng)造，凡在本發(fā)明創(chuàng)造的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于:將量子點(diǎn)熒光與金黃色葡萄球菌抗體偶聯(lián)快速富集目標(biāo)菌，利用熒光判別目標(biāo)菌是否存在。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)以谷胱甘肽為穩(wěn)定劑開放體系合成CdTe量子點(diǎn)； (2)EDC活化CdTe量子點(diǎn)的羧基，與金黃色葡萄球菌特有蛋白IsdA的兔抗體在20-25°C共同培養(yǎng)l_4h，超濾； (3)取lml對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌，離心，PBS洗滌，加入步驟(2)得到的CdTe量子點(diǎn)和抗體的復(fù)合物，30-33°C共同培養(yǎng)l_4h，同時(shí)取lml對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌，離心，PBS洗滌；不加入步驟⑵得到的CdTe量子點(diǎn)和抗體的復(fù)合物，30-33°C培養(yǎng)l_4h，作為空白對(duì)昭.(4)將步驟(3)的共培養(yǎng)混合物吸入lml的無菌注射器中，用0.45 μ m的濾膜過濾，回收過濾液，然后更換注射器，用PBS洗滌3-5次，然后用PBST洗滌3-5次，洗滌后的剩余物在紫外下觀察是否有熒光，若有熒光則說明有金黃色葡萄球菌，反之則沒有金黃色葡萄球菌。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于:步驟(4)中將0.45 μ m濾膜與無菌注射器組合應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，將量子點(diǎn)熒光與金黃色葡萄球菌抗體偶聯(lián)快速富集目標(biāo)菌，利用熒光判別目標(biāo)菌是否存在。本發(fā)明還公開了制備步驟。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是：本法采用量子點(diǎn)熒光作為檢測(cè)信號(hào)，并用無菌注射器和濾膜組合進(jìn)行信號(hào)富集，借助紫外進(jìn)行檢測(cè)，此法快速，簡便，準(zhǔn)確。首先CdTe量子點(diǎn)具有非常穩(wěn)定的光學(xué)特性，這就保證了最終檢測(cè)信號(hào)的穩(wěn)定性；其次，抗體的特異性以及專一性決定了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，最后，僅用注射器和濾膜即可進(jìn)行富集，快捷，簡單。本法可衍生應(yīng)用于其它微生物檢測(cè)，相對(duì)于國標(biāo)檢測(cè)的方法，本法更為快速，簡便，具有良好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】G01N21/64, G01N33/569
【公開號(hào)】CN105424930
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510822460
【發(fā)明人】王俊平, 王碩, 李真珍, 杜欣軍
【申請(qǐng)人】天津科技大學(xué)
【公開日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2015年11月23日