一種快速檢測(cè)水體中小瓜蟲的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及水體中小瓜蟲DNA樣本的采集、提取、擴(kuò)增 及鑒定方面，具體是指一種水體小瓜蟲快速檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小瓜蟲屬于原生動(dòng)物門、纖毛蟲綱、膜口目、凹口科、小瓜蟲屬，是一種世界性分布 的淡水魚類寄生蟲，在高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖中引起魚類暴發(fā)性感染，導(dǎo)致大批魚死亡，造成巨大 經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 為了有效控制該病的發(fā)生，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者探討了該病病原的部分生物學(xué)特性、 病理特點(diǎn)、物理化學(xué)及中草藥對(duì)離體小瓜蟲的殺滅效果、小瓜蟲不同免疫疫苗的制造。除基 礎(chǔ)研究外治療性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不是效果不理想就是應(yīng)用性較差。綜合養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái) 看，目前對(duì)于小瓜蟲病的防治策略應(yīng)以防為主，治為輔。所以，及時(shí)了解水體中小瓜蟲的存 在狀態(tài)，提前做好水體處理或及時(shí)轉(zhuǎn)走養(yǎng)殖魚體，是防止小瓜蟲病爆發(fā)的最佳途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的內(nèi)容是為了及時(shí)發(fā)現(xiàn)水體中小瓜蟲的存在情況，提供一種高效、快捷、準(zhǔn) 確的水體小瓜蟲檢測(cè)方法，為最終通過小瓜蟲DNA濃度來(lái)判斷爆發(fā)小瓜蟲病的可能性奠定 基礎(chǔ)，用以指導(dǎo)實(shí)際的養(yǎng)殖操作。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)水體中小瓜蟲方法，包括以下步驟：
[0006] 步驟1:根據(jù)養(yǎng)殖水域大小，采集水樣；
[0007] 步驟2:將水樣進(jìn)行處理后，提取水體中的總DNA;
[0008] 步驟3:利用核苷酸序列IC-ITS-F和IC-ITS-R作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物 750bp，電泳檢測(cè)；
[0009] 步驟4:將上述PCR產(chǎn)物切膠回收，連接載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中進(jìn)行克隆，并盡 可能多的挑取單克隆個(gè)體進(jìn)行測(cè)序；
[0010] 步驟5:利用DNAMAN6.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，找出小瓜蟲與測(cè)得的相似種之 間的差異位點(diǎn)并設(shè)計(jì)出至少2對(duì)針對(duì)小瓜蟲的巢氏PCR引物；
[0011] 步驟6:利用上述引物對(duì)步驟3得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行巢氏PCR，知道電泳檢測(cè)結(jié)果顯 示，有小瓜蟲可擴(kuò)增出條帶，即可完成對(duì)水體中小瓜蟲的檢測(cè)。
[0012] 所述步驟1的采集水樣為所需檢測(cè)的養(yǎng)殖池池底、池壁不同范圍內(nèi)水樣或水塘排 水口不同時(shí)間段的水樣等體積混合物。
[0013] 所述步驟2中的水樣處理為對(duì)所述水樣采用25μπι濾膜進(jìn)行真空抽濾，抽濾后將所 述的濾膜放入裝有35ml無(wú)菌水的50ml離心管中，于禍旋振蕩器上震蕩混勾，8000rpm離心 5min，收集沉淀于-20°C保存;對(duì)沉淀物加入新的無(wú)菌水，反復(fù)吹洗后，裝于1.5ml的離心管 中，lOOOOrpm離心5min，棄上清備用。
[0014] 所述步驟2中總DNA的提取采用試劑盒方法，凝膠電泳檢測(cè)DNA提取情況后于-20°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0015] 所述步驟3中引物核苷酸序列IC-ITS-F和IC-ITS-R分別為IC-ITS-F 5'-GTTCCCCTTGAACGAGGAATTC-3 ' 和IC-ITS-R 5 ' -TTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3 ' WCR擴(kuò)增條件為： 94°C 預(yù)變性 3min，94°C 變性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 30s，30 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸 lOmin;
[0016] PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為每25μ1 體系中：lOxbuffer 2.5yl，MgCl2(25mM)3yl，dNTPs (2·5πιΜ)2μ1，濃度為lOOpmol/μΙ的正反引物各0·5μ1，模板DNA lyl，Taq酶（5υ/μ1)0·25μ1， ddH20 15.25μ1；
[0017] 電泳檢測(cè)上述PCR產(chǎn)物于1 %的瓊脂糖凝膠中，電壓120V電泳15min，最后在凝膠成 像系統(tǒng)上拍照即可完成電泳檢測(cè)。針對(duì)小瓜蟲的巢氏PCR引物為2對(duì)，分別為n-ICl-F和n-ICl-R;n-IC2-F 和 n-ICl-R。經(jīng)檢測(cè)第一對(duì)引物(n-ICl-F 和 n-ICl-R)擴(kuò)增 PCR 產(chǎn)物447bp，第 二對(duì)引物(n-IC2-F和n-ICl-R)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物為225bp。
[0018] 所述步驟4中挑取的單克隆個(gè)體20-40個(gè)，最后測(cè)序得到序列為15個(gè)。
[0019] 所述步驟6中，巢氏PCRPCR擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，55°C退火 30s，72°C 延伸 30s，30 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸 lOmin;
[0020] PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為每25μ1 體系中：lOxbuffer 2.5yl，MgCl2(25mM)3yl，dNTPs (2·5πιΜ)2μ1，濃度為lOOpmol/μΙ的正反引物各0·5μ1，模板DNA lyl，Taq酶（5υ/μ1)0·25μ1， ddH20 15.25μ1；
[0021] 本發(fā)明將環(huán)境分子生物學(xué)技術(shù)原理應(yīng)用于養(yǎng)殖調(diào)查，在獲取小瓜蟲DNA時(shí)，只需在 目標(biāo)水體一定范圍、時(shí)間內(nèi)進(jìn)行水樣采集即可，快速、簡(jiǎn)便、及時(shí)的了解了水體中小瓜蟲的 存在情況，解決了小瓜蟲病源發(fā)現(xiàn)難的問題，為最終通過水體小瓜蟲DNA濃度測(cè)算小瓜蟲病 爆發(fā)幾率奠定基礎(chǔ)，以解決小瓜蟲病發(fā)現(xiàn)時(shí)由于病情嚴(yán)重治療難的問題。相對(duì)于傳統(tǒng)小蟲 病的防治方法來(lái)講，具有創(chuàng)新性，避免了藥物治療方法帶來(lái)的藥物殘留，物理治療方法的效 果不佳，生物治療方法時(shí)間長(zhǎng)的問題，防患于未然，極大的降低了小瓜蟲病的爆發(fā)機(jī)率。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例的方法流程圖。
[0023] 圖2為本發(fā)明方法靈敏度檢測(cè)、自然水體爆發(fā)小瓜蟲過程、不同養(yǎng)殖水體小瓜蟲存 在情況的DNA提取結(jié)果圖。
[0024] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例使用IC-ITS-F和IC-ITS-R對(duì)上述三種情況下的小瓜蟲DNA進(jìn) 行第一次PCR的結(jié)果圖。
[0025] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例使用n-ICl-F和n-ICl-R對(duì)上述三種情況下的小瓜蟲第一次 PCR產(chǎn)物巢氏PCR的結(jié)果圖。
[0026] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例使用n-IC2-F和n-ICl-R對(duì)上述三種情況下的小瓜蟲第一次 PCR產(chǎn)物巢氏PCR的結(jié)果圖。
[0027] 圖6為通用引物ITS-F/ITS-R第一次PCR后得到的小瓜蟲及相似種的序列，圖中方 框表示為針對(duì)小瓜蟲特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)的2對(duì)特異性引物(n-ICl-F/n-ICl-R;n-IC2-F/n-ICl-R);其中，圖6-ln-ICl-F為上游引物、6-2n-ICl-R為下游引物；圖6-3n-IC2-F為上游引物、6-4n-ICl-R為下游引物。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方法作進(jìn)一 步說明。
[0029] 附圖2、3、4、5電泳圖泳道點(diǎn)樣順序依次為:5個(gè)/L小瓜蟲，10個(gè)/L小瓜蟲，15個(gè)/L小 瓜蟲，25個(gè)/L小瓜蟲，40個(gè)/L小瓜蟲，補(bǔ)充水源，銅魚，空白對(duì)照，DNAMarker，第一階段水樣， 第二階段水樣，第三階段水樣，第四階段水樣，第五階段水樣，空白對(duì)照，DNAMarker，認(rèn)養(yǎng)喂 養(yǎng)車間6號(hào)池水樣，尾灘1號(hào)塘水樣，尾灘3號(hào)塘水樣，板房玻纖缸養(yǎng)殖池水樣，第四車間5號(hào) 池水體，空白對(duì)照，DNAMarker。
[0030] DNAMrker條帶大小從下往上依次為：100bp; 250bp; 500bp; 750bp; lOOObp; 2000bp; 3000bp；5000bp〇
[0031] 附圖6為通用引物ITS-F/ITS-R第一次PCR后得到的，小瓜蟲及相似種的序列，共10 個(gè)，其序列見SEQUENCE LISTING。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 方法靈敏度檢測(cè)
[0034] 為了確定本發(fā)明可以有效的提取水體中的小瓜蟲DNA，取嚴(yán)重感染小瓜蟲的魚體 (魚體表面有很多小白點(diǎn)），用蒸餾水清洗魚體三遍，用載玻片輕輕刮取魚體表面的白色包 囊，將包囊連同其內(nèi)的多子小瓜蟲收集到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，靜置，吸取大量黏液于另一無(wú)菌 培養(yǎng)皿中并反復(fù)吹洗，將包裹在粘液中的小瓜蟲分離出來(lái)，除去黏液。至此2個(gè)培養(yǎng)皿中存 在大量可供挑選的小瓜蟲單個(gè)蟲體(若黏液較多可再次重復(fù)上述操作以獲取更多量的單獨(dú) 蟲體）。將5、10、15、25、40個(gè)小瓜蟲分別放置與11^水中，按如圖1所示實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使 用濾膜孔徑為25μπι的真空抽氣栗對(duì)5個(gè)水樣進(jìn)行抽濾處理，將濾膜放入50ml的離心管中，于 禍旋振蕩器上震蕩混勾，8000rpm離心5min，倒去上清，加入新的無(wú)菌水，反復(fù)吹洗后吸入至 1.5ml的離心管中，lOOOOrpm離心5min，去上清，使用TIANGEN公司生產(chǎn)的試劑盒提取小瓜蟲 總DNA并溶于TE緩沖液中，-20°C保存?zhèn)溆谩D2-A為DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
[0035] 采用IC-ITS-F和IC-ITS-R序列作為通用性