專利名稱：用于同時(shí)測(cè)定多種凝固蛋白酶的方法
用于同時(shí)測(cè)定多種凝固蛋白酶的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于凝固診斷學(xué)領(lǐng)域并涉及用于同時(shí)測(cè)定多種凝固蛋白酶活性的方法或用于同時(shí)測(cè)定多種凝固蛋白酶的抑制的方法。
背景技術(shù)：
已建立的抗凝治療的主要目標(biāo)在于抑制促凝的凝固因子凝血酶(因子IIa)和因子 Xa。在例如導(dǎo)致凝固因子合成抑制的利用諸如華法靈鈉的維生素K拮抗劑的口服抗凝與通過抑制血流中活性凝固因子的抗凝之間作出了區(qū)別。在抑制或失活血流中活性凝固因子的抗凝劑的情況下，在具有直接作用的抗凝劑和具有間接作用的那些之間作出了區(qū)別。具有直接作用的抗凝劑如例如利伐沙班(rivaroxaban)、達(dá)比加群或美拉加群結(jié)合凝血酶或因子Xa，并因此具有高度的特異性。具有間接作用的抗凝劑如例如肝素結(jié)合內(nèi)源性凝固因子抑制劑例如抗凝血酶，并數(shù)倍強(qiáng)化其抗凝作用。
抑制血流中活性凝固因子的所有抗凝劑都以特異性失活模式為特征。特定的物質(zhì)類型如例如未分級(jí)分離的、高分子量肝素既抑制凝血酶又抑制因子Xa。其他物質(zhì)具有高度特異性作用，即，或者抑制凝血酶(例如，水蛭素、達(dá)比加群、美拉加群)，或者抑制因子Xa (例如，戍糖如磺達(dá)肝素(fondaparinux )、利伐沙班)。
在血栓栓塞性疾病的治療過程期間，有時(shí)會(huì)更換抗凝劑。當(dāng)治療腿部深靜脈血栓時(shí)，經(jīng)典的情況是從肝素(抑制血流中凝血酶和因子Xa)轉(zhuǎn)換為華法靈鈉(抑制肝臟中凝固因子合成)。隨著治療中的這種變化，血流中凝血酶和因子Xa的相對(duì)失活可改變。對(duì)于治療的控制和藥物的給藥，知曉凝血酶和因子Xa的活性或抑制是重要的。因此，能夠可靠地測(cè)定患者血液中活性凝固因子凝血酶和因子Xa的活性或抑制是必要的。
在凝固診斷學(xué)中，在用于檢查凝血級(jí)聯(lián)功能性的“總體測(cè)試”和用于測(cè)定個(gè)別凝血因子活性的“個(gè)別測(cè)試”之間作出了區(qū)別。對(duì)于總體測(cè)試和個(gè)別測(cè)試均已知不同的測(cè)試形式。在測(cè)試形式方面，在凝固測(cè)試和生色測(cè)試之間基本上作出了區(qū)別。
在生色測(cè)試中，將通常由血漿組成的待測(cè)患者樣品與凝固激活劑和凝固因子的底物混合。由于大多數(shù)凝血因子是絲氨酸內(nèi)肽酶，即可以切割肽鍵的水解酶，因此主要使用被待測(cè)凝血因子高度特異性切割并且具有可檢測(cè)信號(hào)基團(tuán)的肽底物。優(yōu)選地，使用可切割的生色或熒光信號(hào)基團(tuán)，其通過光度法進(jìn)行測(cè)定。專利文獻(xiàn)EP 0034122 Al和US 4，508，644 描述了許多生色肽底物及其在凝固診斷測(cè)試中的應(yīng)用，例如用于測(cè)定蛋白水解凝固因子因子IIa (凝血酶)和Xa。文獻(xiàn)EP 0078764 Al描述了用于測(cè)定蛋白水解凝固因子XIIa的生色方法。
特別地，生色測(cè)試還可以用于測(cè)定抑制患者樣品中凝血因子活性的抗凝劑。對(duì)于這種目的，通常將待測(cè)患者樣品與活化的凝固因子和所述凝固因子的底物混合。樣品中存在的抗凝劑越多，活化凝固因子的抑制越強(qiáng)并且切割的底物越少。
已建立的并且也市售的生色測(cè)試特別地使用生色團(tuán)對(duì)-硝基苯胺(pNA)和5-氨基-2-硝基苯甲酸(ANBA)，其在405 nm有最大吸收。通常利用光度法測(cè)定產(chǎn)生的黃色。當(dāng)測(cè)定抗凝劑時(shí)，測(cè)試反應(yīng)中的顏色濃度與樣品中抗凝劑濃度成反比。
為了測(cè)定凝血酶和因子Xa的抑制，進(jìn)行兩個(gè)單獨(dú)的測(cè)試是必要的，其中在每種情況下測(cè)定兩種凝固因子中的一種的抑制。在單一測(cè)試反應(yīng)中同時(shí)測(cè)定兩種凝固因子的活性或抑制將是期望的。這將具有下列優(yōu)勢(shì)減少材料消耗和時(shí)間支出，以及在相同條件下進(jìn)行兩種測(cè)定、避免進(jìn)行測(cè)試時(shí)的變化如例如移液誤差，其可能導(dǎo)致在測(cè)定兩個(gè)結(jié)果之間關(guān)聯(lián)中的誤差。發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供允許在單一測(cè)試反應(yīng)中同時(shí)測(cè)定凝血酶和因子Xa的方法。WO 2006/072602 Al描述了用于同時(shí)測(cè)定凝血酶和纖溶酶的方法，其中使用熒光底物，纖溶酶是纖維蛋白溶解系統(tǒng)的酶。
本發(fā)明目的是通過將樣品與第一蛋白水解凝固因子特異性的第一生色底物和第二蛋白水解凝固因子特異性的第二生色底物混合實(shí)現(xiàn)的，其中第一生色底物具有生色團(tuán)， 該生色團(tuán)的最大吸收與第二生色底物的生色團(tuán)的最大吸收相差至少100 nm。產(chǎn)生的生色信號(hào)可以在光譜學(xué)上分開并可以用光度法在不同波長(zhǎng)彼此獨(dú)立地測(cè)定。
因此，本發(fā)明提供用于在單一測(cè)試反應(yīng)中同時(shí)測(cè)定第一蛋白水解凝固因子和第二蛋白水解凝固因子的活性的方法，其中將樣品與第一蛋白水解凝固因子特異性的第一生色底物和第二蛋白水解凝固因子特異性的第二生色底物混合，并且其中用光度法測(cè)定在測(cè)試反應(yīng)中的吸收變化(顏色信號(hào)形成)，并且其中第一生色底物具有生色團(tuán)，該生色團(tuán)的最大吸收與第二生色底物的生色團(tuán)的最大吸收相差至少100 nm。


圖I是顯示富集不同濃度利伐沙班和/或阿加曲班的正常血漿樣品中因子Xa活性的抑制[%](參見實(shí)施例2)的條形圖。在405nm波長(zhǎng)處測(cè)定具有ANBA生色團(tuán)的因子Xa 特異性肽底物的切割。不考慮阿加曲班濃度(凝血酶抑制劑)，在具有升高的利伐沙班濃度 (因子Xa抑制劑)的樣品中測(cè)定到升高的因子Xa抑制。
圖2是顯示富集不同濃度利伐沙班和/或阿加曲班的正常血漿樣品中凝血酶活性的抑制[%](參見實(shí)施例2)的條形圖。在575nm波長(zhǎng)處測(cè)定具有堿性藍(lán)49生色團(tuán)的凝血酶特異性肽底物的切割。不考慮利伐沙班濃度(Xa因子抑制劑)，在具有升高的阿加曲班濃度(凝血酶抑制劑)的樣品中測(cè)定到升高的凝血酶抑制。具體實(shí)施方案
術(shù)語“蛋白水解凝固因子”應(yīng)當(dāng)理解為意味著在哺乳動(dòng)物、優(yōu)選人凝血系統(tǒng)中具有促凝(凝固促進(jìn)的)、抗凝(凝固抑制的)或纖維溶解(凝塊降解的)功能的任何血漿絲氨酸蛋白酶。促凝的蛋白水解凝固因子是例如因子IIa (凝血酶)、因子Vila、因子IXa、因子Xa、 因子XIa、以及因子Xlla?？鼓牡鞍姿饽桃蜃邮抢绲鞍證a (活化的蛋白C)。纖維溶解的蛋白水解凝固因子是例如纖溶酶。
術(shù)語“同時(shí)測(cè)定”應(yīng)當(dāng)理解為意味著在單一測(cè)試反應(yīng)中測(cè)定兩種蛋白水解凝固因子。
在本發(fā)明的上下文中，“樣品”應(yīng)當(dāng)理解為意味著可疑包含待測(cè)蛋白水解凝固因子或一種或多種待測(cè)抗凝劑的材料。術(shù)語“樣品”特別地包含人或動(dòng)物體液、尤其是血液和血漿。
“蛋白水解凝固因子特異性的生色底物”應(yīng)當(dāng)理解為意味著被蛋白水解凝固因子以足夠特異性轉(zhuǎn)化的底物，其中生色團(tuán)作為特異性底物轉(zhuǎn)化的結(jié)果被釋放?？汕懈畹孜?、特別是對(duì)于活化凝固因子具有至少一個(gè)切割位點(diǎn)的底物是本領(lǐng)域技術(shù)人員充分知曉的?？汕懈畹孜锟梢允峭ㄟ^活化蛋白水解凝固因子的作用分解成兩個(gè)切割產(chǎn)物的分子，該分子是合成、重組或使用生物技術(shù)方法制備的分子或是天然的分子?？汕懈畹孜锟梢酝耆虿糠钟呻慕M成。優(yōu)選地，它包含至少在切割位點(diǎn)區(qū)域中的肽部分。優(yōu)選地，可切割底物的肽部分由 3至大約150個(gè)氨基酸殘基組成。專利文獻(xiàn)EP 0034122 Al和US 4，508，644描述了許多生色肽底物、它們的制備、以及它們?cè)谀淘\斷學(xué)測(cè)試中的應(yīng)用，例如用于測(cè)定凝固因子因子 IIa (凝血酶)和Xa。文獻(xiàn)EP 78764 Al描述了用于測(cè)定凝固因子XIIa的生色方法。
“生色團(tuán)”應(yīng)當(dāng)理解為意味著可以通過特異性蛋白水解凝固因子的作用從底物中切割(解離)的以及在底物切割后具有與未切割狀態(tài)下不同的吸收性質(zhì)的信號(hào)基團(tuán)(“標(biāo)記”)。依照本發(fā)明，第一生色底物具有生色團(tuán)，切割后該生色團(tuán)的最大吸收與切割后第二生色底物的生色團(tuán)的最大吸收相差至少100 nm。表I顯示已知生色團(tuán)的選擇，它們切割后的最大吸收，以及最大吸收彼此相差至少100 nm的生色團(tuán)的優(yōu)選組合。優(yōu)選的生色團(tuán)是從底物切割后在可見波長(zhǎng)范圍380 nm到780 nm具有最大吸收的那些。
通過在測(cè)試反應(yīng)中吸收變化(顏色信號(hào)形成)的光度法測(cè)定來測(cè)定凝固因子的活性，上述變化與凝固因子的活性成比例。術(shù)語“吸收變化的光度法測(cè)定”應(yīng)當(dāng)理解為意味著這樣的吸收測(cè)定，其中測(cè)定透射過測(cè)試反應(yīng)的光束強(qiáng)度的減少(透射測(cè)定法)。為了測(cè)定顏色信號(hào)形成，選取被待測(cè)解離生色團(tuán)吸收的波長(zhǎng)區(qū)域。
依照本發(fā)明，吸收變化的光度法測(cè)定包含在至少兩個(gè)不同波長(zhǎng)下測(cè)試反應(yīng)的吸收測(cè)定，優(yōu)選地所述波長(zhǎng)處于所用生色團(tuán)的最大吸收區(qū)域?？蛇x地，可以用白光照射測(cè)試反應(yīng)，白光將在通過測(cè)試反應(yīng)后在光譜學(xué)上衰弱。測(cè)試反應(yīng)隨時(shí)間的吸收變化的測(cè)定可以通過對(duì)應(yīng)于所用兩種生色團(tuán)最大吸收的波長(zhǎng)的光的交替脈沖實(shí)現(xiàn)，所述脈沖以短間隔交替。
表I
權(quán)利要求
1.用于在單一測(cè)試反應(yīng)中同時(shí)測(cè)定第一蛋白水解凝固因子和第二蛋白水解凝固因子活性的方法，其中將樣品與所述第一蛋白水解凝固因子特異性的第一生色底物以及所述第二蛋白水解凝固因子特異性的第二生色底物混合，并且其中用光度法測(cè)定所述測(cè)試反應(yīng)中的吸收變化，其特征在于所述第一生色底物具有生色團(tuán)，所述生色團(tuán)的最大吸收與所述第二生色底物的生色團(tuán)的最大吸收相差至少100 nm。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一蛋白水解凝固因子和所述第二蛋白水解凝固因子選自包含凝血酶、因子Vila、因子IXa、因子Xa、因子XIa、因子Xlla、蛋白Ca以及纖溶酶的集合。
3.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述第一或第二蛋白水解凝固因子是凝血酶。
4.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述第一或第二蛋白水解凝固因子是因子Xa。
5.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述第一或第二生色底物具有對(duì)-硝基苯胺或5-氨基-2-硝基苯甲酸作為生色團(tuán)。
6.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述第一或第二生色底物具有 phenoxazime衍生物作為生色團(tuán)。
7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述第一蛋白水解凝固因子和所述第二蛋白水解凝固因子存在于所述樣品中，并且通過添加一種或多種用于活化所述凝固因子的試劑而活化。
8.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中將確定量的所述第一蛋白水解凝固因子和確定量的所述第二蛋白水解凝固因子與所述樣品混合，并且其中在吸收變化抑制的基礎(chǔ)上測(cè)定所述樣品中的抗凝劑濃度。
9.測(cè)試試劑盒，其包括具有確定濃度的第一蛋白水解凝固因子的第一試劑，以及具有確定濃度的第二蛋白水解凝固因子的第二試劑，以及a.包含所述第一蛋白水解凝固因子特異性的第一生色底物以及所述第二蛋白水解凝固因子特異性的第二生色底物的第三試劑；或者b.包含所述第一蛋白水解凝固因子特異性的第一生色底物的第三試劑以及包含所述第二蛋白水解凝固因子特異性的第二生色底物的第四試劑，其中所述第一生色底物具有生色團(tuán)，所述生色團(tuán)的最大吸收與所述第二生色底物的生色團(tuán)的最大吸收相差至少100 nm。
10.如權(quán)利要求9所述的測(cè)試試劑盒，其中所述第一蛋白水解凝固因子是凝血酶。
11.如權(quán)利要求9或10中任一項(xiàng)所述的測(cè)試試劑盒，其中所述第二蛋白水解凝固因子是因子Xa。
12.如權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)所述的測(cè)試試劑盒，其中所述第一蛋白水解凝固因子特異性的第一生色底物具有生色團(tuán)，所述生色團(tuán)來自包含對(duì)-硝基苯胺和5-氨基-2-硝基苯甲酸的集合，并且所述第二蛋白水解凝固因子特異性的第二生色底物具有生色團(tuán)，所述生色團(tuán)來自包含phenoxazime衍生物的集合,或者反之亦然。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在單一測(cè)試反應(yīng)中同時(shí)測(cè)定多種凝固蛋白酶活性或者同時(shí)測(cè)定多種凝固蛋白酶抑制的生色方法。為了這一目的，使用兩種生色底物，所述底物具有不同的最大吸收并且所述底物的顏色信號(hào)可以被光譜學(xué)分開。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102539355SQ20111042620
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者N.燦德爾 申請(qǐng)人:西門子醫(yī)療診斷產(chǎn)品有限責(zé)任公司