專利名稱：：冷活性蛋白酶cp70的制作方法
背景技術(shù)：
：(ⅰ)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在低溫下具有高活性的一種蛋白酶和它的應(yīng)用。(ⅱ)相關(guān)技術(shù)的描述長期以來人們已經(jīng)知道嗜冷細(xì)菌，并且在低溫環(huán)境中可廣泛地證實(shí)它們的存在。例如，可從土壤、水產(chǎn)品、乳制品以及人工低溫環(huán)境中分離嗜冷細(xì)菌。已經(jīng)根據(jù)食品微生物學(xué)的要求進(jìn)行嗜冷細(xì)菌的研究，但主要限于關(guān)于微生物種系發(fā)生的那些研究。預(yù)期從嗜冷細(xì)菌獲得的酶是在低溫范圍內(nèi)具有最佳溫度的冷活性酶。認(rèn)為可將在低溫下有效地作用的冷活性酶能夠加入例如即使在低溫的水中也可使用的洗滌劑。也認(rèn)為可應(yīng)用于在常溫下?lián)]發(fā)的有機(jī)溶劑存在下的化學(xué)反應(yīng)和在食品不會(huì)腐敗的低溫下食品質(zhì)量的提高。而且，對(duì)從嗜冷細(xì)菌獲得的酶的研究十分有趣地揭示了嗜冷細(xì)菌的生理功能和適應(yīng)低溫機(jī)制。發(fā)明概述本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可從大比目魚黃桿菌P104株培養(yǎng)基的上清液中分離一種蛋白酶，然后純化，所述分離和純化的蛋白酶在低溫下有活性。本發(fā)明基于這種認(rèn)識(shí)。因此，本發(fā)明的目的是提供一種冷活性蛋白酶。本發(fā)明的另一目的是提供利用大比目魚黃桿菌P104株制備上述冷活性蛋白酶的方法。本發(fā)明的再一目的是提供包含存在于所述冷活性蛋白酶N末端的氨基酸序列的肽。按照本發(fā)明的蛋白酶具有部分或全部的以下物理化學(xué)性質(zhì)。-比活和底物專一性該蛋白酶作用于酪蛋白、明膠、血紅蛋白和白蛋白，按照酪蛋白、明膠、血紅蛋白和白蛋白的次序特異地分解它們。-最適pH:8.0-pH穩(wěn)定性該蛋白酶在pH6.5至pH10.0的范圍內(nèi)于30℃穩(wěn)定1小時(shí)。按照本發(fā)明的蛋白酶還具有部分或全部以下物理化學(xué)性質(zhì)。-最適溫度大約40℃-溫度穩(wěn)定性在pH7為1小時(shí)，該蛋白酶在30℃以下的溫度幾乎不失活，但在40℃失活大約40％，而在50℃在大約10分鐘內(nèi)完全失活。-酶活性該蛋白酶在20℃具有它的最大活性的大約50％或更多的活性。-該酶的活性中心是絲氨酸。-用SDS-PAGE測(cè)定該蛋白酶的分子量大約為70kDa。此外，按照本發(fā)明的該蛋白酶包括含有部分或全部SEQIDNO:1所述氨基酸序列的蛋白、或在其N末端含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白。按照本發(fā)明的另一方面，我們提供在20℃具有其最大活性的大約50％或更多活性的蛋白酶。按照本發(fā)明的其它方面，我們提供一種蛋白酶，它包括含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白、或在其N末端含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白。按照本發(fā)明制備上述蛋白酶的方法，包括培養(yǎng)大比目魚黃桿菌P104(FERMBP-5006)用來產(chǎn)生蛋白酶，然后從其培養(yǎng)基中收集該蛋白酶的步驟。附圖簡述圖1圖示按照本發(fā)明的酶的純化結(jié)果。圖2圖示測(cè)定按照本發(fā)明的酶的分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3圖示pH對(duì)按照本發(fā)明的酶的酶促反應(yīng)的影響。每個(gè)黑色圓圈代表在pH7.0下按照本發(fā)明的酶，每個(gè)黑色三角形代表在pH10下按照本發(fā)明的酶，以及每個(gè)白色方塊在pH7下的Savinase。圖4圖示按照本發(fā)明的酶的pH穩(wěn)定性。每個(gè)黑色圓圈代表在10℃的測(cè)定值，每個(gè)黑色三角形代表在20℃的測(cè)定值，每個(gè)黑色方塊代表在30℃的測(cè)定值，每個(gè)白色圓圈代表在40℃的測(cè)定值，每個(gè)白色三角形代表在50℃的測(cè)定值，以及每個(gè)白色方塊代表在60℃的測(cè)定值。圖5圖示溫度對(duì)按照本發(fā)明的酶的酶促反應(yīng)的影響。圖6圖示按照本發(fā)明的酶的溫度穩(wěn)定性。本發(fā)明的詳細(xì)描述酶的特征按照本發(fā)明的酶的特征如下(1)比活和底物專一性按照本發(fā)明的酶作用于酪蛋白、明膠、血紅蛋白和白蛋白以特異地分解它們。該酶的底物專一性以酪蛋白、明膠、血紅蛋白和白蛋白的次序減低。(2)最適pH按照本發(fā)明的酶的最適pH是8.0。而且，在pH6.5至pH9.5范圍內(nèi)該酶保持最大活性的大約90％或更多。(3)pH穩(wěn)定性按照本發(fā)明的酶在pH6.5至pH10.0范圍內(nèi)，在30℃穩(wěn)定1小時(shí)。(4)最適溫度按照本發(fā)明的酶的最適溫度在pH10和pH7為40℃。在30℃溫度，在pH10該酶保持大約80％的最大活性，而在pH7該酶保持大約90％的最大活性。在50℃溫度，在pH10該酶保持大約10％的最大活性，而在pH7該酶保持大約80％的最大活性。關(guān)于市售酶savinase，它的最適溫度是60℃。另外，關(guān)于大多數(shù)已知的嗜冷酶，它們的最適溫度為大約40℃。因此，可認(rèn)為按照本發(fā)明的酶是一種嗜冷酶。(5)溫度穩(wěn)定性在pH7下1小時(shí)，按照本發(fā)明的酶在低于30℃的溫度下幾乎不失活，但它在40℃失活大約40％，而在50℃在大約10分鐘內(nèi)完全失活。因此，可認(rèn)為按照本發(fā)明的酶是一種嗜冷酶。(6)酶活性按照本發(fā)明的酶在20℃具有其最大活性的大約50％或更多。結(jié)果，按照本發(fā)明的另一方面，我們提供在20℃具有其最大活性的大約50％或更多的蛋白酶。(7)活性的抑制任何胃蛋白酶抑制劑、L-反式-環(huán)氧琥珀酰亮氨酸酰氨基-4-胍基丁烷(E-64)、碘乙酰氨和1,10-菲咯啉都不能抑制按照本發(fā)明的酶的蛋白酶活性，但它可被苯甲磺酰氯(PMSF)和乙二胺四乙酸(EDTA)明顯抑制。鑒于這個(gè)事實(shí)，可以提議按照本發(fā)明的酶是一種絲氨酸蛋白酶。因此，可認(rèn)為按照本發(fā)明的酶的活性中心是絲氨酸。(8)分子量按照本發(fā)明的酶以SDS-PAGE測(cè)定，具有大約70kDa的分子量。(9)N末端的氨基酸序列在SEQIDNO:1中描述了按照本發(fā)明的酶的N末端氨基酸序列。關(guān)于按照本發(fā)明的酶的N末端氨基酸序列，利用數(shù)據(jù)庫“Entrez”檢查了與已知蛋白的每個(gè)氨基酸序列的同源性，結(jié)果，顯然所述N末端氨基酸序列與已知蛋白的任何氨基酸序列沒有同源性。因此，按照本發(fā)明的蛋白酶可以包括含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白，或包括在其N末端含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白。而且，按照本發(fā)明的其它方面，我們提供包括含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白的蛋白酶，以及包括在其N末端含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白的蛋白酶。這種蛋白酶可以具有在上述(1)至(8)描述的這類特征。這里，“含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白”包括其中部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的N末端和/或C末端加入一個(gè)任選的氨基酸序列的蛋白。蛋白酶的制備方法利用微生物可生產(chǎn)按照本發(fā)明的蛋白酶。生產(chǎn)微生物屬于產(chǎn)黃菌屬，并且任何微生物都可用，只要它們具有產(chǎn)生蛋白酶的能力。具有生產(chǎn)按照本發(fā)明的蛋白酶的能力的微生物的優(yōu)選實(shí)施例是大比目魚黃桿菌P104株。該菌株是由本發(fā)明人從鮭魚的腸中分離的微生物，并且于1995年2月17日將它們保藏在工業(yè)科學(xué)技術(shù)局，生物技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERMBP-5006。在培養(yǎng)可用于本發(fā)明的菌株中，培養(yǎng)基可以是液體或固體，但通常使用用液體培養(yǎng)基的震蕩培養(yǎng)或通氣旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。作為這里培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基，可用任何培養(yǎng)基，只要它可生產(chǎn)蛋白酶。也就是說，作為碳源，可使用例如葡萄糖、海藻糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉和麥芽寡糖。作為氮源，可使用例如胨、酵母提取物、麥芽提取物、肉膏、大豆粉、棉子粉、球果漿、各種氨基酸和它們的鹽、以及硝酸鹽?？捎糜诒景l(fā)明的合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)睾鲜鎏荚春偷?、無機(jī)鹽(如磷酸鎂、鈣鹽、鈉鹽、鉀鹽、鐵鹽和錳鹽)以及其它需要的營養(yǎng)物。可適當(dāng)?shù)馗淖兣囵B(yǎng)條件，諸如pH和培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度，只要它們?cè)试S蛋白酶產(chǎn)生，但在震蕩培養(yǎng)或通氣旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的情況下，最好pH為大約中性，并且培養(yǎng)溫度為10℃至20℃。本發(fā)明的蛋白酶存在于細(xì)菌的細(xì)胞壁、所述細(xì)菌細(xì)胞和培養(yǎng)基的上清液中，并且它可以以任何形式使用，諸如細(xì)菌細(xì)胞、從所述細(xì)菌細(xì)胞或所述培養(yǎng)基上清液獲得的粗品酶或提取并純化的酶。另一方面，也可使用通過已知方法固定化的蛋白酶。為了從培養(yǎng)基收集和純化本發(fā)明的蛋白酶，可將已知的純化方法單獨(dú)使用或與其聯(lián)合使用。因?yàn)榘凑毡景l(fā)明的蛋白酶主要分泌到細(xì)胞外，即進(jìn)入培養(yǎng)基，因此通過借助于過濾或離心除去所述細(xì)菌細(xì)胞可容易地獲得粗品酶?？梢酝ㄟ^通過已知的純化方法進(jìn)一步純化該粗品酶。已知的優(yōu)選純化方法的實(shí)例包括用鹽(如硫酸胺)的鹽析法、用有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇或丙酮)的沉淀法、用粗制淀粉的吸收法、超濾法和各種層析方法，諸如凝膠過濾層析和離子交換層析。優(yōu)選純化方法的典型實(shí)施方案將在以下實(shí)施例中描述。酶的應(yīng)用按照本發(fā)明的嗜冷蛋白酶具有在低溫范圍內(nèi)的最適溫度。因此，本發(fā)明的嗜冷蛋白酶允許蛋白的分解反應(yīng)在低溫環(huán)境中進(jìn)行。例如，可通過將按照本發(fā)明的蛋白酶加入用于衣物的洗滌劑組合物，制備即使在低溫中也可使用的洗滌劑。除了加入按照本發(fā)明的嗜冷蛋白酶外，可根據(jù)常規(guī)方法制備該洗滌劑組合物。也就是說，可通過將本發(fā)明的蛋白酶與普通洗滌劑成分(諸如用于洗滌劑的表面活性劑、漂白劑、助洗劑等)混合形成該洗滌劑。而且，按照本發(fā)明的嗜冷蛋白酶能夠使所述反應(yīng)在低溫下進(jìn)行。因此，即使在所述反應(yīng)系統(tǒng)中存在一種在常溫下?lián)]發(fā)的有機(jī)溶劑，在有機(jī)溶劑成分不揮發(fā)的低溫下也可進(jìn)行所述反應(yīng)。此外，當(dāng)嘗試?yán)冒凑毡景l(fā)明的嗜冷蛋白酶提高食品的質(zhì)量時(shí)，反應(yīng)在低溫下有利地進(jìn)行，由此可有效地阻止食物腐敗。另外，因?yàn)樘峁┝税凑毡景l(fā)明的嗜冷蛋白酶，預(yù)期可促進(jìn)嗜冷細(xì)菌的生理機(jī)制和它們應(yīng)用于低溫機(jī)制的闡明。在N末端具有氨基酸序列的蛋白按照本發(fā)明的另一方面，我們提供由部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列組成的肽、包含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白以及在其N末端包含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白。該蛋白可以具有蛋白酶活性。這種肽或蛋白由部分或全部存在于按照本發(fā)明的酶N末端的氨基酸序列組成、或包含部分或全部的氨基酸序列(最好在N末端)。因此，在形成抗按照本發(fā)明的酶的抗體中，上述肽或蛋白作為抗原是有用的。參考實(shí)施例，將以更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不應(yīng)限于這些實(shí)施例。測(cè)試方法用Bio-rad蛋白分析(Bio-RadCo.，Ltd)，通過蛋白染色方法進(jìn)行蛋白的定量分析。而且，通過測(cè)定蛋白在280nm的紫外吸收進(jìn)行通過色譜分離蛋白的檢測(cè)。通過以下方法(a)或(b)測(cè)定蛋白酶的活性。(a)對(duì)偶氮酪蛋白的蛋白分解活性將0.05ml樣品酶溶液加入0.3ml的含1％(W/V)偶氮酪蛋白的67mM磷酸緩沖液(pH7)中，然后將該混合物在30℃保持30分鐘。此后，用1ml6％三氯醋酸溶液終止反應(yīng)。在室溫靜置大約15分鐘后，將該反應(yīng)溶液離心(15,000rpm，室溫，10分鐘)。利用分光光度計(jì)在340nm測(cè)定得到的上清液的吸收。一個(gè)AU定義為在所述條件下，吸光度每30分鐘增加1.0。(b)苯酚試劑方法將20μl樣品酶溶液加入130μl含1％(W/V)底物溶液的100mM甘氨酸-氯化鈉緩沖液(pH10)，并且將混合物在30℃保持1小時(shí)。此后，通過加入150μl三氯醋酸溶液(0.11M三氯醋酸、0.22M醋酸鈉和0.33M醋酸)終止反應(yīng)。在室溫靜置30分鐘后，將反應(yīng)液離心(10,000rpm，室溫，10分鐘)，并且將500μl0.5M碳酸鈉溶液和100μl用蒸餾水稀釋兩倍的苯酚溶液加入100μl得到的上清液中。將溶液在室溫靜置1小時(shí)后，測(cè)定在660nm的溶液的吸光度。實(shí)施例1(得自大比目魚黃桿菌P104株的蛋白酶的純化)(1)細(xì)菌菌株的培養(yǎng)為了使細(xì)菌的生長活性穩(wěn)定，將細(xì)菌菌株接種在150ml下述培養(yǎng)基中(分別倒入6個(gè)100ml三角錐瓶中)，并且利用三層搖床(tripleshaker)NR-80(TietecCo.,Ltd.)以140rpm在10℃進(jìn)行旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)48小時(shí)。作為主培養(yǎng)，將150ml預(yù)培養(yǎng)基接種到3升下述培養(yǎng)基中，并且利用實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵器LS-5(OrientalYeastCo.,Ltd.)以140rpm在10℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)75小時(shí)。培養(yǎng)基多種蛋白胨3g/l酵母提取物2.5g/l酪蛋白鈉2.5g/lNa2HPO4_12H2O3g/lMgSO4_7H2O0.2g/l(pH7.0)將所述培養(yǎng)基等用高壓滅菌器在1.2kgf/cm2(表壓)(121℃)，用高壓蒸汽滅菌15分鐘。(2)通過本發(fā)明純化酶每種蛋白酶在4℃純化。(a)離子交換層析通過離心(7,200×g,4℃,30分鐘)澄清在上述(1)獲得的培養(yǎng)基。得到的上清液作為粗品酶溶液經(jīng)過離子交換層析。用填滿2升DEAE瓊脂糖(Sephalose)快速流動(dòng)陰離子交換劑的INdEX100柱(ParmaciaBiotecCo.,Ltd.)作為柱子。將20mMtris緩沖液(pH7.0)以150cm/小時(shí)的線性速率導(dǎo)入上述柱子，以凝膠體積的5倍或更多(10升)平衡柱子。以100cm/小時(shí)的線性速率將粗品酶溶液導(dǎo)入柱子。通過用分別含0.2M、0.4M和0.6MNaCl的tris緩沖液(pH7.0)以100cm/小時(shí)的線性速率進(jìn)行洗脫，并且只將用UV計(jì)檢測(cè)到蛋白的部分分段分離。(b)超濾用設(shè)置一個(gè)Diaflo膜PM30(可分級(jí)分離分子量不低于30,000的物質(zhì))的新型攪拌型細(xì)胞8400(AmiconCo.,Ltd.)，處理以上獲得的分離部分，由此將分子量不低于30,000的蛋白濃縮。(c)用硫酸胺鹽析將硫酸胺加入在冰上冷卻的濃縮溶液，使得用硫酸胺可將該溶液飽和至50％。在0℃緩慢攪拌4小時(shí)后，通過離心(27,000×g,4℃,20分鐘)將該溶液沉淀，以獲得0至50％的飽和的部分。硫酸胺的加入量是在25℃得到飽和濃度需要的量。(d)凝膠過濾接著，通過HiLoad16/60Superdex200prepgrade柱(ParmaciaBiotecCo.,Ltd.)進(jìn)行凝膠過濾。用HiLoad系統(tǒng)50(ParmaciaBiotecCo.,Ltd.)作為儀器。將Bis-tris緩沖液(pH7)以大約60cm/小時(shí)的線性速率流過HiLoad16/60Superdex200制備級(jí)(prepgrade)柱以平衡柱子，Bis-tris緩沖液的量是凝膠體積的3倍或更多(400ml)。此后，將已經(jīng)過硫酸胺鹽析的5ml樣品酶溶液通過用Superloop導(dǎo)入柱子。然后，以60cm/小時(shí)的線性速率，用Bi-tris緩沖液(pH7)進(jìn)行洗脫，以每5ml分部收集分離部分。(e)接著，用HiLoad16/10Q瓊脂糖HP柱進(jìn)行離子交換層析。將20mMBis-tris緩沖液(pH7)以大約150cm/小時(shí)的線性速率導(dǎo)入柱子，以凝膠體積的5倍或更多(100ml)平衡柱子。將通過凝膠過濾洗脫的蛋白酶活性部分的樣品酶溶液以90cm/小時(shí)的線性速率，用Superloop導(dǎo)入柱子。接著，以90cm/小時(shí)的線性速率用含1MNaCl的150mlBis-tris緩沖液(pH7)，按照線性離子強(qiáng)度增加梯度(0至1M)進(jìn)行洗脫，以每5ml收集分離部分。上述純化的結(jié)果顯示在表1。表1(蛋白酶純化的結(jié)果)<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="513">總量(ml)蛋白(mg)酶活性(AU)培養(yǎng)基DEAE瓊脂糖超濾用硫酸胺鹽析凝膠過濾(Superdex200pg)Q瓊脂糖193018502574161067.843.04.984930.3740.29953025759.017.19.536.55</table></tables>表1(續(xù))<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="513">比活(×103AUmg-1)回收率(％)純化程度(倍)培養(yǎng)基DEAE瓊脂糖超濾用硫酸胺鹽析凝膠過濾Q瓊脂糖4.063.2246.1870593219210048.511.132110.79411.4215393540</table></tables>實(shí)施例3(按照本發(fā)明的純化酶的純度和分子量測(cè)定)利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定按照本發(fā)明的純化酶的純度和分子量。用厚度為1mm的10％聚丙烯酰胺凝膠作為支持物。通過對(duì)凝膠施加20mA的電流進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)(BPB)到達(dá)下端。將凝膠板用含0.02％考馬斯亮藍(lán)R250的30％甲醇-10％乙酸水溶液染色1小時(shí)，并且然后用脫色劑(30％甲醇和10％乙酸溶液)脫色過夜。SDS-PAGE的結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線分別顯示在圖1和圖2。實(shí)施例4(pH對(duì)酶促反應(yīng)的影向)用本發(fā)明的酶在各種pH值下分解偶氮酪蛋白。反應(yīng)溶液的緩沖液的濃度為100mM濃度，它們是乙酸鈉-乙酸緩沖液(pH4.0-5.5)、MES(2-嗎啉代乙磺酸一水化物)緩沖液(pH5.5-6.5)、MOPS(3-嗎啉代丙磺酸)緩沖液(pH6.5-8.0)、TAPS(N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)緩沖液(pH8.0-9.0)、CHES(N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸)緩沖液(pH9.0-10.0)、CAPS(N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸)緩沖液(pH10.0-11.0)和甘氨酸-氯化鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH11.0-13.0)。結(jié)果顯示在圖3。在pH6.5至pH9.5范圍內(nèi)，在最適pH的pH8.0下該酶的相應(yīng)活性保持大約90％或更多。因此，顯然本發(fā)明的酶在以中性pH為中心的相當(dāng)寬的范圍內(nèi)作用。然而，在不高于pH5.0的酸性pH范圍內(nèi)和不低于pH11.0的堿性pH范圍內(nèi)該酶不充分作用，并且在pH13.0該蛋白酶失活。實(shí)施例5(按照本發(fā)明的酶的pH穩(wěn)定性)將按照本發(fā)明的酶在30℃在每個(gè)上述緩沖液中維持1小時(shí)，并且然后檢查剩余的蛋白酶活性。結(jié)果顯示在圖4。發(fā)現(xiàn)按照本發(fā)明的酶在30℃在pH6.5至pH10.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定1小時(shí)，但在同樣條件下，在pH4.0和pH11.0失活。實(shí)施例6(溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響)用按照本發(fā)明的酶在不同的溫度下，在67mM磷酸緩中液(pH7)和100mM甘氨酸-氯化鈉(pH10)中分解偶氮酪蛋白。反應(yīng)溫度從5℃至70℃變化。此外，對(duì)于一種市售酶Savinase(NovonordiscCo.,Ltd.)，測(cè)定在pH7下溫度的影響。結(jié)果顯示在圖5。按照本發(fā)明的酶的最適溫度在pH10和pH7下為40℃。在30℃的溫度，本發(fā)明的酶在pH10可保持大約80％的活性，在pH7可保持大約90％的活性。在50℃的溫度，本發(fā)明的酶在pH10可保持大約10％的活性，在pH7可保持大約80％的活性。市售Savinase的最適溫度是60℃，該溫度大大高于按照本發(fā)明的酶的最適溫度。實(shí)施例7(按照本發(fā)明的酶的溫度穩(wěn)定性)將按照本發(fā)明的酶在10℃至60℃維持1小時(shí)。其活性隨時(shí)間的變化顯示在圖6。在10℃、20℃和30℃1小時(shí)，按照本發(fā)明的酶幾乎不失活。然而，在40℃它失活至大約60％的蛋白酶活性，并且以后，它逐漸失活。在50℃和60℃，該酶快速失活，并且在10分鐘內(nèi)完全失活。實(shí)施例8(抑制劑對(duì)按照本發(fā)明的酶的影響)用作用于天冬氨酸蛋白酶的胃蛋白酶抑制劑、作用于半胱氨酸蛋白酶的L-反式-環(huán)氧琥珀酰亮氨酸酰氨基-4-胍基丁烷(E-64)和碘乙酰氨、作用于絲氨酸蛋白酶的苯甲磺酰氯(PMSF)、作用于金屬蛋白酶和金屬依賴的蛋白酶的1,10-菲咯啉和乙二胺四乙酸(EDTA)作為抑制劑。將這些抑制劑加入酶促反應(yīng)系統(tǒng)以便形成各種終濃度，然后將該反應(yīng)系統(tǒng)維持在30℃0.5至1小時(shí)以檢查剩余的蛋白酶活性。結(jié)果顯示在表2。胃蛋白酶抑制劑、L-反式-環(huán)氧琥珀酰亮氨酸酰氨基-4-胍基丁烷(E-64)、碘乙酰氨和1,10-菲咯啉不能抑制按照本發(fā)明的酶的蛋白酶活性，但苯甲磺酰氯(PMSF)和乙二胺四乙酸(EDTA)明顯抑制按照本發(fā)明的酶的蛋白酶活性。從這些結(jié)果，暗示按照本發(fā)明的酶是活性中心為絲氨酸的絲氨酸蛋白酶。實(shí)施例9(蛋白酶的底物專一性)用苯酚試劑法測(cè)定該蛋白酶對(duì)作為底物蛋白的酪蛋白、血紅蛋白、白蛋白和明膠的蛋白酶解活性。結(jié)果顯示在表3。表3(底物專一性)<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="417">底物特殊的酶活性酪蛋白明膠血紅蛋白白蛋白100513013</table></tables>按照本發(fā)明的酶在低溫下特異性地作用于酪蛋白，并且該酶的底物專一性以明膠、血紅蛋白和白蛋白的次序減低。實(shí)施例10(N末端氨基酸序列的測(cè)定)在按照本發(fā)明的酶中，測(cè)定了其N末端氨基酸序列的30個(gè)殘基。結(jié)果顯示在SEQIDNO:1.測(cè)定了在按照本發(fā)明的酶的N末端氨基酸序列，并且利用數(shù)據(jù)庫“Entrez”檢查了其與已知氨基酸序列的同源性。結(jié)果，顯然沒有同源性。因此，由于按照本發(fā)明的酶與已知蛋白的任何氨基酸序列沒有同源性，已證實(shí)按照本發(fā)明的酶在N末端具有新的氨基酸序列。序列表序列號(hào)1序列長度30序列類型氨基酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽片段類型N末端來源有機(jī)體大比目魚黃桿菌菌株P(guān)104株序列描述AspThrArgGlnLeuLeuAsnAlaAsnSerAspLeuLeuAsnThrThr151015GlyAsnValThrGlyLeuThrGlyAlaPheAsnGlyGluAsn202530權(quán)利要求1．在20℃具有其最大活性的大約50％活性或更多的蛋白酶。2．具有以下物理化學(xué)性質(zhì)的蛋白酶(a)比活和底物專一性所述蛋白酶作用于酪蛋白、明膠、血紅蛋白和白蛋白以特異地分解它們，并且所述底物專一性以酪蛋白、明膠、血紅蛋白和白蛋白的次序降低；(b)最適pH:8.0；以及(c)pH穩(wěn)定性所述蛋白酶在pH6.5至pH10.0的范圍內(nèi)在30℃穩(wěn)定1小時(shí)。3．按照權(quán)利要求2的蛋白酶，它還具有以下物理化學(xué)性質(zhì)(d)最適溫度大約40℃；(e)溫度穩(wěn)定性在pH7為1小時(shí)，在低于30℃的溫度，該酶幾乎不失活，但在40℃它失活大約40％，并且在50℃在大約10分鐘內(nèi)完全失活；以及(f)酶活性在20℃所述蛋白酶具有其最大活性的大約50％或更多。4．按照權(quán)利要求2或3的蛋白酶，其中所述酶的活性中心是絲氨酸。5．按照權(quán)利要求2或3的蛋白酶，以SDS-PAGE測(cè)定，其分子量大約為70kDa。6．按照權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的蛋白酶，它由含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白組成。7．按照權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的蛋白酶，它由在N末端含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白組成。8．由含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白組成的蛋白酶。9．由在N末端含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白組成的蛋白酶。10．制備在權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)中描述的蛋白酶的方法，包括培養(yǎng)大比目魚黃桿菌P104(FERMBP5006)以產(chǎn)生在權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)中描述的蛋白酶、然后從其培養(yǎng)基中收集權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)中描述的蛋白酶的步驟。11．由部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列組成的肽。12．由部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列組成的蛋白。13．在其N末端包含部分或全部SEQIDNO:1中描述的氨基酸序列的蛋白。全文摘要這里公開了一種嗜冷蛋白酶,它具有以下物理化學(xué)物質(zhì):(a)比活和底物專一性:該蛋白酶作用于酪蛋白、明膠、血紅蛋白和白蛋白,以酪蛋白、明膠、血紅蛋白和白蛋白的順序特異地分解它們;(b)最適pH:8.0;(c)pH穩(wěn)定性:該蛋白酶在pH6.5至pH10.0的范圍內(nèi)在30℃穩(wěn)定1小時(shí);(d)最適溫度:大約40℃;(e)溫度穩(wěn)定性:在pH7為1小時(shí),在低于30℃的溫度,該酶幾乎不失活,但在40℃它失活大約40%,并且在50℃在大約10分鐘內(nèi)完全失活;(f)酶活性:在20℃該蛋白酶具有其最大活性的大約50%或更多;(g)該酶的活性中心是絲氨酸;以及(h)以SDS－PAGE測(cè)定,其分子量大約為70kDa。文檔編號(hào)C07K14/41GK1214084SQ97193195公開日1999年4月14日申請(qǐng)日期1997年1月24日優(yōu)先權(quán)日1996年1月26日發(fā)明者A·K·M·Q·哈桑,E·坦米雅申請(qǐng)人:普羅格特-甘布爾公司,日本科學(xué)技術(shù)高等學(xué)院