一種土壤漆酶活性的熒光測定方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于±壤化學分析技術(shù)領域，具體設及一種±壤漆酶活性的巧光測定方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] ±壤酶是有機物質(zhì)降解和養(yǎng)分循環(huán)的主要生物機制，酶活性可指示微生物活性， 衰變率W及微生物或植物吸收物質(zhì)的可利用性。通過測定±壤酶活性，可W更好地了解微 生物群落功能，資源可利用性和生態(tài)系統(tǒng)進程之間的關系，W及生態(tài)系統(tǒng)應對自然和人為 干擾的功能機制E1'23。
[0003] 漆酶廣泛分布于植物W，昆蟲W，真菌及一些細菌中W，據(jù)文獻報道:漆酶能 夠W氧分子作為最終電子受體W，催化氧化各種有機污染物，例如多環(huán)芳香控、多氯聯(lián)苯、 合成染料、殺蟲劑、W及鐵-氯化物復合物W等。因此，漆酶在各種生理功能中具有重要意 義，如碳循環(huán)、形態(tài)建成、防御和寄生等。在±壤和落葉等復雜環(huán)境中，測定漆酶活性最 常用的方法是比色法，常用底物有下香醒連氮（3,5-二甲氧基-4-徑基苯甲醒連氮），ABTS (2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并嚷挫-6-橫酸)二錠鹽)等W。最初，下香醒連氮被用作漆酶最常 用底物[8'9'12^，但下香醒連氮形成的的釀類產(chǎn)物不溶于水，因此運種方法的使用受到了限 制[133?；痳net等人改造了下香醒連氮的結(jié)構(gòu)，使漆酶催化其產(chǎn)生新的水溶性產(chǎn)物，該方法 已被用于落葉提取物中漆酶活性的測定，但其報道的所有下香醒連氮衍生物的釀類產(chǎn)物吸 光度不穩(wěn)定，因此運種方法也具有一定局限性。目前，一般采用ABTS法測定±壤及相關 樣品中漆酶活性，其原理是:ABTS在漆酶存在的條件下能夠產(chǎn)生有顏色的陽離子自由基 ABTS' +。但是在±壤、落葉等復雜介質(zhì)中，許多分子能夠消除ABTS' +自由基發(fā)生稱色反應，造 成測定的漆酶活性低于其實際值。
[0004] 需要指出的是，傳統(tǒng)方法需要將漆酶從±壤中提取出來進行顯色反應并實現(xiàn)漆酶 活性測定UW;但是，酶提取過程復雜、耗時；只能提取出很少部分漆酶;并且其提取效率隨 ±壤變化而不同W3。此外，采用不同的萃取試劑，相同的±壤萃取效率也會有所不同。因 此，現(xiàn)有的漆酶測定方法所獲得的測定結(jié)果不能反應±壤中漆酶活性的真實結(jié)果，嚴重阻 礙了漆酶在±壤中功能和作用的相關研究。因此，發(fā)展直接測定±壤中漆酶活性的新方法 對于±壤科學及相關科學研究、促進環(huán)境保護和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有十分重要的意義。
[0005] 巧光檢測由于其具有靈敏度高、線性動態(tài)范圍寬、反應快、精確度高、選擇性強等 優(yōu)點在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及科學研究中得到廣泛應用。Amplex RedQO-乙酷基-3,7-二徑基苯嗯 嗦，AR)是試面靈的一種衍生物，無色且無巧光性。研究表明：AR能夠通過辣根過氧化物酶- 過氧化氨體系被氧化為具強巧光性的試面靈，該反應體系由此被開發(fā)用于各種檢測試劑 盒W-W。但是，AR用于漆酶活性測定及其應用的研究尚未見有相關報導。通過研究，我們首 次發(fā)現(xiàn)漆酶能夠在溶解氧條件下催化氧化無巧光性的AR形成具強巧光性、有色的試面靈。 基于運一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提出一種新型巧光方法用于測定±壤中漆酶活性，其優(yōu)點包括:靈敏 度及選擇性高、線性范圍寬、無需復雜提取程序并可W直接用于±壤中漆酶活性測定、操作 簡單快速、運行價格低等。因此，本發(fā)明在環(huán)境污染修復、上壤及相關科學等研究領域有重 要實際應用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種簡單、靈敏的檢測± 壤漆酶活性的巧光測定方法，該方法克服了傳統(tǒng)方法用于測定±壤漆酶活性偏低、操作復 雜、耗時長等缺點。本發(fā)明還闡明漆酶催化AR巧光反應機制，最后，本發(fā)明將所建立的巧光 測定方法成功應用于±壤樣品漆酶活性的檢測，顯示了其潛在的實際應用價值。
[0007] 具體地，本發(fā)明提供了一種測定±壤漆酶活性的巧光新方法，該方法是WAmplex Red( 10-乙酷基-3，7-二徑基苯嗯嗦，簡稱AR)為漆酶底物，直接測定±壤漆酶活性。
[000引本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)
[0009] -種±壤漆酶活性的巧光測定方法，包括下列步驟：
[0010] W 2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并嚷挫-6-橫酸)二錠鹽(簡稱ABTS，下同）為漆酶底物， W分光光度法，制作漆酶催化氧化Amplex Red( 10-乙酷基-3，7-二徑基苯嗯嗦，簡稱AR)的 工作曲線，對±壤漆酶活性進行檢測，所述的方法步驟如下：
[001。 （ 1)配審ijpH4.4的化抽P04-巧樣酸緩沖溶液，5. Ommol/L的2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯 并嚷挫-6-橫酸)二錠鹽，即ABTS溶液，在避光條件下放置，另外配制10.0 mg/mL的漆酶溶液； [001 ^ (2似步驟（1)的化2冊04-巧樣酸緩沖液為緩沖體系，終濃度為0.5mmol/L ABTS， 5. Oyg/mL漆酶為反應體系，測定4min反應時間內(nèi)OD420的變化，每間隔Imin測定一次，共讀數(shù) 5次;根據(jù)4min內(nèi)OD420的變化值，得出漆酶酶活，酶活定義W每min催化?μL?ο?底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn) 物的酶量為標準；
[001引 （3)配制抑6.4的化抽P04-Na此Ρ04緩沖液，將5. Omg的10-乙酷基-3，7-二徑基苯嗯 嗦(AR)W1944化二甲基亞諷(DMS0)溶解得lO.Ommol/L AR，分裝后于-20°C保存?zhèn)溆茫褂?時用超純水和DMS0稀釋至10-500皿01/L，并使DMS0在AR溶液中體積分數(shù)為5 % ;
[0014] (4) W步驟（3)中pH6.4的Na2冊〇4-Na出P〇4緩沖液為緩沖體系，W終濃度分別為 1.0-50.0 皿ol/L 的 AR，0.5 %DMS0，5.62-702U/L漆酶為反應體系，分別制作出 1.0-50ymol/L 底物濃度下漆酶催化氧化AR的工作曲線，W3倍性噪比測出每個AR濃度下的最低檢測限，并 W最低檢測限初始達到最低時的AR濃度下的工作曲線作為最終工作曲線；
[001引 （5似步驟（3)中抑6.4的化抽P04-Na此P04緩沖液為緩沖體系，終濃度5.0mg/mL± 壤溶液，8.0ymol/L AR為反應體系，檢測由±壤漆酶催化AR形成試面靈產(chǎn)生的巧光信號值 F，并代入工作曲線方程F = 0.1434化0.0151 (式中的F代表±壤漆酶催化AR形成試面靈產(chǎn)生 的巧光信號值;U代表漆酶的酶活，單位是U/L)，得出相應的漆酶活性U。
[0016] 更詳細的的技術(shù)方案見《【具體實施方式】》。
【附圖說明】
[0017] 圖1:漆酶催化氧化AR前后巧光光譜變化圖。
[0018] 圖2:漆酶催化氧化AR所得產(chǎn)物液質(zhì)圖譜。
[0019]圖3:巧滅劑對漆酶-AR體系影響結(jié)果圖。
[0020]圖4:漆酶對AR溶液的電子順磁共振信號影響結(jié)果圖。
[0021] 圖5:漆酶催化氧化AR機理圖。
[0022] 圖6:不同AR濃度下的最低檢測限折線圖。
[0023] 圖7:最適AR濃度下漆酶工作曲線圖。
[0024] 圖8:干擾離子對漆酶活性測定影響柱狀圖。
[0025] 圖9:43對±壤酶選擇性柱狀圖。
[0026] 圖10:±壤對試面靈巧光巧滅作用柱狀圖。
[0027] 圖11 :±壤濃度對漆酶活性測定影響折線圖。
[0028] 圖12: ±壤濃度與巧光強度線性關系圖。
[0029] 圖13:上壤抑-漆酶活性相關性結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1漆酶催化氧化AR形成試面靈的反應(基礎實施例）
[0031 ] 具體步驟如下：
[0032] (1)對漆酶催化氧化AR的產(chǎn)物進行液質(zhì)分析，結(jié)果表明所得產(chǎn)物為試面靈。
[0033] (2)在有漆酶存在和無漆酶存在條件下，分別對AR溶液進行電子順磁共振測定。實 驗組W抑6.4Tris-HCl為緩沖體系，0.1 mmol/L AR，0.1 mg/mL超氧化物岐化酶，0.1mol/L正 下醇，0.16mol/L 2，3-二甲基化晚-N-氧化物(DMP0)，1. Omg/血漆酶為反應體系，對照組不 加漆酶，檢測自由基信號，結(jié)果對照組檢測到自由基，實驗組未檢測到自由基信號，表明反 應過程中有中間產(chǎn)物自由基的形成，漆酶使自由基信號消失。
[0034] (3)向漆酶-AR反應體系中加入超氧化物岐化酶(SOD)抑制氧生成化分別加入正 下醇和異下醇抑制H0'的產(chǎn)生;再分別對反應體系進行除氧和加氧處理，對照組不作處理。 結(jié)果表明，與對照組相比，只有除氧處理時，巧光信號明顯下降；加氧處理時，巧光信號明顯 升高，而加入S0D，正下醇，異下醇則對巧光信號無明顯影響，W上結(jié)果表明，氧W分子氧的 形式直接參與反應。
[0035] 實施例2制備實施例
[0036] 本實施例采用分光光度法，WABTS為底物對漆酶酶活進行測定，制作出漆酶催化 氧化AR的工作曲線，并測定各種干擾離子對漆酶-AR反應體系的干擾作用。
[0037] 具體步驟如下：
[003引 （1)配制抑4.4的化抽P04-巧樣酸緩沖溶液，5. Ommol/L的2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯 并嚷挫-6-橫酸)二錠鹽即ABTS溶液，于避光條件下放置，另外配制10.0 mg/mL的漆酶溶液；
[0039] (2似步驟（1)中化抽P0廣巧樣酸緩沖液為緩沖體系，終濃度為0.5mmol/L ABTS溶 液，5 . Oyg/mL漆酶溶液為反應體系，測定4min反應時間內(nèi)OD420的變化，每間隔Imin測定一 次，共讀數(shù)5次。根據(jù)4min內(nèi)OD420的變化率，得出漆酶酶活，酶活定義為每min催化?μL?ο