專利名稱：測(cè)定生物樣品中蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定生物樣品中組織蛋白酶B潛在可用活性的方法，包括組織蛋白酶B活性形式的活性，和能從樣品中存在的前體形式組織蛋白原B激活的組織蛋白酶B形式，和能被激活且其蛋白酶活性在樣品中被蛋白酶抑制劑抑制的組織蛋白酶B形式。
背景技術(shù)：
為了測(cè)定組織提取物或體液如血清中的酶濃度，可用酶檢測(cè)和免疫學(xué)試驗(yàn)如ELISA。在醫(yī)學(xué)分析和臨床診斷情況中，測(cè)定樣品中完整和活性酶的存在量通常很重要，從而能說(shuō)明病因?qū)W、疾病效果和預(yù)后。酶的永久失活形式如變性酶或酶片段通常不相關(guān)，因而不考慮測(cè)定這種酶且一般應(yīng)該不考慮。然而，其他失活酶形式如其活性短暫且由抑制劑或酶前體可逆性抑制的酶(稱為酶原)可在疾病成因、影響和/或預(yù)測(cè)中發(fā)揮決定性作用。如果生物學(xué)過(guò)程需要其酶活性，這種失活酶形式可在某些情況下轉(zhuǎn)變成其活性形式。在這些情況中，例如，所述抑制劑通過(guò)某些機(jī)制滅活或從酶中撤出，或者酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槠浠钚孕问?。組織或體液中活性和短暫失活酶的總體濃度對(duì)于特定疾病有重要啟示。測(cè)定酶濃度的酶檢測(cè)使用由活性酶進(jìn)行或催化的這類反應(yīng)。然而，如果所述酶形式也能包括在內(nèi)，作為暫時(shí) 抑制失活形式和/或作為失活酶原在生物樣品中可用(例如，這通常是用蛋白酶的情況)，則這些酶形式由于其失活而不能用這類測(cè)試檢測(cè)。因此，樣品中可測(cè)量的酶活性通常不與真正可用的酶活性對(duì)應(yīng)，因?yàn)橹辽僖徊糠置富钚杂梢种苿┮种苹蛞悦冈氖Щ钚问酱嬖凇Ｊ熘诟腥景┌Y的癌癥患者組織樣品中，溶酶體半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶B水平相較健康人的對(duì)應(yīng)組織樣品增加。因此，認(rèn)為組織蛋白酶B是癌癥疾病中的診斷和預(yù)后因子。一部分組織蛋白酶B是胱抑素抑制形式。此情況中考慮的半胱氨酸蛋白酶抑制劑屬于半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族，來(lái)自I家族的胱抑素A和胱抑素B在胞內(nèi)有活性，來(lái)自
II家族的胱抑素C在胞外有活性，因此在血清中也如此。W097/00969中，對(duì)于組織蛋白酶B濃度的酶學(xué)測(cè)定，建議在組織樣品中通過(guò)親和色譜從受抑制組織蛋白酶B中撤出半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制劑，其中生物樣品通過(guò)填充有瓊脂糖凝膠的親和色譜柱，木瓜蛋白酶共價(jià)結(jié)合所述瓊脂糖凝膠。木瓜蛋白酶也是半胱氨酸蛋白酶且對(duì)半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的結(jié)合親和性高于組織蛋白酶，因此木瓜蛋白酶從組織蛋白酶中撤出抑制劑。然后，去抑制組織蛋白酶B的活性用其酶活性測(cè)量。不同于組織樣品，血清中觀察到組織蛋白酶B在沒(méi)有去抑制時(shí)不能測(cè)量。因此，推斷全組織蛋白酶B在血清中受抑制。通過(guò)直接ELISA測(cè)量顯示前列腺癌患者血清中組織蛋白原B (組織蛋白酶B的酶原)和組織蛋白酶B的累積值相較健康人的對(duì)應(yīng)值增加約3倍，而同一時(shí)間血清中在測(cè)量前去抑制的組織蛋白酶B活性相較健康人僅高約30%。通過(guò)夾心ELISA方法，結(jié)腸癌患者血清中組織蛋白酶B和組織蛋白原B濃度的累積值相較健康人增加約5倍。因此，推斷組織蛋白原B濃度或組織蛋白酶B和組織蛋白原B濃度的累積值相較單獨(dú)組織蛋白酶B值是更重要的癌癥疾病指示物。在免疫學(xué)試驗(yàn)如ELISA中，樣品中的酶分子通過(guò)抗體方法特異性檢測(cè)。盡管免疫學(xué)試驗(yàn)一般比酶檢測(cè)更靈敏，但抗體不區(qū)分酶活性形式與受抑制劑抑制的酶形式；因此這些免疫學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)活性和受抑制酶的累積量。根據(jù)這些免疫學(xué)試驗(yàn)所用的抗體，還能檢測(cè)酶原、永久性失活酶且一定程度上也能檢測(cè)變性酶。由于在酶基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)疾病的成因、影響和預(yù)后通常取決于活性或可激活的酶，因?yàn)閮H這些酶形式最終激發(fā)或催化生物學(xué)過(guò)程，還檢測(cè)永久性失活酶形式的這些免疫學(xué)試驗(yàn)可對(duì)所用試驗(yàn)的需要意義產(chǎn)生負(fù)影響，并因此僅部分符合醫(yī)學(xué)分析和診斷。另外，免疫學(xué)試驗(yàn)通常需要設(shè)備和時(shí)間上的高消耗并因而成本高且一般僅在醫(yī)療機(jī)構(gòu)特殊實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。發(fā)明目的因此，本發(fā)明的任務(wù)是提供測(cè)定與癌診斷特別相關(guān)的蛋白酶組織蛋白酶B的方法，所述方法相較熟知的免疫學(xué)方法更符合成本效益且運(yùn)行更簡(jiǎn)單，同時(shí)適于通過(guò)抑制劑可逆抑制組織蛋白酶B和組織蛋白原B在生物樣品中具體在血漿或血清中測(cè)定活性組織蛋白酶B，并通過(guò)檢測(cè)永久性失活組織蛋白酶B來(lái)避免誤差。發(fā)明描述所述任務(wù)通過(guò)測(cè)定生物樣品中組織蛋白酶B潛在可用活性的方法來(lái)解決，包括組織蛋白酶B活性形式的活性，和能從樣品中存在的前體形式組織蛋白原B激活的組織蛋白酶B形式，和能被激活且在樣品中由蛋白酶抑制劑抑制其活性的組織蛋白酶B形式，有下列步驟 a)通過(guò)以下方式將樣品中存在的組織蛋白原B通過(guò)以下方式轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式a.1)將所述樣品接觸第一酶(蛋白水解酶)，所述第一酶的功能性是通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式，或a.1i)降低pH值到某一值，在該處組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式，b)通過(guò)將所述樣品接觸第二酶(抑制劑結(jié)合酶)來(lái)耗盡所述樣品中組織蛋白酶B的游離蛋白酶抑制劑或阻遏其抑制劑功能并從組織蛋白酶B受抑制形式中撤出蛋白酶抑制劑，所述第二酶能結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑且對(duì)所述蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B，其中b.1)所述第一酶(蛋白水解酶)和所述第二酶(抑制劑結(jié)合酶)是相同的酶，前提是所述酶具有通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式以及結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能且對(duì)該蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B，或b.1i)若使用，所用的第二酶(抑制劑結(jié)合酶)不同于所述第一酶(蛋白水解酶)，其中-第二酶(抑制劑結(jié)合酶)是沒(méi)有降解組織蛋白酶B的蛋白水解活性的酶，或-第二酶(抑制劑結(jié)合酶)是有降解組織蛋白酶B的蛋白水解活性的酶，第二酶降解組織蛋白酶B的該蛋白水解活性在樣品中于步驟b)的反應(yīng)時(shí)間后失活，或第二酶從樣品中移出并由某一酶替代，所述某一酶沒(méi)有降解組織蛋白酶B的活性但能結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑且對(duì)該蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B，
c)將樣品接觸組織蛋白酶B的底物并記錄由蛋白酶組織蛋白酶B催化的底物蛋白水解反應(yīng)。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)生物樣品中組織蛋白酶B的“潛在可用活性”指可用的組織蛋白酶B活性，如果出現(xiàn)樣品中存在的組織蛋白酶B活性形式，組織蛋白酶B的短暫失活形式如組織蛋白原B和組織蛋白酶B的可逆抑制形式轉(zhuǎn)變成活性形式。測(cè)定生物樣品中組織蛋白酶B潛在可用活性的本發(fā)明方法是基于以下事實(shí)生物樣品中的所有組織蛋白酶B活性形式以及能被激活的形式，即組織蛋白酶B活性形式、由蛋白酶抑制劑可逆抑制的組織蛋白酶B形式、和生物學(xué)前體組織蛋白原B，首先轉(zhuǎn)變成活性形式，然后進(jìn)行對(duì)組織蛋白酶B特異的酶促反應(yīng)，底物特異于組織蛋白酶B。因此，本發(fā)明方法的第一步驟a)中，組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式。這優(yōu)選酶促進(jìn)行，其中使樣品接觸第一酶(蛋白水解酶)，所述第一酶具有通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式的功能?；蛘?，樣品中的組織蛋白原還能通過(guò)降低PH值來(lái)轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式。如此，通常生理pH值范圍為6-8的樣品必須設(shè)置成3. 5-5. 5范圍的較低pH值，優(yōu)選4. 0-5. O范圍，特別優(yōu)選約4. 5，其中組織蛋白原B的前區(qū)域被切割。在前面發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，第一酶(蛋白水解酶)具有通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式的功能并與樣品接觸，所述第一酶是缺乏降解組織蛋白酶B的蛋白水解活性的水解酶，優(yōu)選胃蛋白酶或組織蛋白酶D或組織蛋白酶C或嗜熱菌蛋白酶或鏈霉蛋白酶，特別優(yōu)選胃蛋白酶或組織蛋白酶D。在此實(shí)施方式中，所用的第二酶(抑制劑結(jié)合酶)不同于所述第一酶(蛋白水解酶)，因?yàn)樯厦嫣峒暗乃饷竿ǔ２痪哂薪Y(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能。胃蛋白酶特定優(yōu)選為第一酶。盡管前面列舉的水解酶能蛋白水解切割 組織蛋白原B的前區(qū)域并因此將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B，產(chǎn)物組織蛋白酶B不進(jìn)一步由胃蛋白酶或組織蛋白酶D顯著消化。在此方法的第一變體中，第一酶(蛋白水解酶)是沒(méi)有降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性的水解酶，但具有通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式的功能，所用的第二酶(抑制劑結(jié)合酶)是木瓜蛋白酶，具有結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能且對(duì)該蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B，其中木瓜蛋白酶降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性在樣品中于反應(yīng)時(shí)間后失活或木瓜蛋白酶從樣品中移出并由某一酶替代，所述某一酶沒(méi)有降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性但具有結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能且對(duì)該蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B。在所述方法的第二變體中，所述第一酶(蛋白水解酶)是沒(méi)有降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性的水解酶，但具有通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式的功能，所用的第二酶(抑制劑結(jié)合酶)是改性的木瓜蛋白酶，具有結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能且對(duì)該蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B，但缺乏通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式的功能和降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性，其中缺乏蛋白酶活性的改性木瓜蛋白酶可如下制備a)木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心內(nèi)半胱氨酸的SH-基團(tuán)的化學(xué)修飾，優(yōu)選通過(guò)木瓜蛋白酶與甲基甲硫磺酸酯(MMTS)、對(duì)汞苯甲酸鹽或AgN03反應(yīng)或通過(guò)添加N-取代馬來(lái)酰亞胺，或通過(guò)
b)由另一氨基酸在木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心內(nèi)的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)突變。本發(fā)明的“改性”木瓜蛋白酶中，關(guān)閉降解組織蛋白酶B的蛋白水解活性，然而其仍具有結(jié)合半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白酶抑制劑的木瓜蛋白酶固有高親和性。缺乏蛋白酶活性的改性木瓜蛋白酶可化學(xué)制備，其還能用于原位修飾樣品中的木瓜蛋白酶從而當(dāng)其蛋白水解活性已將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B時(shí)，僅在反應(yīng)時(shí)間后關(guān)閉其針對(duì)組織蛋白酶B的蛋白酶活性。使木瓜蛋白酶的蛋白酶活性失活的優(yōu)選化學(xué)方法是氧化木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心內(nèi)半胱氨酸的SH-基團(tuán)。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方式中，此SH-基團(tuán)氧化通過(guò)木瓜蛋白酶與甲基甲硫磺酸酯(MMTS)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行?；蛘?，木瓜蛋白酶的蛋白酶活性滅活通過(guò)用重金屬化合物如對(duì)汞苯甲酸鹽或AgNO3掩蔽SH-基團(tuán)或添加N-取代馬來(lái)酰亞胺到SH-基團(tuán)來(lái)完成。在本發(fā)明的替代實(shí)施方式中，蛋白酶活性失活的改性木瓜蛋白酶能由另一氨基酸通過(guò)交換或定點(diǎn)突變木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心內(nèi)的半胱氨酸來(lái)制備?？寺∵@種交換或生成半胱氨酸 殘基定點(diǎn)突變的遺傳工程改造方法以及隨后通過(guò)體外或體內(nèi)表達(dá)然后分離或純化來(lái)生成木瓜蛋白酶突變體為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。在本發(fā)明的替代實(shí)施方式中，所用的第一酶(蛋白水解酶)和第二酶(抑制劑結(jié)合酶)是相同的酶，即木瓜蛋白酶，所述酶具有通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式以及結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能并且對(duì)該蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B，其中木瓜蛋白酶降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性在反應(yīng)時(shí)間后失活或木瓜蛋白酶從樣品中移出并由某一酶替代，所述某一酶沒(méi)有降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性但具有結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能且對(duì)該蛋白酶抑制劑的親和性聞?dòng)诮M織蛋白酶B。木瓜蛋白酶能消化樣品中游離的組織蛋白酶B，并因而樣品中失去活性組織蛋白酶B。假定在最優(yōu)反應(yīng)條件下，活性木瓜蛋白酶在約5分鐘中降解約4-5%組織蛋白酶B。對(duì)于胃蛋白酶或組織蛋白酶D并非如此。由木瓜蛋白酶降解組織蛋白酶B可對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生負(fù)影響，因?yàn)橛涗浟吮壬飿悠分袑?shí)際可得的量更少的活性組織蛋白酶B量。因此，木瓜蛋白酶必須在反應(yīng)時(shí)間后從樣品中移出或其針對(duì)組織蛋白酶B降解的蛋白酶活性必須失活。用于本發(fā)明方法此目的的實(shí)施方式描述于下。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，木瓜蛋白酶用作第一和第二酶或僅作為第二酶(抑制劑結(jié)合酶)，樣品中的木瓜蛋白酶在反應(yīng)時(shí)間后轉(zhuǎn)化成改性木瓜蛋白酶，所述改性木瓜蛋白酶就組織蛋白酶B降解而言具有失活的蛋白酶活性，其中蛋白酶活性失活的改性木瓜蛋白酶可通過(guò)化學(xué)修飾木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心內(nèi)半胱氨酸SH-基團(tuán)來(lái)制備，優(yōu)選通過(guò)木瓜蛋白酶與甲基甲硫磺酸酯(MMTS)、對(duì)汞苯甲酸鹽或AgN03反應(yīng)或通過(guò)添加N-取代馬來(lái)酰亞胺。此方式中，木瓜蛋白酶保持其撤出或結(jié)合蛋白酶抑制劑的功能，但釋放其蛋白酶活性，從而在滅活木瓜蛋白酶后，即將木瓜蛋白酶轉(zhuǎn)變成其改性形式后，反應(yīng)批次可進(jìn)一步加工且其時(shí)程至少在涉及蛋白降解組織蛋白酶B方面沒(méi)有變得關(guān)鍵。在本發(fā)明方法的替代優(yōu)選實(shí)施方式中，木瓜蛋白酶用作第一和第二酶或僅作為第二酶(抑制劑結(jié)合酶)，樣品中的木瓜蛋白酶在反應(yīng)時(shí)間后從樣品中移出并由改性木瓜蛋白酶替代，所述改性木瓜蛋白酶缺乏降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性，但具有結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能且對(duì)該蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B，其中缺乏蛋白酶活性的改性木瓜蛋白酶可如下制備a)木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心內(nèi)半胱氨酸SH-基團(tuán)的化學(xué)修飾，優(yōu)選通過(guò)木瓜蛋白酶與甲基甲硫磺酸酯(MMTS)、對(duì)汞苯甲酸鹽或AgN03反應(yīng)或通過(guò)添加N-取代馬來(lái)酰亞胺，或通過(guò)b)由另一氨基酸在木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心內(nèi)的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)突變。為了以簡(jiǎn)單方式從樣品中移出木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶優(yōu)選結(jié)合剛性載體，然后先與流體樣品接觸且在反應(yīng)時(shí)間后從樣品中移出。所述流體樣品還可通過(guò)與木瓜蛋白酶結(jié)合的剛性載體，從而使樣品接觸木瓜蛋白酶。5分鐘內(nèi)，約4-5%的游離組織蛋白酶B由充分完整的木瓜蛋白酶消化，在一個(gè)本發(fā)明方法前述變體的實(shí)施方式中，首先使木瓜蛋白酶接觸樣品一段反應(yīng)時(shí)間且隨后轉(zhuǎn)移到改性木瓜蛋白酶或從樣品中移出，滅活或移除蛋白酶活性在5分鐘的去抑制步驟b)反應(yīng)時(shí)間后進(jìn)行，特別優(yōu)選3分鐘的反應(yīng)時(shí)間后，尤其優(yōu)選I分鐘的反應(yīng)時(shí)間后。滅活或移除活性完整木瓜蛋白酶進(jìn)行越快，組織蛋白酶B降解越小且所測(cè)組織蛋白酶B活性相較生物樣品中組織蛋白酶B實(shí)際潛在可用活性的偏差越小。本發(fā)明方法宜在作為生物樣品的血液、血漿、血清或組織勻漿中進(jìn)行。由于某些血液組分的固有熒光，特別優(yōu)選使用血清作為生物樣品。本發(fā)明方法還可用組織勻漿進(jìn)行，然而這需要來(lái)自患者的活檢以及手術(shù)干預(yù)和將組織加工成流體樣品。因此，血清和血漿相對(duì)血液和組織勻漿特別優(yōu)選。本發(fā)明將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B后以及從樣品中移出組織蛋白酶B的游離抑制劑和通過(guò)對(duì)蛋白酶抑制 劑親和性高于組織蛋白酶B的酶來(lái)撤出蛋白酶抑制劑而去抑制組織蛋白酶B后，通過(guò)將樣品接觸組織蛋白酶B的底物和記錄通過(guò)蛋白酶組織蛋白酶B的底物蛋白水解反應(yīng)來(lái)測(cè)定樣品中活性組織蛋白酶B的活性。對(duì)于此目的，可使用一些組織蛋白酶B的底物。特別優(yōu)選組織蛋白酶B的底物，包括二或寡肽序列和熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)能通過(guò)蛋白酶組織蛋白酶B的底物蛋白水解反應(yīng)而從寡肽序列中切割，其中特定優(yōu)選的熒光團(tuán)是7-氨基-4-(三氟甲基)香豆素(AFC)或7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)，AFC尤其優(yōu)選。熒光團(tuán)AFC或AMC經(jīng)C末端結(jié)合二或寡肽序列。在蛋白水解反應(yīng)中，所述熒光團(tuán)從二或寡肽序列中切割。從半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶B中特異性識(shí)別并且切割的二肽序列示例是Arg-Arg。因此，例如，Z-Arg-Arg-AFC適合作為底物，其中Z是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選乙酸酯基團(tuán)或羧基芐基基團(tuán)。組織蛋白酶B的底物優(yōu)選具有以下特征性特性包括二或寡肽序列和熒光團(tuán)的未切割底物所具有的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)顯著不同于所述熒光團(tuán)的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)，其在蛋白水解反應(yīng)中由蛋白酶切割，至少20nm，優(yōu)選至少40nm或更多。如果非切割底物和切割熒光團(tuán)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)或最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)相同或彼此接近，則記錄測(cè)量中非切割底物的固有熒光以及切割熒光團(tuán)的熒光發(fā)射。具有相同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的這類底物和熒光團(tuán)為本領(lǐng)域熟知。在這類底物情況中，盡管有一致的熒光發(fā)射波長(zhǎng)，如果熒光團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度在同一或相似波長(zhǎng)相較非切割底物顯著更高，則測(cè)量可行。在此情況中，信號(hào)增加是相較無(wú)酶負(fù)對(duì)照的酶活性量度。然而，這種底物的缺點(diǎn)是僅能在強(qiáng)酶活性情況下測(cè)量結(jié)果并因而具有很明顯的熒光發(fā)射增加，因?yàn)樾盘?hào)在酶活性小的情況下通常太弱且不與非切割底物的固有熒光充分區(qū)分。信號(hào)在噪音中喪失或至少不以顯著方式與其相區(qū)分。所述底物和經(jīng)切割熒光團(tuán)間的熒光發(fā)射檢測(cè)波長(zhǎng)位移具有特定優(yōu)勢(shì)，即在此波長(zhǎng)基本只記錄從底物中切割的熒光團(tuán)并因此僅酶反應(yīng)實(shí)際發(fā)生。經(jīng)切割熒光團(tuán)發(fā)射波長(zhǎng)與所述底物熒光波長(zhǎng)間的距離越大，蛋白酶活性測(cè)定可越靈敏。在底物有二肽Arg-Arg和共價(jià)結(jié)合所述二肽C末端的熒光團(tuán)的情況中，熒光發(fā)射在藍(lán)色波長(zhǎng)區(qū)(ca. 460nm)，而AFC熒光團(tuán)本身具有黃-綠熒光(ca. 505nm)。此情況確保非切割底物和在酶反應(yīng)中切割的純熒光團(tuán)之間有足夠的波長(zhǎng)距離。使用AFC熒光團(tuán)與AMC熒光團(tuán)相比特別優(yōu)選，因?yàn)橛啥腁rg-Arg和AMC熒光團(tuán)組成的底物與游離AMC熒光團(tuán)的熒光發(fā)射都在藍(lán)色波長(zhǎng)區(qū)(ca. 460nm)。此情況中非切割底物和經(jīng)切割熒光團(tuán)間的區(qū)分僅能通過(guò)信號(hào)強(qiáng)度而非發(fā)射波長(zhǎng)。在本發(fā)明方法中，可使生物樣品以不同方式接觸酶，所述酶對(duì)蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B且具有移出樣品中游離的組織蛋白酶B抑制劑并使其退出組織蛋白酶B抑制形式的功能。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式中，所述酶以游離形式加入，宜溶于緩沖溶液。所述酶在樣品中分散并會(huì)結(jié)合蛋白酶抑制劑，因而還使該抑制劑離開(kāi)樣品中的組織蛋白酶B。為了在本方法后續(xù)步驟中測(cè)量組織蛋白酶B的濃度或活性，所述酶可保留在樣品中，只要它不干擾蛋白酶組織蛋白酶B與底物的特異性蛋白水解反應(yīng)和隨后記錄。此變體具有特定優(yōu)勢(shì)組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B和組織蛋白酶B去抑制可以簡(jiǎn)單方式在單一反應(yīng)容器中進(jìn)行，例如在用于隨后測(cè)量后續(xù)酶檢測(cè)熒光的比色皿中。在本發(fā)明方法的一個(gè)替代實(shí)施方式中，所述酶對(duì)蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B且具有就組織蛋白酶B而言移出樣品中的游離抑制劑并撤出組織蛋白酶B抑制形式的蛋白酶抑制劑的功能，所述酶共價(jià)結(jié)合或以吸附方式結(jié)合剛性載體，優(yōu)選結(jié)合纖維素，特別優(yōu)選共價(jià)結(jié)合纖維素，其中 共價(jià)結(jié)合可以化學(xué)或光化學(xué)方式實(shí)現(xiàn)。使用結(jié)合有對(duì)蛋白酶抑制劑有高親和性的酶的剛性載體具有以下優(yōu)勢(shì)該酶與結(jié)合其的樣品中蛋白酶抑制劑在活性測(cè)量期間不保留在樣品中且因此不引起任何干擾。所述載體可具有任何形狀。例如，所述載體形狀可為結(jié)合酶的箔或條，其通過(guò)浸潰與樣品接觸。反應(yīng)時(shí)間后，所述載體從樣品中移出且隨后進(jìn)行活性組織蛋白酶B測(cè)定。浸潰到樣品中可一次或數(shù)次進(jìn)行，從而盡可能定量地撤出蛋白酶抑制劑。所述載體能可以另一形狀提供，所述形狀能使流體樣品與結(jié)合酶的載體表面緊密接觸。例如，所述載體的形狀可為薄管或毛細(xì)管，其內(nèi)表面結(jié)合酶且樣品通過(guò)其。此外，所述載體的形狀可為顆粒、珠等，其內(nèi)表面結(jié)合酶。通過(guò)將顆粒材料浸潰到流體樣品中且若需要通過(guò)移動(dòng)樣品中的顆粒，使酶與樣品緊密接觸并隨后通過(guò)離心、沉淀、過(guò)濾或簡(jiǎn)單抽吸流體樣品去除來(lái)分離。如上所述，在本發(fā)明方法的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方式中，將樣品接觸能通過(guò)蛋白水解消化使組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式的第一酶的步驟a)用胃蛋白酶或組織蛋白酶B作為第一酶來(lái)進(jìn)行。有利地，此步驟a)在4-40° C范圍的溫度進(jìn)行，優(yōu)選20-40° C，pH值范圍為3. 5-5. 5，優(yōu)選4. 0-5. O范圍，特別優(yōu)選約4. 5。胃蛋白酶在酸性PH范圍內(nèi)具有其最高蛋白水解活性且在高于6的pH值基本失活。因此，宜將生物樣品分別設(shè)置成前述范圍中的PH值或緩沖樣品，從而提供胃蛋白酶或組織蛋白酶B1的最優(yōu)蛋白水解消化。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，將樣品接觸對(duì)蛋白酶抑制劑親和性高于組織蛋白酶B和能移出樣品中游離抑制劑并使蛋白酶抑制劑退出組織蛋白酶B抑制形式的第二酶的步驟b)在4-40° C范圍的溫度進(jìn)行，優(yōu)選20-40° C，pH值范圍為2_7，優(yōu)選4. 5_6。如果第二酶在與其用于切割組織蛋白原B的前述步驟a)相同的條件下行使其去抑制功能，則涉及溫度和PH值的反應(yīng)條件可維持。若通過(guò)第二酶去抑制的最優(yōu)效果需要溫度和/或PH值變化，則反應(yīng)條件需改變。趨向更佳和對(duì)第二酶優(yōu)化值的pH值變化可通過(guò)添加合適酸或堿或合適緩沖液來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還包括測(cè)定樣品中組織蛋白酶B前體形式，即組織蛋白原B的方法，其中i)用第一部分的生物樣品，組織蛋白酶B潛在可用活性的第一測(cè)定根據(jù)本文所述和要求權(quán)利的方法進(jìn)行，其中所述方法步驟a)中，樣品內(nèi)存在的組織蛋白原B還轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式，ii)用第二部分的生物樣品，組織蛋白酶B潛在可用活性的第二測(cè)定根據(jù)本文所述和要求權(quán)利的方法進(jìn)行，其中所述方法步驟a)的第二測(cè)定沒(méi)有進(jìn)行，樣品中存在的組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式，iii)來(lái)自樣品中組織蛋白原B的組織蛋白酶B潛在可用活性計(jì)算為第一測(cè)定i)與第二測(cè)定ii)間的差異值。此方式計(jì)算的差異值對(duì)應(yīng)于潛在組織蛋白酶B活性，其可通過(guò)將樣品中存在的組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B而從組織蛋白原B獲得。本發(fā)明通過(guò)下列實(shí)施例和優(yōu)選實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步解釋。I)樣品的制備和供應(yīng)

1. a)血液根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法凝固，離心后獲得血清，所述血清進(jìn)行分配并裝入EP管且在液氣溫度保存直到完成實(shí)驗(yàn)。1. b)組織勻漿根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法獲自組織樣品，然后分配，裝入EP管且在液氮溫度保存直到完成測(cè)量。2)樣品中的組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式2. a)通過(guò)與胃蛋白酶反應(yīng)由于組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式的最優(yōu)pH值是4. 5，下列實(shí)驗(yàn)在此PH值下進(jìn)行。為此，O. 2ml血清樣品用乙酸鹽緩沖液(pH=4. 5)1:1稀釋，其中豬胃蛋白酶已溶解。此溶液在30° C孵育20分鐘。然后就酶檢測(cè)而言,溶液的pH值通過(guò)磷酸鹽緩沖液設(shè)為6。2. b)通過(guò)與組織蛋白酶D反應(yīng)對(duì)于此轉(zhuǎn)變,O. 2ml血清樣品也用乙酸鹽緩沖液1:1稀釋至pH=4. 5,其中人組織蛋白酶D已溶解。此溶液隨后在37° C孵育4小時(shí)。然后就酶檢測(cè)而言,溶液的pH值通過(guò)磷酸鹽緩沖液設(shè)為6。2. c)通過(guò)降低pH值0.2ml血清樣品用乙酸鹽緩沖液1:1稀釋至pH=4. 5且隨后30° C孵育40分鐘。然后就酶檢測(cè)而言，溶液的pH值通過(guò)磷酸鹽緩沖液設(shè)為6。3)如何制備蛋白水解功能失活的“改性”木瓜蛋白酶3. a)預(yù)處理固定的木瓜蛋白酶市售可得的木瓜蛋白酶瓊脂糖懸于50%甘油、含O. 05%Na-N3的乙酸鈉緩沖液(O. 1Μ，ρΗ=4. 5)。因此，此溶液首先相對(duì)磷酸鹽緩沖液pH=6交換。使用每次酶檢測(cè)50 μ I木瓜蛋白酶-瓊脂糖凝膠(=100 μ I懸液)。這對(duì)應(yīng)于5. 5 · ΙΟ,ΜοΙ木瓜蛋白酶。因此，對(duì)于32次測(cè)定，使用3. 2ml懸液。相對(duì)磷酸鹽緩沖液交換通過(guò)添加緩沖液、重懸浮、離心和棄上清的4重順序來(lái)進(jìn)行。共價(jià)結(jié)合纖維素的木瓜蛋白酶在直徑IlOmm的濾紙上可得，其可分成32個(gè)相同部分，其中各部分具有與50 μ I木瓜蛋白酶-瓊脂糖凝膠大致相同的木瓜蛋白酶部分。3.b)固定的木瓜蛋白酶與甲基甲硫磺酸酯(MMTS)反應(yīng)對(duì)于如上所述獲得的木瓜蛋白酶-瓊脂糖凝膠，添加含5mM MMTS的磷酸鹽緩沖液(pH=6)溶液且隨后重懸浮。為了進(jìn)一步應(yīng)用，離心該凝膠和棄上清。共價(jià)結(jié)合木瓜蛋白酶的纖維素濾器浸潰到含5mM MMTS的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6)，然后移出并分成各部分用于進(jìn)一步應(yīng)用。3. c)固定的木瓜蛋白酶與對(duì)萊苯甲酸鹽反應(yīng) 對(duì)于如上所述獲得的木瓜蛋白酶-瓊脂糖凝膠，添加含O. 02 μ Mol對(duì)汞苯甲酸鹽的磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ=6)并重懸浮。為了進(jìn)一步應(yīng)用，離心該凝膠和棄上清。為移出過(guò)量試劑，添加磷酸鹽緩沖液(ρΗ=6)、重懸浮、離心和棄上清的循環(huán)應(yīng)用4次。共價(jià)結(jié)合木瓜蛋白酶的纖維素濾器浸潰到含2mM對(duì)汞苯甲酸鹽的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6)，然后移出并分成各部分用于進(jìn)一步應(yīng)用。3. d)固定的木瓜蛋白酶與N-乙基馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)對(duì)于如上所述獲得的木瓜蛋白酶-瓊脂糖凝膠,添加含2mM N-乙基馬來(lái)酰亞胺的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6)并重懸浮。為了進(jìn)一步應(yīng)用，離心該凝膠和棄上清。為移出過(guò)量試齊U，添加磷酸鹽緩沖液(PH=6)、重懸浮、離心和棄上清的循環(huán)應(yīng)用4次。共價(jià)結(jié)合木瓜蛋白酶的纖維素濾器浸潰到含2mM N-乙基馬來(lái)酰亞胺的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6)，然后移出并分成各部分用于進(jìn)一步應(yīng)用。4)從樣品中移出游離抑制劑和去抑制組織蛋白酶B4. a)將樣品接觸固定的改性木瓜蛋白酶固定于瓊脂糖凝膠的改性木瓜蛋白酶如下使用對(duì)于用磷酸鹽緩沖液(pH=6)1:1稀釋且其中組織蛋白原B已轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B的160 μ I血清樣品，在EP管中加入50 μ I改性木瓜蛋白酶-瓊脂糖凝膠，然后凝膠重懸浮且反應(yīng)容器在完全去抑制后于IOOOOrpm離心。從上清轉(zhuǎn)移110 μ I到O. 5ml反應(yīng)容器以酶促測(cè)定組織蛋白酶B活性?；蛘撸矁r(jià)結(jié)合纖維的改性木瓜蛋白酶如下使用用磷酸鹽緩沖液(pH=6) 1:1稀釋且其中組織蛋白原B已轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B的160 μ I血清樣品在EP管中通過(guò)浸潰直至完全去抑制來(lái)接觸一片共價(jià)結(jié)合約5，5 · IO^10MoI改性木瓜蛋白酶的纖維素。隨后從溶液中移出纖維素部分。從去抑制血清樣品中轉(zhuǎn)移110 μ I到O. 5ml反應(yīng)容器以酶促測(cè)定組織蛋白酶B活性。4. b)將樣品接觸固定的非改性木瓜蛋白酶和隨后的改性木瓜蛋白酶固定于瓊脂糖凝膠的改性木瓜蛋白酶如下使用對(duì)于用磷酸鹽緩沖液(pH=6)1:1稀釋且其中組織蛋白原B已轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B的160 μ I血清樣品，在EP管中加入50 μ I木瓜蛋白酶-瓊脂糖凝膠，然后凝膠重懸浮且反應(yīng)容器在IOOOOrpm離心30秒。上清轉(zhuǎn)移到O. 5ml反應(yīng)容器并加入50 μ I改性木瓜蛋白酶。凝膠重懸浮且反應(yīng)容器在完全去抑制后于IOOOOrpm離心。從上清轉(zhuǎn)移110 μ I到O. 5ml反應(yīng)容器以酶促測(cè)定組織蛋白酶B活性?；蛘?，共價(jià)結(jié)合纖維的非改性木瓜蛋白酶如下使用用磷酸鹽緩沖液(pH=6) 1:1稀釋且其中組織蛋白原B已轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B的160 μ I血清樣品在EP管中通過(guò)浸潰來(lái)接觸一片共價(jià)結(jié)合約5，5 -1O-10Mol木瓜蛋白酶的纖維素，然后從溶液中移出纖維素片。此溶液中，共價(jià)結(jié)合約5. 5 · IO-10Mol改性木瓜蛋白酶的另一纖維素片進(jìn)行浸潰且在完全去抑制后移出。然后，將110 μ I樣品轉(zhuǎn)移到O. 5ml反應(yīng)容器以酶促測(cè)定組織蛋白酶B活性。5)通過(guò)固定的木瓜蛋白酶將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B，同時(shí)移出游離抑制劑庫(kù)且隨后通過(guò)固定的改性木瓜蛋白酶去抑制組織蛋白酶B固定于瓊脂糖凝膠的木瓜蛋白酶如下使用對(duì)于用磷酸鹽緩沖液(pH=6) 1:1稀釋的160 μ I血清樣品，在EP管中加入50 μ I木瓜蛋白酶-瓊脂糖凝膠，然后凝膠重懸浮且反應(yīng)容器在IOOOOrpm離心30秒。上清轉(zhuǎn)移到O. 5ml反應(yīng)容器并加入50 μ I改性木瓜蛋白酶，凝膠重懸浮且反應(yīng)容器在完全去抑制后于IOOOOrpm離心。將110 μ I上清轉(zhuǎn)移到O. 5ml反應(yīng)容器以酶促測(cè)定組織蛋白酶B活性。或者，加入50 μ I木瓜蛋白酶-瓊脂糖凝膠和重懸浮后，向懸液中加入5mMMMTS且反應(yīng)容器在完全去抑制后于IOOOOrpm離心。將110 μ I上清轉(zhuǎn)移到O. 5ml反應(yīng)容器以酶促測(cè)定組織蛋白酶B活性。共價(jià)結(jié)合纖維素的非改性木瓜蛋白酶如下使用用磷酸鹽緩沖液(pH=6)l:l稀釋的160 μ I血清樣品在EP管中通過(guò)浸潰來(lái)接觸一片共價(jià)結(jié)合約5，5 ·IO-10Mol木瓜蛋白酶的纖維素，然后從溶液中移出纖維素片。此樣品中，一片共價(jià)結(jié)合約5，5 · IO-10Mol改性木瓜蛋白酶的纖維素進(jìn)行浸潰且在完全去抑制后移出。然后，將110 μ I樣品轉(zhuǎn)移到O. 5ml反應(yīng)容器以酶促測(cè)定組織蛋白酶B活性?；蛘?，在第一次浸潰共價(jià)結(jié)合木瓜蛋白酶的纖維素片后，向血清中加入5mM MMTS且纖維素片在去抑制完成后從樣品中移出。然后，將110 μ I樣品轉(zhuǎn)移到O. 5ml反應(yīng)容器以酶促測(cè)定組織蛋白酶B活性。6)測(cè)丨量樣品中的組織蛋白酶B活件對(duì)于如所述處理的110 μ I血清樣品，在O. 5ml反應(yīng)容器中加入110 μ I底物溶液(70μΜ Z-Arg-Arg-AFC)，其pH值由磷酸鹽緩沖液設(shè)為ρΗ=6且包含5mM EDTA和IOmM DTE?；旌虾螅瑯悠吩?7° C孵育120分鐘。隨后反應(yīng)容器用冰冷卻，離心一小段時(shí)間以使反應(yīng)容器帽上冷凝的水回到溶液中然后記錄熒光發(fā)射，用熒光讀取儀在微量滴定板上或用熒光計(jì)在比色皿中記錄。激發(fā)波長(zhǎng)在約400nm，合適的檢測(cè)波長(zhǎng)在約505nm。在加入人工半胱氨酸蛋白酶特異性抑制劑E64和組織蛋白酶B特異性抑制劑CA-074到酶檢測(cè)后，測(cè)量信號(hào)與檢測(cè)信號(hào)相同，后者是在撤出抑制劑前進(jìn)行酶檢測(cè)時(shí)獲得的。因此，有證據(jù)顯示撤出抑制劑后在酶檢測(cè)中測(cè)量的值與釋放的組織蛋白酶B有關(guān)。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定生物樣品中組織蛋白酶B潛在可用活性的方法，包括組織蛋白酶B活性形式的活性，能從樣品中存在的前體形式組織蛋白原B激活的組織蛋白酶B形式，和能被激活且在樣品中由蛋白酶抑制劑抑制其活性的組織蛋白酶B形式，所述方法有下列步驟 a)通過(guò)以下方式將所述樣品中存在的組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式 a.1)將所述樣品接觸第一酶(蛋白水解酶)，所述酶的功能性是通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式，或 a.1i)將pH值降低到某一值，在該處組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式， b)通過(guò)將所述樣品接觸第二酶(抑制劑結(jié)合酶)來(lái)耗盡所述樣品中組織蛋白酶B的游離蛋白酶抑制劑或阻遏其抑制劑功能并從組織蛋白酶B受抑制形式中撤出蛋白酶抑制劑，所述第二酶能結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑且對(duì)所述蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B，其中 b.1)所述第一酶(蛋白水解酶)和所述第二酶(抑制劑結(jié)合酶)是相同的酶，前提是所述酶具有通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式以及結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能且對(duì)該蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B， 或 b.1i)若使用，所用的第二酶(抑制劑結(jié)合酶)不同于所述第一酶(蛋白水解酶)， 其中 -第二酶(抑制劑結(jié)合酶)是沒(méi)有降解組織蛋白酶B的蛋白水解活性的酶，或 -第二酶(抑制劑結(jié)合酶)是有降解組織蛋白酶B的蛋白水解活性的酶，所述第二酶降解組織蛋白酶B的該蛋白水解活性在所述樣品中于步驟b)的反應(yīng)時(shí)間后失活，或所述第二酶從所述樣品中移出并由某一酶替代，所述某一酶沒(méi)有降解組織蛋白酶B的活性但能結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑且對(duì)所述蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B， c)將所述樣品接觸組織蛋白酶B的底物并記錄由蛋白酶組織蛋白酶B催化的底物蛋白水解反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，具有通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式的功能的所述第一酶(蛋白水解酶)是沒(méi)有降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性的水解酶，優(yōu)選胃蛋白酶或組織蛋白酶D或組織蛋白酶C或嗜熱菌蛋白酶或鏈霉蛋白酶，特別優(yōu)選胃蛋白酶或組織蛋白酶D，且所用的第二酶(抑制劑結(jié)合酶)不同于第一酶(蛋白水解酶)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所用的第二酶(抑制劑結(jié)合酶)是木瓜蛋白酶，具有結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能且對(duì)所述蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B，其中木瓜蛋白酶降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性在所述樣品中于反應(yīng)時(shí)間后活化或木瓜蛋白酶從所述樣品中移出并由某一酶替代，所述某一酶沒(méi)有降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性但具有結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能且對(duì)所述蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述使用的第一酶(蛋白水解酶)和第二酶(抑制劑結(jié)合酶)是相同的酶，即木瓜蛋白酶，其具有通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式以及結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能并且對(duì)所述蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B，其中木瓜蛋白酶降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性在反應(yīng)時(shí)間后活化或木瓜蛋白酶從所述樣品中移出并由某一酶替代，所述某一酶沒(méi)有降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性但具有結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能且對(duì)所述蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述樣品中的木瓜蛋白酶在反應(yīng)時(shí)間后轉(zhuǎn)化成改性木瓜蛋白酶，所述改性木瓜蛋白酶就組織蛋白酶B降解而言具有失活的蛋白酶活性，其中缺乏蛋白酶活性的改性木瓜蛋白酶可通過(guò)化學(xué)修飾木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心內(nèi)半胱氨酸的SH-基團(tuán)來(lái)制備，優(yōu)選通過(guò)木瓜蛋白酶與甲基甲硫磺酸酯(MMTS)、對(duì)汞苯甲酸鹽或AgNO3反應(yīng)或通過(guò)添加N-取代馬來(lái)酰亞胺。
6.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述樣品中的木瓜蛋白酶在反應(yīng)時(shí)間后移出并由改性木瓜蛋白酶替代，所述改性木瓜蛋白酶缺乏降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性，但具有結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能且對(duì)所述蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B，其中缺乏蛋白酶活性的改性木瓜蛋白酶可如下制備 a)木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心內(nèi)半胱氨酸的SH-基團(tuán)的化學(xué)修飾，優(yōu)選通過(guò)木瓜蛋白酶與甲基甲硫磺酸酯(MMTS)、對(duì)汞苯甲酸鹽或AgNO3反應(yīng)或通過(guò)添加N-取代馬來(lái)酰亞胺，或通過(guò) b)由另一氨基酸在木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心內(nèi)的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)突變。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述使用的第二酶(抑制劑結(jié)合酶)是改性的木瓜蛋白酶，具有結(jié)合組織蛋白酶B的蛋白酶抑制劑的功能且對(duì)所述蛋白酶抑制劑的親和性高于組織蛋白酶B，但缺乏通過(guò)蛋白水解消化將組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式的功能和缺乏降解組織蛋白酶B的蛋白酶活性，其中缺乏蛋白酶活性的改性木瓜蛋白酶可如下制備 a)木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心內(nèi)半胱氨酸的SH-基團(tuán)的化學(xué)修飾，優(yōu)選通過(guò)木瓜蛋白酶與甲基甲硫磺酸酯(MMTS)、對(duì)汞苯甲酸鹽或AgNO3反應(yīng)或通過(guò)添加N-取代馬來(lái)酰亞胺，或通過(guò) b)由另一氨基酸在木瓜蛋白酶的蛋白水解活性中心內(nèi)的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)突變。
8.如權(quán)利要求1、4或5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第二酶(抑制劑結(jié)合酶)就組織蛋白酶B而言的蛋白酶活性的滅活在5分鐘的步驟b)反應(yīng)時(shí)間后進(jìn)行，優(yōu)選3分鐘的步驟b)反應(yīng)時(shí)間后，尤其優(yōu)選I分鐘的步驟b)反應(yīng)時(shí)間后。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是血液、血漿、或血清或組織勻漿。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織蛋白酶B的底物包括二或寡肽序列和熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)能在底物蛋白水解反應(yīng)期間由蛋白酶組織蛋白酶B從寡肽序列中切割，其中所述熒光團(tuán)優(yōu)選7-氨基-4-(三氟甲基)香豆素(AFC)或7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一酶(蛋白水解酶)優(yōu)選木瓜蛋白酶，共價(jià)結(jié)合或以吸附方式結(jié)合載體，優(yōu)選結(jié)合瓊脂糖凝膠或纖維素，特別優(yōu)選共價(jià)結(jié)合纖維素，尤其優(yōu)選共價(jià)結(jié)合化學(xué)或光化學(xué)方式獲得的纖維素。
12.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述將樣品接觸能通過(guò)蛋白水解消化使組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式的第一酶(蛋白水解酶)的步驟a)在4-40° C范圍的溫度完成，優(yōu)選20-40° C，pH值范圍為1-6，優(yōu)選2-5，特別優(yōu)選4. 5。
13.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述將樣品接觸第二酶(抑制劑結(jié)合酶)的步驟b)在4-40° C范圍的溫度完成，優(yōu)選20-40° C，pH值范圍為2_7，優(yōu)選4.5-6 ο
14.一種測(cè)定樣品中組織蛋白酶B前體形式組織蛋白原B的方法，其中 i)用生物樣品的第一部分，根據(jù)前述權(quán)利要求之一進(jìn)行組織蛋白酶B潛在可用活性的第一測(cè)定， )用相同生物樣品的第二部分，根據(jù)前述權(quán)利要求之一進(jìn)行組織蛋白酶B潛在可用活性的第二測(cè)定，然而，其中所述方法步驟a)的第二測(cè)定沒(méi)有進(jìn)行，其中所述樣品中存在的組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式， iii)來(lái)自樣品中組織蛋白原B的組織蛋白酶B的潛在可用活性計(jì)算為第一測(cè)定i)與第二測(cè)定ii)間的差異值。
全文摘要
一種測(cè)定生物樣品中組織蛋白酶B潛在可用活性的方法，包括組織蛋白酶B活性形式的活性，能從樣品中存在的前體形式組織蛋白原B激活的組織蛋白酶B形式，和能被激活且在樣品中由蛋白酶抑制劑抑制其活性的組織蛋白酶B形式，其中樣品中存在的組織蛋白原B轉(zhuǎn)變成組織蛋白酶B活性形式，樣品中所存在組織蛋白酶B的游離蛋白酶抑制劑從樣品中耗盡或其抑制劑功能受遏制，且蛋白酶抑制劑從組織蛋白酶B抑制形式中退出，然后測(cè)定樣品中活性組織蛋白酶B的活性。
文檔編號(hào)C12Q1/37GK103038360SQ201180033281
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者H·J·邁耶, H·J·莫克 申請(qǐng)人:帕普斯特許可有限兩合公司