一種螢火蟲熒光素酶活性的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種螢火蟲熒光素酶活性的測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]熒光素酶(Luciferase)是自然界中能夠產(chǎn)生生物螢光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是一種學(xué)名為Photinuspyrali的螢火蟲體內(nèi)的熒光素酶。在相應(yīng)化學(xué)反應(yīng)中，熒光的產(chǎn)生是來(lái)自于熒光素的氧化，有些情況下反應(yīng)體系中也包括三磷酸腺苷(ATP)。
[0003]熒光素酶發(fā)出的光的顏色主要取決于熒光素周圍的氨基酸。在正常情況下它發(fā)出黃綠光。但如果將其中的絲氨酸變?yōu)樘於彼?蛋白質(zhì)編號(hào)2dlt)，則它會(huì)發(fā)出紅光。
[0004]熒光生成反應(yīng)通常分為以下兩步:
1:熒光素 +ATP —熒光素化腺苷酸(Iuciferyladenylate) +PPi
2:熒光素化腺苷酸+02 —氧熒光素+AMP+光這一反應(yīng)非常節(jié)省能量，幾乎所有輸入反應(yīng)的能量都被轉(zhuǎn)化為光。與之形成鮮明對(duì)比的是人類使用的白熾燈，只有約10%的能量被轉(zhuǎn)化為光，剩余的能量都變?yōu)闊崮芏焕速M(fèi)。
[0005]在熒光素酶中加入正確的螢光素底物就可以放出螢光，而發(fā)出的光子可以被光敏感元件，如螢光探測(cè)器或改進(jìn)后的光學(xué)顯微鏡探測(cè)到。這就使得對(duì)包括感染在內(nèi)的多種生命活動(dòng)進(jìn)程進(jìn)行觀察成為可能。例如，螢光素酶可以被用于檢測(cè)血庫(kù)中所存血液中的紅血球是否開始破裂。法醫(yī)可以用含有螢光素酶的溶液來(lái)檢測(cè)犯罪現(xiàn)場(chǎng)中殘留的血跡。醫(yī)院用螢光素酶的發(fā)光來(lái)發(fā)現(xiàn)特定的疾病。螢光素酶還可以作為“報(bào)告蛋白”被用于分子生物學(xué)研宄中，例如，用于在轉(zhuǎn)染過(guò)螢光素酶的細(xì)胞中檢測(cè)特定啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄情況或用于探測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ATP的水平；這一技術(shù)被稱為報(bào)告基因檢測(cè)法或螢光素酶檢測(cè)法。螢光素酶是一個(gè)熱敏感蛋白，因此經(jīng)常被用于研宄蛋白熱變性過(guò)程中熱休克蛋白的保護(hù)能力。
[0006]基因組測(cè)序是當(dāng)代生命科學(xué)技術(shù)的前沿核心技術(shù)之一，其中的焦磷酸測(cè)序法采用了熒光素酶進(jìn)行檢測(cè)，讀長(zhǎng)大，精確度高?，F(xiàn)有技術(shù)在檢測(cè)熒光素酶的過(guò)程中，光信號(hào)強(qiáng)度較差，持續(xù)時(shí)間短，不利于熒光素酶的高通量篩選和使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的一個(gè)目的是一種螢火蟲熒光素酶活性的測(cè)定方法，所述測(cè)定方法包括:
(1)配制含有ATP、Mn2+、Ca2+、熒光素、氨基乙酰雙甘氨肽和磷酸鹽的混合液；
(2)調(diào)節(jié)pH值;
(3)預(yù)冷混合液至4°C;
(4)在混合液中孵育生物素化熒光素酶；
(5)加入ATP，放入檢測(cè)儀中，測(cè)定熒光信號(hào)的強(qiáng)度。
[0008]所述混合液中還含有Tris-HCl緩沖液。
[0009]所述混合液中還含有溫和還原劑，所述溫和還原劑為TCEP (三(2-羧乙基)膦)、DTT、(NH4) 2S、NH4HS, Na2S, NaHS 和 NaHSO3* 的一種或幾種，優(yōu)選為 TCEP、DTT 和 NaHS，體積比為3:1:2。
[0010]所述溫和還原劑在60mM以下。
[0011]所述生物素化熒光素酶結(jié)合于磁珠上，磁珠為M280鏈霉素抗生物素蛋白磁珠。
[0012]所述Mg2+是由MgCl 2提供的，所述Ca2+是由CaCl 2提供的。
[0013]所述磷酸鹽離子是由H2PO4'HPO42-和PO廣中的一種或幾種提供的，優(yōu)選為HPO廣。
[0014]所述混合液的pH值為7.0-8.0。
[0015]所述混合液中ATP為0.4-0.8 μ M。
[0016]所述孵育為4s_6s。
[0017]所述檢測(cè)儀為微量發(fā)光檢測(cè)儀BPLC。
[0018]檢測(cè)時(shí)加入不同濃度的結(jié)合有熒光素酶的磁珠，分梯度檢測(cè)酶活。
[0019]所述檢測(cè)酶活時(shí)，每120 μ I Tris-HCl中，加入結(jié)合有熒光素酶的磁珠0.35-0.46 μ I ο
[0020]本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的混合液。
[0021]本發(fā)明中的測(cè)定方法在檢測(cè)熒光素酶的過(guò)程中，光信號(hào)強(qiáng)度大，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，有利于熒光素酶的高通量篩選和使用。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短，通量大的特點(diǎn)，可大批量篩選熒光素酶，應(yīng)用于高強(qiáng)度的焦磷酸測(cè)序反應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1
(O配制混合液，含有120 μ I Tris-HCl、3mM MnCl2,2 mM CaCl2、ImM螢火蟲熒光素、15mM氨基乙酰雙甘氨肽、1.2mM磷酸鹽、6mM TCEP、2mM DTT和4mM NaHS ；
(2)調(diào)節(jié)pH值至7.5；
(3)預(yù)冷混合液至4°C;
(4)取0.35 μ I結(jié)合有熒光素酶的磁珠加入混合液中，磁珠為Μ280鏈霉素抗生物素蛋白磁珠，于4°C振蕩孵育；
(5)加入0.4μΜ ΑΤΡ，振蕩2s，迅速置于微量發(fā)光檢測(cè)儀BPLC中，測(cè)定熒光信號(hào)的強(qiáng)度。
[0023]實(shí)施例2
(O配制混合液，含有 120 μ I Tris-HCl、3mM MgCl2,2 mM CaCl2、10ng 螢火蟲熒光素、IlmM 氨基乙酰雙甘氨肽、1.5mM NaHPO42,3mM TCEP ；
(2)調(diào)節(jié)pH值至7.0；
(3)預(yù)冷混合液至4°C;
(4)取0.4 μ I結(jié)合有熒光素酶的磁珠加入混合液中，磁珠為Μ280鏈霉素抗生物素蛋白磁珠，振蕩5s ；
(5)加入0.8 μΜ ΑΤΡ，振蕩4s，迅速置于微量發(fā)光檢測(cè)儀BPLC中，測(cè)定熒光信號(hào)的強(qiáng)度，再以同樣方法分別對(duì)結(jié)合有熒光素酶的磁珠40nl和4nl進(jìn)行測(cè)定。
[0024]實(shí)施例3
(O配制混合液，含有120 μ I Tris-HClUmM MgCl2,3 mM CaCl2、90ng螢火蟲熒光素、12mM 氨基乙酰雙甘氨肽、0.5mM KH2PO4UmM Na2HPO4UmM Na3P04、4mM (NH4)2SUmM NaHSO3;
(2)調(diào)節(jié)pH值至8.0 ；
(3)預(yù)冷混合液至4°C;
(4)取0.45 μ I結(jié)合有熒光素酶的磁珠加入混合液中，磁珠為Μ280鏈霉素抗生物素蛋白磁珠，于4°C振蕩孵育5s;
(5)加入0.7 μΜ ΑΤΡ，振蕩5s，迅速置于微量發(fā)光檢測(cè)儀BPLC中，測(cè)定熒光信號(hào)的強(qiáng)度。
[0025]實(shí)施例4
(O 配制混合液，含有 120μ1 Tris-HCl、3mM MgCl2,2mM CaCl2、80ng 螢火蟲熒光素、18mM 氨基乙酰雙甘氨肽、2mM NaH2PO4UmM K2HPO4,5mM NH4HS ；
(2)調(diào)節(jié)pH值至7.6；
(3)預(yù)冷混合液至4°C;
(4)取0.46 μ I結(jié)合有熒光素酶的磁珠加入混合液中，磁珠為Μ280鏈霉素抗生物素蛋白磁珠，4°C孵育6s ；
(5)加入0.6μΜ ΑΤΡ，振蕩5s，迅速置于微量發(fā)光檢測(cè)儀BPLC中，測(cè)定熒光信號(hào)的強(qiáng)度。
[0026]實(shí)施例5
(O配制混合液，含有 120 μ I Tris-HCl、4mM MgCl2、0.5mM CaCl2、80ng 螢火蟲熒光素、18mM 氨基乙酰雙甘氨肽、2mM NaH2PO4UmM K2HPO4,3mM NH4HS 和 2mM Na2S ；
(2)調(diào)節(jié)pH值至7.8；
(3)預(yù)冷混合液至4°C;
(4)取0.4 μ I結(jié)合有熒光素酶的磁珠加入混合液中，磁珠為Μ280鏈霉素抗生物素蛋白磁珠，4°C孵育4s ；
(5)加入0.55 μM ΑΤΡ，振蕩5s，迅速置于微量發(fā)光檢測(cè)儀BPLC中，測(cè)定熒光信號(hào)的強(qiáng)度，再以同樣方法分別對(duì)結(jié)合有熒光素酶的磁珠40nl和4nl進(jìn)行測(cè)定。
[0027]上述詳細(xì)說(shuō)明是針對(duì)本發(fā)明其中之一可行實(shí)施例的具體說(shuō)明，該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種螢火蟲熒光素酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟: 配制含有ATP、Mn2+、Ca2+、熒光素、氨基乙酰雙甘氨肽和磷酸鹽的混合液； 調(diào)節(jié)pH值； 預(yù)冷混合液至4°C ； 在混合液中孵育生物素化熒光素酶； 加入ATP，放入檢測(cè)儀中，測(cè)定熒光信號(hào)的強(qiáng)度。2.如權(quán)利要求1所述的螢火蟲熒光素酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，所述混合液中還含有Tris-HCl緩沖液。3.如權(quán)利要求1所述的螢火蟲熒光素酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，所述混合液中還含有溫和還原劑，所述溫和還原劑為TCEP、DTT、(NH4) 2S、NH4HS、Na2S、NaHS和NaHSO3中的一種或幾種，優(yōu)選為TCEP、DTT和NaHS，體積比為3:1:2。4.如權(quán)利要求1所述的螢火蟲熒光素酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，所述溫和還原劑在60mM以下。5.如權(quán)利要求1所述的螢火蟲熒光素酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，所述生物素化熒光素酶結(jié)合于磁珠上，磁珠為M280鏈霉素抗生物素蛋白磁珠。6.如權(quán)利要求1所述的螢火蟲熒光素酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，所述Mg2+是由MgCl2提供的，所述Ca2+是由CaCl 2提供的。7.如權(quán)利要求1所述的螢火蟲熒光素酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，所述磷酸鹽離子是由H2P04-、HPO42-和PO廣中的一種或幾種提供的，優(yōu)選為HPO 42_。8.如權(quán)利要求1所述的螢火蟲熒光素酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，所述混合液的pH 值為 7.0-8.0o9.一種用于檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的混合液。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種螢火蟲熒光素酶活性的測(cè)定方法。包括以下步驟：配制含有ATP、Mn2+、Ca2+、熒光素、氨基乙酰雙甘氨肽和磷酸鹽的混合液；調(diào)節(jié)pH值；預(yù)冷混合液至4℃；在混合液中孵育生物素化熒光素酶；加入ATP，放入檢測(cè)儀中，測(cè)定熒光信號(hào)的強(qiáng)度。本發(fā)明中的測(cè)定方法有利于熒光素酶的高通量篩選和使用。
【IPC分類】C12Q1/66
【公開號(hào)】CN104946728
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510424963
【發(fā)明人】高靜, 蔡亦梅, 吳超, 徐瀟, 張睿, 王者馥, 王緒敏, 殷金龍, 任魯風(fēng)
【申請(qǐng)人】北京中科紫鑫科技有限責(zé)任公司
【公開日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年7月20日