具有過(guò)氧化酶活性的多肽及編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有過(guò)氧化酶活性的分離的多肽以及編碼該多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)和使用該多肽的方法。
【專利說(shuō)明】具有過(guò)氧化酶活性的多肽及編碼該多肽的多核苷酸
[0001]對(duì)序列表的引用
[0002]本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，其通過(guò)引用的方式合并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及具有過(guò)氧化酶(peroxygenase )活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)和使用該多肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0004]W02008/119780公開(kāi)了八種不同的來(lái)自茶樹(shù)燕(Agrocybe aegerita)、灰蓋鬼傘(Coprinopsis cinerea)、雙色臘蘑(Laccaria bicolor)和福毛鬼傘(Coprinus radians)的過(guò)氧化酶。
[0005]Ullrich 等人，Appl.Env.Microbiol (2004) 70 (8): 4575-4581 公開(kāi)了傘菌擔(dān)子菌菌株茶樹(shù)菇(菌株TM-Al)的過(guò)氧化酶，該酶被發(fā)現(xiàn)對(duì)芳基醇類和醛類進(jìn)行氧化。
[0006]W02006/034702公開(kāi)了非活性烴類例如萘、甲苯和環(huán)己烷的使用茶樹(shù)菇TM Al的AaP過(guò)氧化酶的酶促輕化作用的方法。這也記載在Ullrich and Hofrichter, FEBSLetters (2005)579:6247-6250。
[0007]DE10332065A1公開(kāi)了通過(guò)使用茶樹(shù)菇TM Al的AaP過(guò)氧化酶經(jīng)由醛類的中間形成而從醇類酶促制備酸的方法。
[0008]已報(bào)道一種方法，快速而有選擇性的分光光度直接檢測(cè)經(jīng)AaP過(guò)氧化酶的芳環(huán)羥化(Kluge 等人,Appl. Microbiol.Biotechnol.(2007) 75:1473-1478)。
[0009]眾所周知，向有機(jī)分子直接區(qū)域選擇性地引入氧官能團(tuán)(氧合作用)構(gòu)成化學(xué)合成中的問(wèn)題。產(chǎn)物可以在多種不同的合成中用作重要的中間體。
[0010]W02011/120938公開(kāi)了使用各種過(guò)氧化酶在取代的或未取代的、直鏈的或支鏈的脂肪烴的2或3位進(jìn)行酶促羥化作用的方法。
[0011]本發(fā)明提供具有過(guò)氧化酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明涉及具有過(guò)氧化酶活性的分離的多肽，其選自:
[0013](a)與SEQ ID NO: 2的成熟多肽具有至少60%序列同一性的多肽；
[0014](b)由在中等嚴(yán)格條件下與(i) SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii) (i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物進(jìn)行雜交的多核苷酸所編碼的多肽；
[0015](C)由與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60%序列同一性的多核苷酸所編碼的多肽；
[0016](d)在一個(gè)或多個(gè)(如，數(shù)個(gè))位置包含替換、缺失和/或插入的SEQ ID N0:2的成熟多肽的變體；以及[0017](e) (a)、(b)、(C)或(d)多肽的具有過(guò)氧化酶活性的片段。
[0018]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體、重組宿主細(xì)胞，以及制備該多肽的方法。
[0019]本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明多肽的方法。
[0020]本發(fā)明還涉及編碼包含SEQ ID NO: 2的氨基酸-17至-1或由SEQID NO: 2的氨基酸-17至-1組成的信號(hào)肽的多核苷酸，該多核苷酸可操作地與編碼蛋白的基因連接；包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞；以及生產(chǎn)蛋白的方法。
【具體實(shí)施方式】
[0021]定義
[0022]過(guò)氧化酶:根據(jù)ECl.11.2.1，術(shù)語(yǔ)“過(guò)氧化酶”是指“非特異的過(guò)氧化酶”活性，催化來(lái)自H2O2的氧原子插入到多種底物如4-硝基苯并二氧雜環(huán)戍烯(4-nitrobenzodioxole)中。出于本發(fā)明的目的，過(guò)氧化酶的活性根據(jù)實(shí)施例3或M.Poraj-Kobielska, M.Kinne, R.Ullrich, K.Scheibner, M.Hofrichter, uK spectrophotometric assay for the detectionof fungal peroxygenases，，，Analytical Biochemistry (2012), vol.421, issuel, pp.327 - 329中記載的步驟來(lái)確定。
[0023]一方面，本發(fā)明的多肽 (過(guò)氧化酶)具有至少20%，如，至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的SEQ ID NO:2的成熟多肽的過(guò)氧化
酶活性。
[0024]等位基因變體(allelic variant):術(shù)語(yǔ)“等位基因變體”表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩種或更多種可變形式中的任意種。等位基因變化通過(guò)突變而自然發(fā)生，并可能引起種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在所編碼的多肽中沒(méi)有改變)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0025]cDNA:術(shù)語(yǔ)“cDNA”是指可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄從成熟的、剪接的真核或原核細(xì)胞的mRNA分子制備而來(lái)的DNA分子。cDNA缺少可以存在于對(duì)應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。最初的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄體是在呈現(xiàn)為成熟剪接的mRNA前的經(jīng)由一系列步驟包括剪接而加工的mRNA的前體。
[0026]編碼序列:術(shù)語(yǔ)“編碼序列”是指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由開(kāi)放閱讀框確定，開(kāi)放閱讀框以起始密碼子如ATG、GTG或TTG開(kāi)始并以終止密碼子如TAA、TAG或TGA結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0027]控制序列:術(shù)語(yǔ)“控制序列”是指編碼本發(fā)明成熟多肽的多核苷酸的表達(dá)所必需的核酸序列。各個(gè)控制序列對(duì)于編碼多肽的多核苷酸可以是內(nèi)生的(即，來(lái)自相同基因)或外來(lái)的(即，來(lái)自不同基因)或彼此為內(nèi)生或外來(lái)。這些控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。在最低限度，控制序列包括啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)?？刂菩盘?hào)可以設(shè)有用于導(dǎo)入特定的促進(jìn)控制序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)進(jìn)行連接的限制性酶切位點(diǎn)的接頭。
[0028]表達(dá):術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括在多肽生產(chǎn)中涉及的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。[0029]表達(dá)載體:術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指包含編碼多肽的多核苷酸并與提供用于其表達(dá)的控制序列可操作地連接的線性或環(huán)狀DNA分子。
[0030]片段:術(shù)語(yǔ)“片段”是指在成熟多肽或結(jié)構(gòu)域的氨基端和/或羧基端缺少一個(gè)或多個(gè)(如，數(shù)個(gè))氨基酸的多肽或催化域；其中片段具有過(guò)氧化酶活性。一方面，片段包含至少220個(gè)氨基酸殘基(如，SEQ ID NO: 2的氨基酸I至220)、至少230個(gè)氨基酸殘基(如，SEQ IDNO:2的氨基酸I至230)、或至少240個(gè)氨基酸殘基(如，SEQ ID NO:2的氨基酸I至240)。
[0031]高等嚴(yán)格條件:術(shù)語(yǔ)“高等嚴(yán)格條件”是指至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的探針于42°C在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚(yú)精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序進(jìn)行12至24小時(shí)。載體材料最后使用2XSSC、0.2%SDS在65V洗滌三次,每次15分鐘。
[0032]宿主細(xì)胞:術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指對(duì)使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等敏感的任何細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括由于復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而不與親本細(xì)胞相同的任何親本細(xì)胞后代。
[0033]分離的:術(shù)語(yǔ)“分離的”是指，處于非天然發(fā)生的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括:(I)任何非天然發(fā)生的物質(zhì)；(2)包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白、肽或輔助因子的任何物質(zhì)，其至少部分地從與其天然相關(guān)聯(lián)的一種或多種或所有天然發(fā)生成分中移出；(3)相對(duì)于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，經(jīng)人工修飾的任何物質(zhì)；或者(4)通過(guò)增加物質(zhì)相對(duì)于與其天然相關(guān)的其他組分的含量而修飾的任意物質(zhì)(例如，多個(gè)拷貝的物質(zhì)編碼基因；相比于與編碼物質(zhì)的基因天然相關(guān)的啟動(dòng)子，使用更強(qiáng)的啟動(dòng)子)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣本中。
[0034]低等嚴(yán)格條件:術(shù)語(yǔ)“低等嚴(yán)格條件”是指，長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針，在42°C下，在5 X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚(yú)精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡過(guò)程進(jìn)行12至24個(gè)小時(shí)。載體材料最終使用2 X SSC、0.2%SDS在50°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0035]成熟多肽:術(shù)語(yǔ)“成熟多肽”是指，在翻譯和任何翻譯后修飾(例如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等)之后處于其最終形式的多肽。一方面，成熟多肽是SEQ ID N0:2的氨基酸I至242，基于SignalP3.0程序，預(yù)測(cè)SEQ ID NO:2的氨基酸-17至-1是信號(hào)肽。領(lǐng)域內(nèi)已知，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同的成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。
[0036]成熟多肽編碼序列:術(shù)語(yǔ)“成熟多肽編碼序列”是指編碼具有過(guò)氧化酶活性的成熟多肽的多核苷酸。一方面，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸52至88、153至393,442至713、以及809至984或其cDNA序列，基于SignalP3.0程序，預(yù)測(cè)SEQ ID NO:1的核苷酸I至51編碼信號(hào)肽。
[0037]中等嚴(yán)格條件:術(shù)語(yǔ)“中等嚴(yán)格條件”是指，長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針，在42°C下，在5 X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚(yú)精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡過(guò)程進(jìn)行12至24個(gè)小時(shí)。載體材料最終使用2 X SSC、0.2%SDS在55 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0038]中到高等嚴(yán)格條件:術(shù)語(yǔ)“中到高等嚴(yán)格條件”是指，長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針，在42°C下，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚(yú)精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡過(guò)程進(jìn)行12至24個(gè)小時(shí)。載體材料最終使用2XSSC、0.2%SDS在60V下洗滌三次，每次15分鐘。
[0039]核酸構(gòu)建體:術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”是指單鏈或雙鏈核酸分子，其從天然存在的基因中分離出或以自然中不會(huì)出現(xiàn)或是合成的方式修飾成包含核酸片段，其包含一個(gè)或多個(gè)控制序列。
[0040]可操作地連接:術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指一種構(gòu)造，其中控制序列位于相對(duì)于多核苷酸的編碼序列為合適的位置，從而使控制序列引導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。
[0041]序列同一性:兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的關(guān)聯(lián)性通過(guò)參數(shù)“序列同一'I"生”來(lái)描述。
[0042]出于本發(fā)明的目的，使用在EMBOSS軟件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite (歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件包),Rice 等人,2000, TrendsGenet.16:276-277)(優(yōu)選 5.0.0 或更新版本)的 Needle 程序中執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman and Wunsch, 1970，J.Mol.Biol.48:443-453),來(lái)確定兩個(gè)氛基酸序列之間的序列同一性。所使用的參數(shù)是，空位開(kāi)放罰分為10，空位擴(kuò)展罰分為0.5，以及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)替換矩陣。Needle標(biāo)記的“最長(zhǎng)同一性”的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)得到的)被用作百分比同一性并計(jì)算如下:
[0043](相同殘基X100) / (比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))。
[0044]出于本發(fā)明的目的，使用在EMBOSS軟件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite (歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件包)，Rice等人，2000,同上)(優(yōu)選5.0.0或更新版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman andWunsch, 1970，同上)，來(lái)確定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性。所使用的參數(shù)是，空位開(kāi)放罰分為10，空位擴(kuò)展罰分為0.5，以及EDNAFULUNCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替換矩陣。Needle標(biāo)記 的“最長(zhǎng)同一性”的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)得到的)被用作百分比同一性并計(jì)算如下:
[0045](相同的脫氧核糖核苷酸X100) / (比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))。
[0046]子序列:術(shù)語(yǔ)“子序列”是指，在成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個(gè)或多個(gè)(例如，數(shù)個(gè))核苷酸的多核苷酸；其中子序列編碼具有過(guò)氧化酶活性的片段。一方面，子序列包含至少660個(gè)核苷酸、至少690個(gè)核苷酸、或至少720個(gè)核苷酸。
[0047]變體:術(shù)語(yǔ)“變體”是指，在一個(gè)或多個(gè)位置上包含改變(即替換、插入和/或缺失)的具有過(guò)氧化酶活性的多肽。替換是指用不同的氨基酸取代占據(jù)位置的氨基酸；缺失是指去除占據(jù)位置的氨基酸；而插入是指將氨基酸添加至緊鄰占據(jù)位置的氨基酸。
[0048]極高等嚴(yán)格條件:術(shù)語(yǔ)“極高等嚴(yán)格條件”是指，長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針，在42°C下，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚(yú)精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡過(guò)程進(jìn)行12至24個(gè)小時(shí)。載體材料最終使用2XSSC、0.2%SDS在70°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0049]極低等嚴(yán)格條件:術(shù)語(yǔ)“極低等嚴(yán)格條件”是指，長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針，在42°C下，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚(yú)精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡過(guò)程進(jìn)行12至24個(gè)小時(shí)。載體材料最終使用2XSSC、0.2%SDS在45 °C下洗滌三次，每次15分鐘。[0050]具有過(guò)氧化酶活性的多肽
[0051]在實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的分離的多肽，該多肽具有過(guò)氧化酶活性。一方面，該多肽與SEQ ID N0:2的成熟多肽的區(qū)別不多于10個(gè)氨基酸，例如 1、2、3、4、5、6、7、8、或 9 個(gè)。
[0052]本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因變體，或由SEQID NO:2的氨基酸序列或其等位基因變體構(gòu)成；或者是其具有過(guò)氧化酶活性的片段。另一方面，多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由SEQ ID N0:2的成熟多肽構(gòu)成。另一方面，多肽包含SEQ ID NO: 2的氨基酸I至242，或由SEQ ID NO: 2的氨基酸I至242構(gòu)成。
[0053]本發(fā)明的多肽可以包括如下所述的氨基酸序列:
[0054]Glu-His-Asp-Gly-Ser-Leu-Ser-Arg (SEQ ID NO:3),或
[0055]Glu-His-Asp-Ala-Ser-Leu-Ser-Arg (SEQ ID NO:4)
[0056]-其與血紅素基(hemegroup)相鄰的Mn原子配位結(jié)合。
[0057]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及由在極低等嚴(yán)格條件、低等嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件、中到高等嚴(yán)格條件、高等嚴(yán)格條件或極高等嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列、(ii )其cDNA序列、或(iii ) (i )或(ii )的全長(zhǎng)互補(bǔ)物進(jìn)行雜交的多核苷酸所編碼的具有過(guò)氧化酶活性的分離多肽(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning, ALaboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York)。
[0058]SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，以及SEQ ID NO: 2的多肽或其片段，可以用來(lái)設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng) 域熟知的方法從不同屬或種的菌株中識(shí)別和克隆編碼具有過(guò)氧化酶活性的多肽的DNA。具體而言，為識(shí)別并分離其中相應(yīng)的基因，這些探針可以遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序而用于與目標(biāo)細(xì)胞的基因組DNA或cDNA的雜交。這些探針可以大大短于整個(gè)序列，但應(yīng)當(dāng)為至少15個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，例如至少25個(gè)、至少35個(gè)或至少70個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，核酸探針為至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，如至少200個(gè)核苷酸、至少300個(gè)核苷酸、至少400個(gè)核苷酸、至少500個(gè)核苷酸、至少600個(gè)核苷酸、至少700個(gè)核苷酸、至少800個(gè)核苷酸或至少900個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。DNA和RNA探針均可以使用。探針通常被標(biāo)記(例如,用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)，以用于檢測(cè)相應(yīng)的基因。這些探針均包括在本發(fā)明中。
[0059]從其他菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)可以用于篩選與上述探針雜交并編碼具有過(guò)氧化酶活性的多肽的DNA。來(lái)自其他菌株的基因組或其他DNA可以通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳法或其他分離技術(shù)分開(kāi)。來(lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA可以轉(zhuǎn)移并固定到硝化纖維素或其他合適的載體材料上。為識(shí)別與SEQ ID NO:1或其子序列雜交的克隆或DNA，載體材料用在DNA印跡中。
[0060]出于本發(fā)明的目的，雜交是指多核苷酸在極低等至極高等嚴(yán)格條件下雜交到與(i)SEQ ID NO: 1、(ii) SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、(iii)其cDNA序列；(iv)其全長(zhǎng)互補(bǔ)物或(V)其子序列對(duì)應(yīng)的經(jīng)過(guò)標(biāo)記的核酸探針。核酸探針在這些條件下雜交的分子可以使用例如X光片或任何其他本領(lǐng)域已知的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0061]一方面，核酸探針是SEQ ID NO:1的核苷酸374至393。另一方面，核酸探針是編碼SEQ ID N0:2的多肽、其成熟多肽或其片段的多核苷酸。另一方面，核酸探針是SEQ IDNO:1或其cDNA序列。
[0062]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及由與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%
序列同一性的多核苷酸所編碼的具有過(guò)氧化酶活性的分離多肽。
[0063]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在一個(gè)或多個(gè)(如，數(shù)個(gè))位置包含替換、缺失和/或插入的SEQ ID N0:2成熟多肽的變體。在實(shí)施方式中，引入SEQ ID N0:2的成熟多肽的氨基酸替換、缺失和/或插入的數(shù)量不多于10個(gè)，如1、2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)。氨基酸改變可以是性質(zhì)微小的，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸替換或插入；小的缺失，通常為I~30個(gè)氨基酸；小的氨基端或羧基端延伸，例如氨基端甲硫氨酸殘基；小的最多20~25個(gè)殘基的接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或其他功能而促進(jìn)純化的小的延伸，如多組氨酸序列、抗原表位或結(jié)合域。 [0064]保守性替換的實(shí)例是在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內(nèi)。通常不改變特異活性的氨基酸替換為領(lǐng)域內(nèi)已知，并在例如H.Neurath and R.L.Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York 中記載。常見(jiàn)的替換為，Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。
[0065]或者，氨基酸改變是改變多肽的物化性質(zhì)的性質(zhì)。例如，氨基酸改變可以改善多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最佳PH等。
[0066]多肽中的必要氨基酸可以根據(jù)領(lǐng)域內(nèi)已知的步驟來(lái)鑒定，例如定點(diǎn)突變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham and Wells, 1989，Science244:1081-1085)。在后述的技術(shù)中，在分子的各個(gè)殘基中引入單個(gè)丙氨酸突變，并檢測(cè)所得突變分子的過(guò)氧化酶活性，從而識(shí)別對(duì)分子活性重要的氨基酸殘基。同時(shí)參見(jiàn)，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶或其他生物學(xué)相互作用的活性位點(diǎn)還可以通過(guò)結(jié)構(gòu)的物理分析來(lái)判定，如通過(guò)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記的技術(shù)，并結(jié)合假定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)進(jìn)行判定。參見(jiàn)例如 de Vos 等人，1992，Science255:306-312; Smith 等人，1992，J.Mol.Biol.224:899-904; Wlodaver 等人，1992, FEBS Lett.309:59-64。必要氨基酸的確定還可以從與相關(guān)多肽的比對(duì)中推斷。
[0067]可以使用已知的突變、重組和/或改組方法，接著通過(guò)相關(guān)篩選步驟，例如Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science241:53-57;Bowie and Sauer, 1989, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156 ；W095/17413 ;或 W095/22625 中所公開(kāi)的那些，來(lái)做出單個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、缺失和/或插入并對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。其他可用的方法包括易錯(cuò)PCR、嗤菌體展不(例如，Lowman 等人,1991, Biochemistry30:10832-10837 ;美國(guó)專利第5，223，409 號(hào)；W092/06204)以及定位誘變(Derbyshire 等人，1986，Gene46:145; Ner 等人，1988，DNA7:127)。
[0068]突變/改組方法可以與高通量、自動(dòng)化篩選方法結(jié)合，來(lái)檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的突變多肽的活性(Ness等人，1999, NatureBiotechnologyl7:893-896)。編碼活性多肽的突變DNA分子可以使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細(xì)胞中回收，并快速測(cè)序。這些方法使得可以快速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。
[0069]多肽可以是雜合多肽，其中一個(gè)多肽的區(qū)域融合在另一多肽的區(qū)域的N端或C端。
[0070]多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一個(gè)多肽融合在本發(fā)明多肽的N端或C端。融合多肽通過(guò)將編碼另一多肽的多核苷酸融合到本發(fā)明的多核苷酸而進(jìn)行制備。制備融合多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域已知，并包括連接編碼多肽的編碼序列，使得它們?cè)陂喿x框內(nèi)并且融合多肽的表達(dá)在同一啟動(dòng)子和終止子的控制下。融合多肽還可以使用內(nèi)含肽技術(shù)來(lái)構(gòu)建，其中融合多肽在翻譯后創(chuàng)建(Cooper等人，1993，EMBO J.12:2575-2583;Dawson等人，1994，Science266:776-779)。
[0071]融合多肽還可以包含兩個(gè)多肽之間的切割位點(diǎn)。在融合蛋白分泌時(shí)，該位點(diǎn)被切割，從而釋放兩個(gè)多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括但不局限于在Martin等人，2003，J.1nd.Microbiol.Biotechnol.3:568-576;Svetina 等人,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson 等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward 等人，1995, Biotechnologyl3:498-503;以及 Contreras 等人，1991, Biotechnology9:378-38I; Eaton 等人,1986, Biochemistry25:505-512; Collins-Racie 等人,1995, Biotechnology13:982-987; Carter 等人，1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics6:240-248;以及 Stevens, 2003，Drug Discovery World4:35_48 公開(kāi)的位點(diǎn)。
[0072]具有過(guò)氧化酶活性的多肽的來(lái)源
[0073]本發(fā)明的具有過(guò)氧化酶活性的多肽可以得自任何屬的微生物。出于本發(fā)明的目的，本文中結(jié)合給定來(lái)源使用的術(shù)語(yǔ)“得自”是指，由多核苷酸編碼的多肽通過(guò)該來(lái)源或已經(jīng)插入該來(lái)源的多核苷 酸的菌株進(jìn)行制備。一方面，得自給定來(lái)源的多肽在胞外分泌。
[0074]多肽可以是真菌多肽。例如，多肽可以是毛殼屬(Chaetomium)多肽，如綠毛殼(Chaetomium virescens)或球毛殼(Chaetomium globosum)多月太。
[0075]將要理解的是，對(duì)于前述種，本發(fā)明包括完全的和不完全的狀態(tài)，以及其他分類等同物，例如，無(wú)性型，不管它們已知的種名是什么。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地識(shí)別出合適等同物的身份。
[0076]這些種的菌株可以在多個(gè)保藏中心輕易地為公眾可得，如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)、荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)、和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(NRRL)。
[0077]多肽可以使用上述探針從其他來(lái)源識(shí)別并獲取，其他來(lái)源包括從自然界(如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物或直接從天然材料(如，土壤、堆肥、水等)獲得的DNA樣本。用于直接從自然生境分離微生物和DNA的技術(shù)在本領(lǐng)域熟知。編碼多肽的多核苷酸可以在之后通過(guò)類似地篩選另一微生物的基因組DNA或cDNA文庫(kù)或混合的DNA樣本而獲得。一旦編碼多肽的多核苷酸被探針檢測(cè)到，多核苷酸可以通過(guò)使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)來(lái)分離或克隆(參見(jiàn)例如Sambrook等人,1989,同上)。
[0078]核酸構(gòu)建體
[0079]本發(fā)明還涉及包含可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序列的本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體，其中一個(gè)或多個(gè)控制序列在與控制序列相容的條件下引導(dǎo)編碼序列在合適宿主細(xì)胞中的表達(dá)。[0080]多核苷酸可以以多種方式操縱，以提供用于多肽的表達(dá)。多核苷酸在其插入載體之前的操縱，根據(jù)表達(dá)載體的不同，可能是期望的或必需的。使用重組DNA方法來(lái)修飾多核苷酸的技術(shù)為本領(lǐng)域熟知。
[0081]控制序列可以為啟動(dòng)子，即被宿主細(xì)胞識(shí)別以用于編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的表達(dá)的多核苷酸。啟動(dòng)子包括引導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子可以是在宿主細(xì)胞中示出轉(zhuǎn)錄活性的任意多核苷酸，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，且啟動(dòng)子可以得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因。
[0082]合適的用于引導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的實(shí)例為得自解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) α -淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) α -淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophiIus)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽抱桿菌xylA和xylB基因、蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis) cryIIIA基因(Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology13:97-107)> 大腸桿菌(E.coli)乳糖操縱子、大腸桿菌trc啟動(dòng)子(Egon等人，1988, Gene69:301-315)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、和原核β_內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff 等人，1978, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:3727-3731 )、以及 tac 啟動(dòng)子(DeBoer 等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:21-25)的啟動(dòng)子。其他啟動(dòng)子記載在“Useful proteins from recombinant bacteria，，in Gilbert 等人，1980，ScientificAmerican242:74-94;以及Sambrook等人，1989，同上。串聯(lián)啟動(dòng)子的實(shí)例在W099/43835中公開(kāi)。
[0083]合適的用于引導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的實(shí)例是得自構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α -淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α -淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(AspergiIIus oryzae) TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、鑲片鐮抱(Fusarium venenatum)淀粉`葡萄糖苷酶(W000/56900)、壤片鍵抱 Daria (W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn (W000/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei) β -葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉β -木糖苷酶的基因的啟動(dòng)子，以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自曲霉中性α-淀粉酶基因的修飾啟動(dòng)子，其中非翻譯前導(dǎo)已被曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的非翻譯前導(dǎo)替換；非限制性實(shí)例包括黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修飾啟動(dòng)子，其中非翻譯前導(dǎo)已被構(gòu)巢曲霉或米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的非翻譯前導(dǎo)替換)；以及其突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。
[0084]在酵母宿主中，可用的啟動(dòng)子得自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3磷酸脫氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)、和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。用于酵母宿主細(xì)胞的其他可用啟動(dòng)子由Romanos等人，1992，Yeast8:423-488 描述。
[0085]控制序列也可以是轉(zhuǎn)錄終止子，其被宿主細(xì)胞識(shí)別來(lái)終止轉(zhuǎn)錄。終止子可操作地連接至編碼多肽的多核苷酸的3’端。任何在宿主細(xì)胞中起作用的終止子均可以用在本發(fā)明中。
[0086]用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子得自克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)堿性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(amyL)、和大腸桿菌核糖體RNA (rrnB)的基因。
[0087]用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子得自構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因。
[0088]用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子得自釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。用于酵母宿主細(xì)胞的其他可用終止子由Romanos等人，1992，同上描述。
[0089]控制序列也可以是啟動(dòng)子的下游和基因的編碼序列的上游的增加基因表達(dá)的mRNA 穩(wěn)定序列(mRNA stabilizer)區(qū)域。
[0090]合適的mRNA穩(wěn)定序列區(qū)域的實(shí)例得自蘇云金芽孢桿菌cryIIIA基因(TO94/25612)和枯草芽孢桿菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal ofBacteriologyI77:3465-3471)。
[0091]控制序列也可以是前導(dǎo)序列，即對(duì)由宿主細(xì)胞翻譯較為重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接到編碼多肽的多核苷酸的5’端。任何在宿主細(xì)胞中起作用的前導(dǎo)序列均可以使用。
[0092]用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列得自米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的基因。
[0093]用于酵母宿主細(xì)胞的合適前導(dǎo)序列得自釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因。
[0094]控制序列也可以是多腺苷酸化序列，即可操作地連接至多核苷酸的3’端的序列，在轉(zhuǎn)錄時(shí)被宿主細(xì)胞識(shí)別為向轉(zhuǎn)錄mRNA添加多腺苷殘基的信號(hào)。在宿主細(xì)胞中起作用的任何多腺苷酸化序列均可以使用。
[0095]用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選多腺苷酸化序列得自構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因。
[0096]用于酵母宿主細(xì)胞的有用多腺苷酸化序列由Guo and Sherman, 1995, Mol.Cellular Biol.15:5983-5990 描述。
[0097]控制序列也可以是編碼與多肽N端連接的信號(hào)肽并引導(dǎo)多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌通路的信號(hào)肽編碼區(qū)。多核苷酸的編碼序列的5’端可以固有地包含在翻譯閱讀框中與編碼多肽的編碼序列片段自然連接的信號(hào)肽編碼序列。或者，編碼序列的5’端可以包含對(duì)于編碼序列為外來(lái)的信號(hào)肽編碼序列。在編碼序列不天然包含信號(hào)肽編碼序列時(shí)，外來(lái)信號(hào)肽編碼序列可能是需要的?；蛘撸瑸樵鰪?qiáng)多肽的分泌，外來(lái)信號(hào)肽編碼序列可以簡(jiǎn)單地取代天然信號(hào)肽編碼序列。然而，任何引導(dǎo)所表達(dá)的多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌通路的信號(hào)肽編碼序列均可以使用。
[0098]用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是得自芽孢桿菌NCIB11837麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌ct -淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌prsA的基因的信號(hào)妝編碼序列。其他信號(hào)妝由Simonen and Palva, 1993, MicrobiologicalReviews57:109-137 描述。
[0099]用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是得自黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因的信號(hào)肽編碼序列。
[0100]用于酵母宿主細(xì)胞的可用信號(hào)肽得自釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因。其他可用的信號(hào)肽編碼序列由Romanos等人，1992，同上描述。
[0101]控制序列也可以是編碼位于多肽N端的前肽的前肽編碼序列。得到的多肽稱為酶原或前多肽(或在一些情況下為酵素原)。前多肽一般是失活的且可以通過(guò)從前多肽到多肽的催化或自催化切割而轉(zhuǎn)化為活性多肽。前肽編碼序列可以得自枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲菌(Myceliophthora thermophila)漆酶(W095/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母α -因子的基因。
[0102]在信號(hào)肽和前肽序列均 存在時(shí)，前肽序列緊鄰多肽的N端且信號(hào)肽序列緊鄰前肽序列的N端。
[0103]也可能需要添加調(diào)控相對(duì)于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的多肽的表達(dá)的調(diào)控序列。調(diào)控系統(tǒng)的實(shí)例是響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)控化合物的存在)引起基因表達(dá)的開(kāi)啟和關(guān)閉的那些。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包含lac、tac、和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、米曲霉TAKAa-淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子。調(diào)控序列的其他實(shí)例是使得基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，調(diào)控序列包括在甲氨蝶呤的存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因、以及在重金屬的存在擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸將可操作地與調(diào)控序列連接。
[0104]表汰載體
[0105]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸、啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體。各種核苷酸和控制序列可以連接在一起，以制備可以包含一個(gè)或多個(gè)使得編碼多肽的多核苷酸可以在位點(diǎn)插入或替換的限制性內(nèi)切位點(diǎn)的重組表達(dá)載體?；蛘?，多核苷酸可以通過(guò)將多核苷酸或包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入到合適的表達(dá)用載體中進(jìn)行表達(dá)。在構(gòu)建表達(dá)載體的過(guò)程中，編碼序列位于載體中，從而編碼序列可操作地與合適的表達(dá)用控制序列連接。
[0106]重組表達(dá)載體可以是任何可以方便地進(jìn)行重組DNA程序并可引起多核苷酸表達(dá)的載體(例如，質(zhì)?；虿《?。載體的選擇通常取決于載體與載體將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。
[0107]載體可以是自主復(fù)制型載體，即作為染色體外實(shí)體而存在且其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制的載體，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可以包含確保自我復(fù)制的任何元件(means)?；蛘?，載體可以是，在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)整合到基因組中并與其整合的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單個(gè)載體或質(zhì)粒，或使用共同包含將要導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組中的總DNA的兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，或使用轉(zhuǎn)座子。
[0108]載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等細(xì)胞的選擇性標(biāo)記物。選擇性標(biāo)記物是基因，其產(chǎn)物提供對(duì)生物滅殺劑的抗性或病毒抗性、重金屬抗性、相對(duì)于營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。
[0109]細(xì)菌選擇性標(biāo)記物的實(shí)例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因、或提供抗生素耐性如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壯觀霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記物。用于酵母宿主細(xì)胞的合適標(biāo)記物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記物包括但不限于amdS (乙酰胺酶)、argB (鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar (膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD (硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、SC (硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)、和trpC (鄰氨基苯甲酸合成酶)、以及其等價(jià)物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus) bar 基因。
[0110]優(yōu)選載體包含有使得載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中或使載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組而自主復(fù)制的元件。
[0111]對(duì)于整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可以依賴于編碼多肽的多核苷酸序列或經(jīng)同源重組或非同源重組使載體整合入基因組的任何其他元件。或者，載體可以含有用于經(jīng)由同源重組而引導(dǎo)在染色體的精確位置整合入宿主細(xì)胞基因組的其他多核苷酸。為增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)當(dāng)包含足量的核酸，例如100~10，000個(gè)堿基對(duì)、400~10，000個(gè)堿基對(duì)、以及800~10，000個(gè)堿基對(duì)，其與相應(yīng)的靶序列具有高度的序列同一性，以增強(qiáng)同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，載體可以通過(guò)非同源重組而整合到宿主細(xì)胞 的基因組中。
[0112]對(duì)于自主復(fù)制，載體還可以包含使載體能在被考慮的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)。復(fù)制原點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制原點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”是指使質(zhì)?；蜉d體能在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。
[0113]細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)的實(shí)例是使得在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制原點(diǎn)以及使得在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ I的復(fù)制原點(diǎn)。
[0114]用在酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制原點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制原點(diǎn)ARS1，ARS4，ARSl與CEN3的組合，以及ARS4與CEN6的組合。
[0115]用于絲狀真菌細(xì)胞的復(fù)制原點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI (Gems等人，1991，Gene98:61-67;Cullen 等人，1987，Nucleic Acids Res.15:9163-9175;W000/24883)oAMAl基因的分離以及包含該基因的質(zhì)粒或載體的構(gòu)建可以根據(jù)W000/24883中公開(kāi)的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0116]多于一個(gè)拷貝的本發(fā)明多核苷酸可以插入到宿主細(xì)胞中，以增加多肽的生成。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可以通過(guò)將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組中而得到；或者通過(guò)包含可擴(kuò)增選擇標(biāo)記物基因與多核苷酸而獲得，這樣，可以通過(guò)在合適選擇劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選擇含有擴(kuò)增拷貝的選擇標(biāo)記物基因的細(xì)胞，由此選擇含有額外拷貝的多核苷酸的細(xì)胞。
[0117]用來(lái)連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見(jiàn)，例如，Sambrook等人，1989，同上)。
[0118]宿主細(xì)朐
[0119]本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含與一個(gè)或多個(gè)引導(dǎo)本發(fā)明多肽生產(chǎn)的控制序列可操作地連接的本發(fā)明多核苷酸。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，從而使構(gòu)建體或載體保持為染色體整合子或作為前述的自我復(fù)制染色體外載體。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括因復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。對(duì)于宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來(lái)源。
[0120]宿主細(xì)胞可以是任何可用于本發(fā)明多肽的重組生產(chǎn)的細(xì)胞，例如，原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
[0121]原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于芽孢桿菌屬、梭菌屬(Clostridium)、腸球菌屬(Enterococcus)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、海洋芽抱桿屬(OceanobaciIIus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、和鏈霉菌屬(Streptomyces)。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于彎曲菌屬(Campylobacter)、大腸桿菌、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟菌屬(Neisseria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、和服原體屬(UreapIasma)。
[0122]細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌細(xì)胞，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacillus Iautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
[0123]細(xì)菌宿主細(xì)胞也可以是任何鏈球菌細(xì)胞，包括但不限于馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、化胺性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)和馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)細(xì)胞。
[0124]細(xì)菌宿主細(xì)胞也可以是任何鏈霉菌(Streptomyces)細(xì)胞，包括但不限于不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)和變鉛青鏈霉菌(Streptomyces Iividans)細(xì)胞。
[0125]將DNA導(dǎo)入芽孢桿菌細(xì)胞可以通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Chang andCohenj 1979，Mol.Gen.Genet.168:111-115)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Young andSpizizenj 1961，J.Bacteriol.81:823-829 或Dubnau and Davidoff-Abelsonj 1971，J.Mol.Biol.56:209-221)、電穿孔(參見(jiàn)，例如，Shigekawa and Dowerj 1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見(jiàn)，例如，Koehler and Thorne，1987，J.Bacteriol.169:5271-5278)來(lái)實(shí)現(xiàn)。將DNA導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞可以通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Hanahanj 1983, J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見(jiàn)，例如，Dower 等人，1988，Nucleic AcidsRes.16:6127-6145)來(lái)實(shí)現(xiàn)。將DNA導(dǎo)入鏈霉菌細(xì)胞可以通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔(參見(jiàn)，例如，Gong等人，2004，F(xiàn)olia Microbiol.(Praha) 49:399-405)、接合(參見(jiàn)，例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見(jiàn)，例如，Burke 等人，2001, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:6289-6294)來(lái)實(shí)現(xiàn)。將DNA導(dǎo)入假單胞菌細(xì)胞可以通過(guò)電穿孔(參見(jiàn)，例如，Choi 等人，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見(jiàn)，例如，Pinedoand Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)而實(shí)現(xiàn)。將DNA 導(dǎo)入鏈球菌細(xì)胞可以通過(guò)自然感受態(tài)(參見(jiàn)，例如，Perry and Kuramitsuj 1981，Infect.1mmun.32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Catt and Jollick，1991，Microbios68:189-207)、電穿孔(參見(jiàn)，例如，Buckley 等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見(jiàn)，例如，Clewellj 1981，Microbiol.Rev.45:409-436)來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，可以使用任何領(lǐng)域內(nèi)已知的將DNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中的方法。
[0126]宿主細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物、或真菌細(xì)胞。
[0127]宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。本文所用的“真菌”包括子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、壺菌門(mén)和接合菌門(mén)以及卵菌門(mén)和所有有絲分裂真菌(如Hawksworth等人，In, Ainsworth andBisby^ s Dictionary of The Fungi，8thedition， 1995，CAB International,UniversityPress, Cambridge, UK 所定義)。
[0128]真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。本文所用的“酵母”包括產(chǎn)子囊孢子酵母(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔(dān)子酵母和屬于半知菌的酵母(芽孢綱)。由于酵母的分類在未來(lái)可能會(huì)變化，出于本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)當(dāng)如 Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, andDavenport, editors, Soc.App.Bacteriol.Symposium Series N0.9，1980)中記載般進(jìn)行定義。
`[0129]酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces )、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母屬(Yarrowia)細(xì)胞，例如乳酸克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasi1、克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)、Saccharomycesoviformis 或解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)細(xì)胞。
[0130]真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(mén)和卵菌門(mén)分支的所有絲狀形式(如Hawksworth等人，1995，同上所定義)。絲狀真菌通常的特征在于，由殼質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其他復(fù)合多糖組成的菌絲體壁。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲伸長(zhǎng)，碳分解代謝必須是需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽，碳分解可以是發(fā)酵性的。
[0131]絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、黑管菌 M (Bjerkandera)Λ 擬錯(cuò)霉屬(Ceriporiopsis)、金孢屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、線黑粉酵母屬(Filibasidium)、鐮孢菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、巨座殼屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲菌屬(Myceliophthora)、新美鞭菌屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(PeniciIlium)、平革菌屬(Phanerochaete)、白腐菌屬(Phlebia)、梨囊鞭菌屬(Piromyces)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂糟菌屬(SchizophylIum)、籃狀菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)或木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞。[0132]例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉、煙管菌(Bjerkandera adusta)、干擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、淺黃擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsisgilvescens)、 Ceriporiopsis pannocinta、 Ceriporiopsis rivulosa、 Ceriporiopsissubrufa、蟲(chóng)擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜毛金色抱(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、類狀金抱(Chrysosporium merdarium)、 Chrysosporium pannicola、 Chrysosporiumqueenslandicum、熱帶金抱菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、粗毛云芝(Coriolus hirsutus)、桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、谷類德抱(Fusarium cerealis)、克魯克威爾德抱菌(Fusarium crookwellense)、黃色德抱菌(Fusarium culmorum)、禾谷德抱菌(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusarium graminum)、異抱德抱(Fusarium heterosporum)、合歡木德抱(Fusarium negundi)、尖德抱菌(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusarium roseum)、接骨木德抱(Fusarium sambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬枝抱德抱菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱(Fusarium sulphureum)、圓德抱(Fusarium torulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusarium venenatum)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糖脈胞菌(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、脈射菌(Phlebia radiata)、剌序側(cè)耳(Pleurotus eryngii)、太瑞斯梭抱殼(Thielaviaterrestris)、長(zhǎng)域毛栓菌(Trametes viI1sa)、變色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii )、長(zhǎng)梗木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichoderma viride)細(xì)胞。
[0133]真菌細(xì)胞可以通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法以本質(zhì)上已知的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化。合適的用于曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的方法記載在 EP238023、Yelton 等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474 以及Christensen等人，1988，Bio/Technology6:1419-1422中。用于轉(zhuǎn)化鐮孢菌屬物種的適當(dāng)方法由Malardier等人，1989，Gene78:147-156和W096/00787描述。酵母可以使用由 Becker and Guarentej In Abelsonj J.N.and Simon, Μ.1., editors, Guide to YeastGenetics and Molecular Biology, Methods in Enzymologyj Volumel94, ppl82-187, Academic Press, Inc.，New York ；Ito 等人，1983，J.Bacteriol.153:163 ；以及 Hinnen 等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1920 記載的方法來(lái)轉(zhuǎn)化。
[0134]生產(chǎn)方法
[0135]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)以其野生型產(chǎn)生多肽的細(xì)胞；和(b)回收多肽。在優(yōu)選的方面，細(xì)胞是毛殼屬細(xì)胞。在更優(yōu)選的方面，細(xì)胞是球毛殼細(xì)胞。
[0136]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞jP(b)回收多肽。
[0137]使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于生產(chǎn)多肽的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以通過(guò)在合適的介質(zhì)中并在使得多肽進(jìn)行表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)。使用本領(lǐng)域已知的步驟，培養(yǎng)可以在包含碳源和氮源以及無(wú)機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行。合適的介質(zhì)可以從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組成(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)來(lái)制備。如果多肽被分泌到營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中，則可以直接從介質(zhì)回收多肽。如果多肽未被分泌，則可以從細(xì)胞裂解物中回收。
[0138]多肽可以使用領(lǐng)域內(nèi)已知的特定用于多肽的方法來(lái)檢測(cè)。這些檢測(cè)方法包括但不限于特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成、或酶底物的消失。例如，酶測(cè)定可以用來(lái)判定多肽的活性。
[0139]多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)回收。例如，多肽可以通過(guò)常規(guī)步驟從營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中回收，這些常規(guī)步驟包括但不限于收集、離心、過(guò)濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。
[0140]多肽可以通過(guò)本領(lǐng) 域已知的多種方法進(jìn)行純化，以獲得基本純的多肽，方法包括但不限于層析法(例如，離子交換層析、親和層析、疏水性層析、聚焦層析、和尺寸排阻層析)、電泳法(例如，制備式等電聚焦)、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(參見(jiàn)例如，Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, NewYork, 1989)。
[0141]在可替代的方面，不回收多肽，而是將表達(dá)多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞用作多肽的來(lái)源。
[0142]植盤(pán)
[0143]本發(fā)明還涉及分離的植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、或植物細(xì)胞，其包含有本發(fā)明的多核苷酸，以表達(dá)并產(chǎn)生可回收量的多肽或結(jié)構(gòu)域。多肽或結(jié)構(gòu)域可以從植物或植物部分進(jìn)行回收?；蛘?，包含多肽或結(jié)構(gòu)域的植物或植物部分可以提高食物或飼料的質(zhì)量，例如，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、適口性、和流變特性，或破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。
[0144]轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例為草例如草地早熟禾(藍(lán)草，早熟禾屬)，飼用牧草如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium),溫帶草如剪股穎屬(Agrostis),和谷類植物例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。
[0145]雙子葉植物的實(shí)例為煙草，豆科植物如羽扇豆、馬鈴薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，和十字花科植物(十字花科)如花椰菜，油菜籽，和密切相關(guān)的模式生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
[0146]植物部分的實(shí)例為莖、愈傷組織、葉、根、果實(shí)、種子、和塊莖以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮、葉肉、薄壁組織、維管組織、分生組織。具體的植物細(xì)胞腔室，如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、液泡、過(guò)氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)也被認(rèn)為是植物部分。此外,任何植物細(xì)胞，無(wú)論組織的來(lái)源，都認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分如分離的用來(lái)促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如，胚芽、胚乳、糊粉和種皮。
[0147]同樣包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代。
[0148]表達(dá)多肽或結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以按照本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入到植物宿主基因組或葉綠體基因組中并使所得的修飾的植物或植物細(xì)胞繁殖成轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，從而構(gòu)建植物或植物細(xì)胞。
[0149]表達(dá)構(gòu)建體便利地為核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與多核苷酸在所選植物或植物部分中表達(dá)所必需的適合的調(diào)控序列可操作地連接的編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含用來(lái)鑒定已整合有表達(dá)構(gòu)建體的植物細(xì)胞的選擇性標(biāo)記物，以及對(duì)于將構(gòu)建體導(dǎo)入所考慮植物中所必需的DNA序列(后者取決于所使用的DNA導(dǎo)入方法)。
[0150]調(diào)控序列的選擇，如啟動(dòng)子和終止子序列以及任選的信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇，是基于例如期望何時(shí)、何處以及如何表達(dá)多肽或結(jié)構(gòu)域而加以確定的。比如，編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的基因的表達(dá)可以是組成型表達(dá)或誘導(dǎo)型表達(dá)，或者可以是發(fā)育性表達(dá)、階段表達(dá)或組織特異性表達(dá)，且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分，如種子或葉。調(diào)控序列記載于例如 Tague 等人,1988, Plant Physiology86:506 中。
[0151]對(duì)于組成型表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉蜀黍泛素1、或稻肌動(dòng)蛋白I啟動(dòng)子(Franck 等人，1980，Cell21:285-294;Christensen 等人，1992，Plant Mol.Biol.18:675-689;Zhang 等人，1991，Plant Cell3:1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是，例如來(lái)自忙藏 庫(kù)組織如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)的啟動(dòng)子(Edwards andCoruzzi, 1990, Ann.Rev.Genet.24:275-303),或來(lái)自代謝庫(kù)組織如分生組織的啟動(dòng)子(Ito等人，1994，Plant Mol.Biol.24:863-878)，種子特異性啟動(dòng)子如來(lái)自稻的谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白啟動(dòng)子(Wu等人，1998，Plant Cell Physiol.39:885-889)，來(lái)自豆球蛋白B4的蠶豆(Vicia faba)啟動(dòng)子和來(lái)自蠶豆的未知種子蛋白基因(Conrad等人,1998, J.Plant Physiol.152:708-711)、來(lái)自種子油體蛋白的啟動(dòng)子(Chen等人，1998，Plant Cell Physiol.39:935-941 )、來(lái)自甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)的忙藏蛋白napA啟動(dòng)子，或本領(lǐng)域已知的任何其他種子特異性啟動(dòng)子，例如W091/14772中描述的。此外，啟動(dòng)子可以為葉特異性啟動(dòng)子如來(lái)自稻或番爺?shù)膔bcs啟動(dòng)子(Kyozuka等人，1993，Plant Physiol.102:991-1000),小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子(Mitra and Higgins, 1994, Plant Mol.Biol.26:85-93)，來(lái)自稻的 aldP 基因啟動(dòng)子(Kagaya等人，1995，Mol.Gen.Genet.248:668-674)，或傷口誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xu等人，1993，Plant Mol.Biol.22:573-588)。同樣地，啟動(dòng)子可以經(jīng)由非生物處理誘導(dǎo)，如溫度、干旱、或鹽度的改變，或經(jīng)由外部施加的激活啟動(dòng)子的物質(zhì)來(lái)誘導(dǎo)，例如，這些物質(zhì)是指乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脫落酸、和赤霉酸)，以及重金屬。
[0152]也可以使用啟動(dòng)子增強(qiáng)元件來(lái)實(shí)現(xiàn)多肽或結(jié)構(gòu)域在植物中的更高的表達(dá)。比如，啟動(dòng)子增強(qiáng)元件可以是位于啟動(dòng)子與編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸之間的內(nèi)含子。比如，Xu等人(1993，同上)公開(kāi)了使用稻肌動(dòng)蛋白I基因的第一內(nèi)含子來(lái)加強(qiáng)表達(dá)。
[0153]選擇性標(biāo)記物基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分可以從本領(lǐng)域中可得的那些中選擇。
[0154]核酸構(gòu)建體按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)導(dǎo)入到植物基因組中，這些技術(shù)包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化(biolistictransformation)和電穿孔(Gasser 等人,1990, Science244:1293;Potrykus, 1990, Bio/Technology8:535; Shimamoto 等人,1989, Nature338:274)。
[0155]根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物(對(duì)于綜述，參見(jiàn) Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Mol.Biol.19:15-38)和用來(lái)轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法，雖然對(duì)于這些植物也可以使用其他轉(zhuǎn)化方法。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法是對(duì)胚愈傷組織或發(fā)育中的胚的粒子轟擊(涂有轉(zhuǎn)化DNA的微小的金或鶴顆粒)(Christou, 1992, Plant J.2:275-281; Shimamoto, 1994, Curr.0pin.Biotechnol.5:158-162; Vasil 等人,1992, Bio/Techno logy 10:667-674 )? 可替代的用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化的方法是基于Omirulleh等人，1993，Plant Mol.Biol.21:415-428描述的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。其他轉(zhuǎn)化方法包括在美國(guó)專利第6，395，966號(hào)和第7，151，204號(hào)(二者均通過(guò)引用的方式全部并入本文)中描述的那些。
[0156]轉(zhuǎn)化后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法來(lái)選擇已導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化子并再生成整個(gè)植物。通常，轉(zhuǎn)化過(guò)程設(shè)計(jì)為，在再生過(guò)程中或在后續(xù)世代中通過(guò)使用例如兩個(gè)獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過(guò)特異性重組酶對(duì)選擇基因的位點(diǎn)特異性切除來(lái)選擇性地消除選擇基因。
[0157]除使用本發(fā)明的構(gòu)建體進(jìn)行的特定植物基因型的直接轉(zhuǎn)化之外，還可以通過(guò)使具有構(gòu)建體的植物與缺乏該構(gòu)建體的另一植物進(jìn)行雜交來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以通過(guò)雜交將編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體導(dǎo)入特定植物種類，而不需要直接轉(zhuǎn)化指定種類的植物。因此，本發(fā)明不僅包含直接從按照本發(fā)明進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行再生的植物，還包含此類植物的后代。如本文所使用的，后代可以表示按照本發(fā)明制備的任一代親本植物的后代。這些后代可以包含按照本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體。雜交使得轉(zhuǎn)基因通過(guò)起始株系與供體植物系的異花授粉而導(dǎo)入植物系。此類步驟的非限制性實(shí)例在美國(guó)專利第7，151，204號(hào)中描述。
[0158]植物可以通過(guò)回交轉(zhuǎn)換的方法而產(chǎn)生。例如，植物包括被稱為回交轉(zhuǎn)換基因型、系、近交種或雜交種的植物。
[0159]遺傳標(biāo)記物可以用于協(xié)助發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因從一個(gè)遺傳背景基因滲入到另一個(gè)遺傳背景。標(biāo)記物協(xié)助的選擇相對(duì)于傳統(tǒng)育種所提供的優(yōu)勢(shì)在于，可以用來(lái)避免由表型變化引起的錯(cuò)誤。另外，遺傳標(biāo)記物可以提供關(guān)于優(yōu)良種質(zhì)在特定雜交的個(gè)體后代中的相對(duì)程度的數(shù)據(jù)。例如，當(dāng)具有期望性狀并另外具有非農(nóng)藝學(xué)所期望的遺傳背景的植物與優(yōu)良親本雜交時(shí)，遺傳標(biāo)記物可以用來(lái)選擇不僅具有目標(biāo)性狀還具有較大比例的期望種質(zhì)的后代。這樣，將一個(gè)或多個(gè)性狀基因滲入到特定遺傳背景所需的世代數(shù)目被最大程度地降低。
[0160]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽或結(jié)構(gòu)域的方法，其包括(a)在有益于生產(chǎn)多肽或結(jié)構(gòu)域的條件下培養(yǎng)包含有編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；(b)回收多肽或結(jié)構(gòu)域。
[0161]過(guò)氧化酶活性的去除或降低
[0162]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)親本細(xì)胞的突變體的方法，其包括破壞編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸或其部分，或者使其缺失，得到與親本細(xì)胞相比當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生更少多肽的突變細(xì)胞。
[0163]可以使用本領(lǐng)域熟知的方法(例如插入、破壞、取代或缺失)通過(guò)減少或消除多核苷酸的表達(dá)來(lái)構(gòu)建突變細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，多核苷酸是失活的。所要修飾或被失活的多核苷酸可以是，例如編碼區(qū)或?qū)τ诨钚远员匦璧牟糠?，或者是編碼區(qū)表達(dá)所需的調(diào)控元件。這些調(diào)控序列或控制序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能性部分，即，足以影響多核苷酸的表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其他控制序列包括但不限于，前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活因子。
[0164]可以通過(guò)對(duì)親本細(xì)胞進(jìn)行誘變并且選擇已降低或消除多核苷酸的表達(dá)的突變細(xì)胞來(lái)進(jìn)行多核苷酸的修飾或失活。特異性的或隨機(jī)的誘變可以通過(guò)例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行，通過(guò)使用合適的寡核苷酸進(jìn)行，或通過(guò)使DNA序列進(jìn)行PCR產(chǎn)生的誘變而進(jìn)行。此外，可以通過(guò)使用這些誘變劑的任何組合來(lái)進(jìn)行誘變。
[0165]適合于當(dāng)前目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0-甲基羥胺、亞硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。
[0166]當(dāng)使用這些試劑時(shí)，誘變的進(jìn)行通常通過(guò)在合適條件下，在所選誘變劑的存在下，孵育待誘變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇表現(xiàn)出減少的基因表達(dá)或無(wú)基因表達(dá)的突變細(xì)胞。
[0167]可以通過(guò)在基因中插入、替換或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸或插入、替換或缺失其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件來(lái)實(shí)現(xiàn)多核苷酸的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而引起終止密碼子的引入、起始密碼子的去除或開(kāi)放閱讀框的改變?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的方法通過(guò)定點(diǎn)誘變或PCR產(chǎn)生的誘變來(lái)實(shí)現(xiàn)這些修飾或失活。盡管在理論上可以在體內(nèi)進(jìn)行修飾，即，直接在表達(dá)待修飾多核苷酸的細(xì)胞上進(jìn)行，但優(yōu)選如下所示地在體外進(jìn)行修飾。
[0168]消除或降低多核苷酸的表達(dá)的便利方式的實(shí)例是基于基因取代、基因缺失或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將對(duì)應(yīng)于內(nèi)源多核苷酸的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生有缺陷的核酸序列，隨后將其轉(zhuǎn)化入親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過(guò)同源重組，缺陷核酸序列取代內(nèi)源多核苷酸。期望缺陷多核苷酸還編碼可以用于選擇已被修飾或破壞多核苷酸的轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記物。在一個(gè)方面，使用選擇性標(biāo)記物(如本文所述的那些)來(lái)破壞多核苷酸。
[0169]本發(fā)明還涉及抑制具有過(guò)氧化酶活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，包括對(duì)細(xì)胞施用雙鏈RNA (dsRNA)分子或者在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA (dsRNA)分子，其中dsRNA包含本發(fā)明多核苷酸的子序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，dsRNA的長(zhǎng)度為約15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25個(gè)或更多個(gè)的雙螺旋核苷酸。
[0170]dsRNA優(yōu)選地是小干擾RNA (siRNA)或微小RNA (miRNA)。在優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制轉(zhuǎn)錄的小干擾RNA。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制翻譯的微小RNA。
[0171]本發(fā)明還涉及用于抑制細(xì)胞中多肽表達(dá)的包含SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列的部分的雙鏈RNA (dsRNA)分子。盡管本發(fā)明不受任何特定作用機(jī)制的限制，dsRNA能夠進(jìn)入細(xì)胞并引起相似或相同序列的單鏈RNA (ssRNA)(包括內(nèi)源mRNA)的降解。當(dāng)細(xì)胞暴露于dsRNA時(shí)，來(lái)自同源基因的mRNA經(jīng)由稱為RNA干擾(RNAi)的方法而被選擇性地降解。
[0172]本發(fā)明的dsRNA可以用于基因沉默。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的dsRNAi來(lái)選擇性降解RNA的方法。該方法可以在體外、先體外后體內(nèi)或在體內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)方面，dsRNA分子能夠用于產(chǎn)生細(xì)胞、器官或動(dòng)物中的功能缺失突變。用于制備和使用選擇性地降解RNA的dsRNA分子的方法在本領(lǐng)域中公知；參見(jiàn)，例如美國(guó)專利第6，489，127號(hào)；第 6, 506, 559 號(hào)；第 6, 511, 824 號(hào)；和第 6, 515, 109 號(hào)。
[0173]本發(fā)明還涉及親本細(xì)胞的突變細(xì)胞，其包含編碼多肽的多核苷酸或其控制序列的破壞或缺失或者包含編碼多肽的沉默基因，這樣得到與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽的突變細(xì)胞。
[0174]多肽缺陷型突變細(xì)胞在作為表達(dá)內(nèi)生和異源多肽的宿主細(xì)胞時(shí)特別有用。所以，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)內(nèi)生或異源多肽的方法，包括:(a)在有益于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和化)回收多肽。術(shù)語(yǔ)“異源多肽”意為對(duì)宿主細(xì)胞不是內(nèi)生的多肽，例如，內(nèi)生蛋白的變體。宿主細(xì)胞可以包含多于一個(gè)拷貝的編碼內(nèi)生或異源多肽的多核苷酸。
[0175]用于培養(yǎng)和純化目標(biāo)產(chǎn)物的方法可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。
[0176]本發(fā)明的用于產(chǎn)生基本不含過(guò)氧化酶的產(chǎn)物的方法在真核多肽(特別是真菌蛋白比如酶)的生產(chǎn)中具有特別的意義。過(guò)氧化酶缺陷型細(xì)胞也可以用于表達(dá)具有藥用價(jià)值的異源蛋白，如激素、生長(zhǎng)因子、受體等。術(shù)語(yǔ)“真核多肽”不僅包括內(nèi)生的多肽，而且還包括例如酶的已經(jīng)經(jīng)由氨基酸替換、缺失或添加或其他這樣的修飾所修飾以增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性和PH耐受性等的那些多肽。
`[0177]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的基本不含過(guò)氧化酶活性的蛋白產(chǎn)物。
[0178]鉬合物
[0179]在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的具有過(guò)氧化酶活性(過(guò)氧化酶)的多肽的組合物。
[0180]組合物可以包含本發(fā)明的過(guò)氧化酶作為主要多肽組分，例如，單組分組合物?；蛘撸M合物可以包含多種酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β_半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵過(guò)氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
[0181]組合物可以按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行制備，并且可以是液體或干燥組合物的形式。例如，多肽組合物可以是顆粒或微顆粒的形式。包含于組合物中的多肽可以按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法進(jìn)行穩(wěn)定。
[0182]下面給出本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途的實(shí)例?？梢曰诒绢I(lǐng)域已知的方法來(lái)確定本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其他條件。[0183]本發(fā)明的過(guò)氧化酶多肽可以加入并由此成為洗滌劑組合物的組分。
[0184]本發(fā)明的洗滌劑組合物可以配制成例如手動(dòng)或機(jī)器洗滌劑組合物，其包括適合于預(yù)處理污染織物的衣物洗滌添加劑組合物和漂洗時(shí)添加的織物柔軟劑組合物；或者可以配制成用于一般家庭硬表面清潔操作的洗滌劑組合物；或者配制為用于手動(dòng)或機(jī)器的洗碗操作。
[0185]在具體的方面，本發(fā)明提供一種包含如本文所述的本發(fā)明多肽的洗滌劑添加劑。
[0186]洗滌劑組合物可以包含一種或多種表面活性劑，該表面活性劑可以是陰離子表面活性劑和/或陽(yáng)離子表面活性劑和/或非離子表面活性劑和/或半極性表面活性劑和/或兩性離子表面活性劑或其混合物。在【具體實(shí)施方式】中，洗滌劑組合物包含一種或多種非離子表面活性劑與一種或多種陰離子表面活性劑的混合物。表面活性劑的通常存在水平是約0.lwt%至60wt%，例如，約1%至約40%、或約3%至約20%、或約3%至約10%。表面活性劑的選擇取決于所需的清潔應(yīng)用，并且包括本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)的表面活性劑。
[0187]洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種其他酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶如漆酶和/或過(guò)氧化物酶。
[0188]本發(fā)明的多肽可以以對(duì)應(yīng)于每升洗滌液0.001~IOOmg蛋白的量添加到洗滌劑組合物中，例如0.01~IOOmg的蛋白，優(yōu)選0.005~50mg蛋白，更優(yōu)選0.01~25mg的蛋白，甚至更優(yōu)選0.05~IOmg的 蛋白，最優(yōu)選0.05~5mg的蛋白，甚至最最優(yōu)選0.01~Img的蛋白。
[0189]具有過(guò)氧化酶活性的多肽(過(guò)氧化酶)以及任選地過(guò)氧化氫源可以配制成液體(例如，水性的)、固體、凝膠、糊劑或干燥產(chǎn)品制劑。干燥產(chǎn)品制劑可以隨后再水化以形成可用于本發(fā)明方法中的活性液體或半液體制劑。
[0190]當(dāng)將過(guò)氧化酶與過(guò)氧化氫源配制成干燥制劑時(shí)，可以將這些組分混合，布置在分離的層中或單獨(dú)包裝。
[0191]當(dāng)使用非干燥形式的制劑時(shí)，即使在這種情況下，優(yōu)選使用過(guò)氧化酶與過(guò)氧化氫源分開(kāi)的兩部分制劑系統(tǒng)。
[0192]本發(fā)明的組合物還可以包含助劑，比如潤(rùn)濕劑、增稠劑、用于pH控制的緩沖劑、穩(wěn)定劑、香料、著色劑、填充劑等。
[0193]有用的潤(rùn)濕劑是表面活性劑，即非離子、陰離子、兩性或兩性離子表面活性劑。表面活性劑還在上文有過(guò)描述。
_4] 方法和用途
[0195]本發(fā)明的過(guò)氧化酶多肽可以用于脂肪烴的2位或3位的位點(diǎn)特異性羥化，如W02011/120938中所述。脂肪烴必須包含至少3個(gè)碳的鏈，并且脂肪烴的任(一個(gè)或多個(gè))端可以用作起始點(diǎn)來(lái)確定哪個(gè)碳處于2位或3位。脂肪烴必須具有至少一個(gè)附著至2位或3位的碳(被羥化的)的氫。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由過(guò)氧化酶羥化的2位或3位的碳是未取代的(在進(jìn)行羥化之前)。
[0196]因此，在第一方面，本發(fā)明提供用于在具有至少3個(gè)碳并具有附著至2位或3位碳的氫的取代或未取代的、直鏈或支鏈的脂肪烴的任一端(一個(gè)或多個(gè)端)的2位或3位進(jìn)行羥化的方法，包括使脂肪烴與過(guò)氧化氫以及本發(fā)明的具有過(guò)氧化酶活性的多肽相接觸。[0197]本發(fā)明的方法可以用于各種目的，例如批量化學(xué)合成(生物催化)，增加脂肪烴的水溶解度、生物治理和改良食品特性。
[0198]本發(fā)明的方法也可以用于許多羥化反應(yīng)是有益的工業(yè)工藝中。這些應(yīng)用的實(shí)例是在紙漿和紙制品的制造中，其中存在于木材(樹(shù)脂)中的烷烴和其他相關(guān)脂肪烴可能造成紙漿和紙張制造過(guò)程中的沉積問(wèn)題。這些疏水化合物是紙漿和紙張制造過(guò)程中所謂的樹(shù)脂沉積的前體。樹(shù)脂沉積導(dǎo)致低品質(zhì)的紙漿，并且可能引起紙漿廠運(yùn)營(yíng)的停工。與具有高提取物含量的紙漿相關(guān)的具體問(wèn)題包括運(yùn)轉(zhuǎn)力問(wèn)題、紙上的斑點(diǎn)和孔洞以及紙張斷裂。用過(guò)氧化酶進(jìn)行處理可以增加這些化合物的溶解度并因此緩解問(wèn)題。
[0199]本發(fā)明方法的另一個(gè)用途是，即用于石油或煤精煉，其中過(guò)氧化酶催化的羥化可以用于修飾烴的溶解度、粘度和/或燃燒特性。具體地，該處理會(huì)引起所處理的烴的煙點(diǎn)、著火點(diǎn)、燃點(diǎn)和沸點(diǎn)的變化。
[0200]在散裝化學(xué)品、農(nóng)業(yè)化學(xué)品(包括殺蟲(chóng)劑)、專用化學(xué)品和藥品的合成中，本發(fā)明的方法顯然在將羥基選擇性地引入物質(zhì)從而影響所修飾化合物的溶解度方面是相關(guān)聯(lián)的。此外，選擇性羥化提供用于通過(guò)有機(jī)化學(xué)合成和化學(xué)酶促合成領(lǐng)域中已知的方法來(lái)做進(jìn)一步修飾的位點(diǎn)。
[0201]將天然氣大量加工以去除高級(jí)烷烴。此類高級(jí)烷烴的羥化可以用于提高水溶解度，并且因此通過(guò)洗滌天然氣流而促進(jìn)高級(jí)烷烴的去除?？梢栽诰谢蛘咴诰珶掃^(guò)程中進(jìn)行去除。
[0202]油廢物的羥化將顯著地提高生物可降解性，并且將可應(yīng)用于與精煉廠的廢水處理和被污染的地面或水的生物治理相關(guān)。
[0203]在第二方面，本發(fā)明提供用于在脂質(zhì)的酰基的末端的2位或3位進(jìn)行羥化的方法，包括使脂質(zhì)與過(guò)氧化氫以及本發(fā)明的具有過(guò)氧化酶活性的多肽相接觸。
[0204]脂質(zhì)的?；牧u化通常改善脂質(zhì)的水溶解度。相應(yīng)地，通過(guò)使衣物與過(guò)氧化酶和過(guò)氧化氫源、以及任選的表面活性劑相接觸，本發(fā)明的方法可以用于從衣物除去或減少包含油或脂質(zhì)的污潰，如巧克力。
[0205]在另一方面，通過(guò)將衣物與過(guò)氧化酶和過(guò)氧化氫源以及任選的表面活性劑相接觸，本發(fā)明的方法可以用來(lái)減少衣物中難聞的氣味。本發(fā)明的方法引起衣物中丁酸(酪酸)的量的減少。丁酸在洗滌衣物期間當(dāng)某些動(dòng)物脂肪和植物油被例如洗滌劑脂肪酶水解以得到游離脂肪酸(包括丁酸)時(shí)形成。丁酸具有極其難聞的氣味。過(guò)氧化酶將丁酸羥化成2-羥基丁酸(α -羥基丁酸)或3-羥基丁酸(β -羥基丁酸)。
[0206]本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的過(guò)氧化酶和過(guò)氧化氫在脂肪烴的至少兩端的第二或第三個(gè)碳處位點(diǎn)特異性地引入羥基和/或氧代(酮)基的方法。
[0207]脂肪烴必須包含至少5個(gè)碳的鏈。第二和第三個(gè)碳通過(guò)從脂肪烴的任一端進(jìn)行碳原子計(jì)數(shù)而判定。
[0208]脂肪烴必須具有至少一個(gè)附著至碳的氫，該碳通過(guò)羥基的附著而羥化；以及至少兩個(gè)當(dāng)引入氧代基時(shí)附著至碳的氫。在優(yōu)選實(shí)施方式中，第二或第三個(gè)碳在與過(guò)氧化酶接觸前未被取代。
[0209]根據(jù)本發(fā)明的方法，羥基和/或氧代基彼此獨(dú)立地引入在脂肪烴的(至少)兩端。因此，羥基可以引入在一端，同時(shí)氧代引入在另一(兩者中的另一)端，反之亦然。兩個(gè)羥基或兩個(gè)氧代基、或一個(gè)羥基和一個(gè)氧代基，無(wú)法引入在脂肪烴的同一端。組合的某些實(shí)例在實(shí)施例1中示出。
[0210]在本發(fā)明的上下文中，“氧化”表示引入羥基和/或氧代基。
[0211]因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于在具有至少五個(gè)碳并具有至少一個(gè)附著至第二或第三個(gè)碳的氫的取代或未取代的、直鏈或支鏈的脂肪烴的(至少)兩個(gè)端的第二或第三個(gè)碳引入羥基和/或氧代基的方法，包括使脂肪烴與過(guò)氧化氫以及本發(fā)明具有過(guò)氧化酶活性的多肽接觸。
[0212]在實(shí)施方式中，脂肪烴不是正己烷或正癸烷。
[0213]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)引入兩個(gè)羥基，脂肪烴被氧化為(轉(zhuǎn)化為)二醇。更優(yōu)選地，兩個(gè)羥基位于直鏈脂肪烴的各端。 [0214]本發(fā)明的方法可以用于多種目的，例如批量化學(xué)合成(生物催化)、增加脂肪烴的水溶性、生物治理、和食物產(chǎn)品的特性改良。
[0215]本發(fā)明的方法還可以用于其中氧化反應(yīng)是有利的多種工業(yè)方法。此類使用的實(shí)例是在紙漿和紙產(chǎn)品的制造中，其中在木材(樹(shù)脂)中存在的烷烴和其他相關(guān)脂肪烴可以引起紙漿和紙張制造過(guò)程中的沉積問(wèn)題。這些疏水性化合物是在紙漿和紙張制造過(guò)程中的所謂的樹(shù)脂沉積的前體。樹(shù)脂沉積造成低質(zhì)量紙漿，并可以引起紙漿碾磨操作的停工。與具有高提取物含量的紙漿相關(guān)的具體問(wèn)題包括流動(dòng)性問(wèn)題、紙張中的斑點(diǎn)和孔、以及紙張破裂。使用過(guò)氧化酶的處理可以增加該化合物的溶解度并從而緩和問(wèn)題。
[0216]本發(fā)明方法的另一個(gè)用途是在例如石油或煤精煉廠，其中過(guò)氧化酶催化的氧化作用可以用于修飾烴類的溶解度、粘度和/或燃燒特性。具體地，處理可以引起進(jìn)行處理的烴的煙點(diǎn)、著火點(diǎn)、燃點(diǎn)和沸點(diǎn)的改變。
[0217]在散裝化學(xué)品、農(nóng)用化學(xué)品(含殺蟲(chóng)劑)、專用化學(xué)品和藥物的合成中，本發(fā)明的方法在選擇性地將羥基引入物質(zhì)并從而影響所修飾化合物的溶解度方面是明顯相關(guān)的。此外，選擇性的氧化作用提供經(jīng)由本領(lǐng)域已知的有機(jī)化學(xué)合成和化學(xué)-酶促合成法而進(jìn)一步修飾的位點(diǎn)。
[0218]天然氣被大量地加工，以除去高級(jí)烷烴。此類高級(jí)烷烴的氧化可以用來(lái)改善水溶性，并從而通過(guò)洗滌天然氣流來(lái)促進(jìn)高級(jí)烷烴的去除。去除可以在井中或精煉過(guò)程中進(jìn)行。
[0219]根據(jù)本發(fā)明，油廢品的氧化將顯著提高生物可降解力并將適用于與精煉廠的廢水處理和污染的土地或水的生物治理相關(guān)。
[0220]本發(fā)明的方法可以用本發(fā)明的固定化過(guò)氧化酶多肽進(jìn)行。
[0221]本發(fā)明的方法可以在水性溶劑(反應(yīng)介質(zhì))、各種醇、醚、其他極性或非極性溶劑、或其混合物中進(jìn)行。通過(guò)研究本發(fā)明方法中使用的脂肪烴的特性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易識(shí)別出溶劑的適當(dāng)實(shí)例。通過(guò)提高或降低進(jìn)行羥化反應(yīng)/氧化反應(yīng)時(shí)的壓力，溶劑(反應(yīng)介質(zhì))和脂肪烴可以在反應(yīng)溫度保持液相。
[0222]根據(jù)本發(fā)明的方法可以在O至90攝氏度的溫度進(jìn)行，優(yōu)選5至80攝氏度，更優(yōu)選10至70攝氏度，甚至更優(yōu)選15至60攝氏度，最優(yōu)選20至50攝氏度，特別是20至40攝氏度。
[0223]本發(fā)明的方法可以采用10秒至(至少)24小時(shí)的處理時(shí)間，優(yōu)選為I分鐘至(至少)12小時(shí)，更優(yōu)選5分鐘至(至少)6小時(shí)，最優(yōu)選5分鐘至(至少)3小時(shí)，特別是5分鐘至(至少)I小時(shí)。
[0224]通過(guò)本發(fā)明方法制備的二醇(二羥基脂肪烴)可以用于制備聚氨酯。聚氨酯是由經(jīng)氨基甲酸酯(氨基甲酸乙酯)鏈連接的有機(jī)單元鏈構(gòu)成的聚合物。聚氨酯聚合物通過(guò)在催化劑的存在下使單體(具有至少兩個(gè)異氰酸酯官能團(tuán))與另一單體(具有至少兩個(gè)羥基)反應(yīng)，經(jīng)由逐步增長(zhǎng)聚合而形成。
[0225]本發(fā)明還提供用于在具有至少五個(gè)碳并具有至少兩個(gè)附著至第二或第三個(gè)碳的氫的取代或未取代的、直鏈或支鏈的脂肪烴的第二或第三個(gè)碳引入氧代(酮)基的方法，包括使脂肪烴與過(guò)氧化氫以及本發(fā)明中具有過(guò)氧化酶活性的多肽接觸。
[0226]在實(shí)施方式中，脂肪烴不是正己烷或正癸烷。
[0227]在另一方面，本發(fā)明還提供用于在具有至少五個(gè)碳且被羧基取代的直鏈或支鏈的脂肪烴的末端碳處引入羥基或氧代基的方法，包括使脂肪烴與過(guò)氧化氫以及本發(fā)明中具有過(guò)氧化酶活性的多肽接觸。
[0228]在實(shí)施方式中，被羧基取代的脂肪烴是脂肪酸；優(yōu)選為丁酸(酪酸)、戊酸(纈草酸)、己酸(羊油酸)、庚酸(葡萄花酸)、辛酸(羊脂酸)、壬酸(風(fēng)呂草酸)、癸酸(羊蠟酸)、十二烷酸(月桂酸)、十四烷酸(肉豆蘧酸)、十六烷酸(棕櫚酸)、十八烷酸(硬脂酸)、二十烷酸(花生酸)、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。
[0229]在實(shí)施方 式中，被羧基取代的脂肪烴不是月桂酸或棕櫚酸。
[0230]在另一方面，本發(fā)明還提供用于將具有至少五個(gè)碳的直鏈或支鏈脂肪烴的伯醇轉(zhuǎn)化(氧化)成相應(yīng)的酸的方法，包括使脂肪烴的醇與過(guò)氧化氫以及本發(fā)明中具有過(guò)氧化酶活性的多肽接觸。
[0231]例如，戊醇可以轉(zhuǎn)化(氧化)為戊酸(纈草酸)，己醇可以轉(zhuǎn)化為己酸(羊油酸)，庚醇可以轉(zhuǎn)化為庚酸(葡萄花酸)，辛醇可以轉(zhuǎn)化為辛酸(羊脂酸)，壬醇可以轉(zhuǎn)化為壬酸(風(fēng)呂草酸)，癸醇可以轉(zhuǎn)化為癸酸(羊蠟酸)，十二烷醇可以轉(zhuǎn)化為十二烷酸(月桂酸)，十四烷醇可以轉(zhuǎn)化為十四烷酸(肉豆蘧酸)，十六烷醇可以轉(zhuǎn)化為十六烷酸(棕櫚酸)，十八烷醇可以轉(zhuǎn)化為十八烷酸(硬脂酸)，且二十烷醇可以轉(zhuǎn)化為二十烷酸(花生酸)。
[0232]本發(fā)明的具有過(guò)氧化酶活性的多肽(過(guò)氧化酶多肽或過(guò)氧化酶)以0.005~50ppm(mg/1)、或 0.01 ~40、0.02 ~30、0.03 ~25、0.04 ~20、0.05 ~15、0.05 ~10、0.05 ~5、0.05~1、0.05~0.8、0.05~0.6或0.1~0.5ppm的量用在本發(fā)明的方法中。酶的量是指明確定義的酶制劑的mg。
[0233]在本發(fā)明的方法中，過(guò)氧化酶可以單獨(dú)應(yīng)用或與其他酶一起應(yīng)用。術(shù)語(yǔ)“其他酶”表示至少一種其他酶，例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十種或甚至更多種的其他酶。
[0234]術(shù)語(yǔ)“與…一起應(yīng)用”(或“與…一起使用”)是指其他酶可以在本發(fā)明方法的同一步驟或另一步驟中應(yīng)用。與使用過(guò)氧化酶的步驟相比，其他處理步驟可以為上游或下游。
[0235]在【具體實(shí)施方式】中，其他酶是具有蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、留醇酯酶、和/或膽固醇酯酶活性的酶。氧化還原酶的實(shí)例為具有漆酶和/或過(guò)氧化物酶活性的酶。
[0236]方法的術(shù)語(yǔ)“步驟”是指至少一個(gè)步驟，且可以是一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或甚
至更多個(gè)方法步驟。換言之，本發(fā)明的過(guò)氧化酶可以應(yīng)用在至少一個(gè)方法步驟中，且其他酶也可以應(yīng)用在至少一個(gè)方法步驟中，與使用過(guò)氧化酶的步驟相比，可以是同一方法步驟或不同的方法步驟。
[0237]術(shù)語(yǔ)“酶制劑”是指包含至少一種過(guò)氧化酶的產(chǎn)品。酶制劑也可以包含具有其他酶活性的酶。除酶活性以外，該制劑優(yōu)選包含至少一種佐劑。佐劑的實(shí)例為緩沖劑、聚合物、表面活性劑和穩(wěn)定劑。
[0238]過(guò)氧化氫
[0239]過(guò)氧化酶所需的過(guò)氧化氫可以提供為過(guò)氧化氫的水溶液或用于過(guò)氧化氫原位制備的過(guò)氧化氫前體。在溶解時(shí)釋放可以被過(guò)氧化酶使用的過(guò)氧化物的任何固態(tài)實(shí)體均可以充當(dāng)過(guò)氧化氫源。當(dāng)溶解于水或適當(dāng)?shù)乃灶惤橘|(zhì)時(shí)產(chǎn)出過(guò)氧化氫的化合物包括但不限于金屬過(guò)氧化物、過(guò)碳酸鹽、過(guò)硫酸鹽、過(guò)磷酸鹽、過(guò)氧酸、烷基過(guò)氧化物(alkyperoxide)、?；^(guò)氧化物、過(guò)氧酯、過(guò)氧化脲、過(guò)硼酸鹽和過(guò)氧羧酸或其鹽。
[0240]過(guò)氧化氫的另一來(lái)源是過(guò)氧化氫生成酶系統(tǒng)，例如氧化酶以及用于氧化酶的底物。氧化酶和底物的組合的實(shí)例包括但不限于氨基酸氧化酶(參見(jiàn)例如US6，248，575)和合適的氨基酸、葡糖氧化酶(參見(jiàn)例如W095/29996)和葡萄糖、乳酸氧化酶和乳酸(鹽)、半乳糖氧化酶(參見(jiàn)例如W000/50606)和半乳糖、以及醛糖氧化酶(參見(jiàn)例如W099/31990)和合適的醛糖。
[0241]通過(guò)研究ECl.1.3._、EC1.2.3._、EC1.4.3._、和 ECl.5.3._ 或類似類別(在國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)下)，氧化酶與底物的此類組合的其他實(shí)例容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員識(shí)別。
[0242]過(guò)氧化氫或過(guò)氧化氫源可以在本發(fā)明方法的開(kāi)始或過(guò)程中添加，例如，作為過(guò)氧化氫的一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的添加；或連續(xù)地作為補(bǔ)料分批添加。過(guò)氧化氫的典型量對(duì)應(yīng)于0.0OlmM至25mM的水平，優(yōu)選0.005mM至5mM的水平，特別是0.01mM至ImM過(guò)氧化氫的水平。過(guò)氧化氫也可以以對(duì)應(yīng)于0.1mM至25mM的水平的量進(jìn)行使用，優(yōu)選為0.5mM至15mM的水平，更優(yōu)選ImM至IOmM的水平,最優(yōu)選2mM至8mM過(guò)氧化氫的水平。
[0243]脂肪烴
[0244]在本發(fā)明方法中羥化的烴是具有至少3個(gè)碳的鏈并具有附著到2或3位碳的氫的脂肪烴。優(yōu)選地，脂肪烴是烷烴或烯烴；更優(yōu)選地，脂肪烴是烷烴例如丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷或癸烷、或其異構(gòu)體。
[0245]脂肪烴是直鏈或支鏈的，但不是環(huán)狀，因?yàn)榄h(huán)烴不可能有位點(diǎn)特異性羥化作用。支鏈的烴與直鏈烴的異構(gòu)體對(duì)應(yīng)。
[0246]脂肪烴是取代或未取代的。優(yōu)選地，脂肪烴是未取代的，例如非活化的烴。
[0247]當(dāng)脂肪烴是取代的(官能團(tuán)附著)時(shí)，優(yōu)選的取代基為鹵素、羥基、羧基、氨基、硝基、氰基、巰基、磺?；?、甲?；?、乙酰基、甲氧基、乙氧基、苯基、苯甲基、二甲苯基、氨基甲?；桶被酋；?；更優(yōu)選的取代基是氯、羥基、羧基和磺酰基；最優(yōu)選的取代基是氯和羧基。
[0248]脂肪烴可以被多至10個(gè)取代基、多至8個(gè)取代基、多至6個(gè)取代基、多至4個(gè)取代基、多至2個(gè)取代基或多至I個(gè)取代基所取代。
[0249]在優(yōu)選實(shí)施方式中，脂肪烴是脂肪酸(取代基是羧基)。脂肪酸的實(shí)例包括但不限于丁酸(酪酸)、戊酸(纈草酸)、己酸(羊油酸)、庚酸(葡萄花酸)、辛酸(羊脂酸)、壬酸(風(fēng)呂草酸)、癸酸(羊蠟酸)、十二烷酸(月桂酸)、十四烷酸(肉豆蘧酸)、十六烷酸(棕櫚酸)、十八烷酸(硬脂酸)、二十烷酸(花生酸)、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。[0250]在第二個(gè)方面，脂肪烴是脂質(zhì)如甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂或鞘脂的?；磺伊u化作用發(fā)生在?；哪┒说?位或3位。?；仨毦哂兄辽僖粋€(gè)附著至末端的2或3位碳的氫。?；梢允秋柡偷幕虿伙柡偷模胰芜x地，可以附著有官能團(tuán)(取代基)。?；膶?shí)例包括但不限于丁酸(酪酸)、戊酸(纈草酸)、己酸(羊油酸)、庚酸(葡萄花酸)、辛酸(羊脂酸)、壬酸(風(fēng)呂草酸)、癸酸(羊蠟酸)、十二烷酸(月桂酸)、十四烷酸(肉豆蘧酸)、十六烷酸(棕櫚酸)、十八烷酸(硬脂酸)、二十烷酸(花生酸)、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸的?；问?。
[0251]信號(hào)肽
[0252]本發(fā)明還涉及編碼信號(hào)肽的分離的多核苷酸，該信號(hào)肽包含SEQID NO: 2的氨基酸-17至-1或由SEQ ID NO: 2的氨基酸-17至-1組成。多核苷酸還可以包含編碼可操作地連接到信號(hào)肽的蛋白的基因。蛋白優(yōu)選對(duì)于信號(hào)肽是外來(lái)的。一方面，編碼信號(hào)肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸I至51。
[0253]本發(fā)明還涉及包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。
[0254]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)蛋白的方法，其包括(a)培養(yǎng)包含這些多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；以及(b)回收蛋白。
[0255]蛋白對(duì)于宿主細(xì)胞可以是內(nèi)生或異源的。本文中的術(shù)語(yǔ)“蛋白”不意在指代特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，因此，包含肽、寡肽和多肽。術(shù)語(yǔ)“蛋白”還包含兩種或更多種結(jié)合來(lái)形成編碼產(chǎn)物的多肽。蛋白還包括雜合多肽和融合多肽。
[0256]優(yōu)選地，蛋白為激素、酶、受體或其一部分、抗體或其一部分、或報(bào)告子。例如，蛋白可以是水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、 裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶，例如，氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β -木糖苷酶。
[0257]基因可以得自任何原核的、真核的、或其他來(lái)源。
[0258]本發(fā)明還通過(guò)以下實(shí)施例描述，實(shí)施例不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
[0259]實(shí)施例
[0260]菌株
[0261]米曲霉ΜΤ3568是米曲霉JaL355 (W02002/40694)的amdS (乙酰胺酶)破壞基因的衍生物，其中通過(guò)用pyrG基因破壞米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因來(lái)修復(fù)pyrG營(yíng)養(yǎng)缺陷型。
[0262]培養(yǎng)基和溶液
[0263]DAP-4C-1 培養(yǎng)某
[0264]Ilg MgSO4, 7H20
[0265]Ig KH2PO4
[0266]2g C6H8O7, H2O
[0267]20g葡萄糖
[0268]IOg麥芽糖
[0269]5.2g K3PO4, H2O[0270]0.5g酵母提取物
[0271]0.5ml KU6 微量金屬溶液(AMG)
[0272]混合直至完全溶解
[0273]添加Iml的Dowfax63N10 (直鏈Ε0/Ρ0嵌段共聚物、除泡劑/防泡劑)
[0274]用Mill1-Q水調(diào)節(jié)體積至1000ml
[0275]CaCO3 片劑 ?0.5g (每 200ml 添加 1片)
[0276]接種前，150ml的各搖瓶添加3.5ml的50%磷酸氫二銨((NH4)2ΗΡ04)和5.0ml的20%乳酸。
[0277]KU6微量金屬溶液(AMG)
[0278]6.8g ZnCl2
[0279]2.5g CuSO4, 5H20
[0280]0.13g無(wú)水 氯化鎳
[0281]13.9g FeSO4, 7H20
[0282]8.45g MnSO4, H2O
[0283]3g C6H8O7, H2O
[0284]離子交換水加至1000ml
[0285]實(shí)施例1
[0286]過(guò)氧化酶的表達(dá)和發(fā)酵
[0287]米曲霉菌株MT3568用于SEQ ID NO:1多核苷酸編碼的成熟過(guò)氧化酶的異源表達(dá)。
[0288]SEQ ID NO:1是從1951年保藏且源自美國(guó)的球毛殼CBS148.51 (得自荷蘭微生物菌種保藏中心)中分離的基因組核苷酸序列。
[0289]將包含SEQ ID NO:1的多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到米曲霉菌株MT3568中。在37°C孵育4~7天后，將四至八個(gè)轉(zhuǎn)化子的孢子接種到96深孔板的0.5ml DAP-4C-01培養(yǎng)基中。
[0290]在30°C培養(yǎng)4天后，培養(yǎng)液通過(guò)SDS-PAGE分析，來(lái)識(shí)別產(chǎn)生最大量的重組過(guò)氧化酶的轉(zhuǎn)化子，并將培養(yǎng)液在用于證實(shí)過(guò)氧化酶活性的檢定中進(jìn)行分析。
[0291]如上構(gòu)建的米曲霉轉(zhuǎn)化子在以150RPM旋轉(zhuǎn)的搖床孵育箱中，在孵育于30°C的500ml凹槽搖瓶中的150ml DAP-4C-01培養(yǎng)基中發(fā)酵5天，并進(jìn)一步用于下述的檢定。
[0292]實(shí)施例2
[0293]2，2’ -聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的氧化
[0294]過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化酶在過(guò)氧化氫的存在下氧化2，2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(也稱為ABTS)，且產(chǎn)生的綠色用分光光度法在405nm處定量(ε 405=36, βΟΟ?ν1。!]!-1)。
[0295]反應(yīng)混合物((λ 2ml)包含L OmM ABTS、緩沖液(50mM磷酸緩沖液pH7或50mMBritton-Robinson緩沖液ρΗ4)、20 μ I過(guò)氧化酶發(fā)酵上清液(參見(jiàn)實(shí)施例1)和0.5mM過(guò)氧化氫。
[0296]通過(guò)添加過(guò)氧化酶上清液到檢定中使用的其他組分而開(kāi)始反應(yīng)。應(yīng)用MolecularDevices的SpectraMax酶標(biāo)儀,在室溫下監(jiān)測(cè)96孔微孔板在405nm處的吸光度變化。包括不添加酶而制備的空白。[0297]記錄5分鐘的吸光度增加，且每分鐘吸光度(milli Abs)的變化的結(jié)果在表1中示出。
[0298]表1
[0299]
【權(quán)利要求】
1.一種具有過(guò)氧化酶活性的分離的多肽，選自: Ca)與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽； (b)由在中等嚴(yán)格條件、中到高等嚴(yán)格條件、高等嚴(yán)格條件或極高等嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)，(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物雜交的多核苷酸所編碼的多肽； (c)由與SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多核苷酸所編碼的多肽； Cd)在一個(gè)或多個(gè)位置包含替換、缺失和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的變體；以及 (e), (a)、(b)、(c)或(d)的多肽的具有過(guò)氧化酶活性的片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其包含SEQID NO:3或SEQ IDNO:4的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽，其與SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至 少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的多肽，其由在低等嚴(yán)格條件、低到中等嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件、中到高等嚴(yán)格條件、高等嚴(yán)格條件或極高等嚴(yán)格條件下與(i ) SEQ IDNO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)，(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)物雜交的多核苷酸所編碼。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的多肽，其由與SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一'I"生的多核苷酸所編碼。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的多肽，其包含SEQID N0:2或由SEQ ID NO:2組成，或者包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由SEQID NO:2的成熟多肽組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其中，所述成熟多肽是SEQIDNO: 2的氨基酸I至242。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的多肽，其是在一個(gè)或多個(gè)位置包含替換、缺失和/或插入的SEQ ID N0:2的成熟多肽的變體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其是SEQID N0:2的片段，其中，該片段具有過(guò)氧化酶活性。
10.一種組合物，其包含權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的多肽。
11.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的多肽。
12.一種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，其包含與一個(gè)或多個(gè)引導(dǎo)多肽在表達(dá)宿主中產(chǎn)生的控制序列可操作地連接的根據(jù)權(quán)利要求11所述的多核苷酸。
13.—種重組宿主細(xì)胞，其包含與一個(gè)或多個(gè)引導(dǎo)多肽產(chǎn)生的控制序列可操作地連接的根據(jù)權(quán)利要求11所述的多核苷酸。
14.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的多肽的方法，包括: Ca)在有益于生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)以其野生型生產(chǎn)所述多肽的細(xì)胞；以及 (b)回收所述多肽。
15.一種生產(chǎn)具有過(guò)氧化酶活性的多肽的方法，包括: (a)在有益于生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞；以及 (b)回收所述多肽。
16.一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其被編碼權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。
17.—種生產(chǎn)具有過(guò)氧化酶活性的多肽的方法，包括: Ca)在有益于生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；以及 (b)回收所述多肽。
18.—種洗滌劑組合物，其包含表面活性劑和權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的多肽。
19.一種用于在取代的或未取代的、直鏈的或支鏈的脂肪烴的任一端的2位或3位進(jìn)行羥化的方法，所述脂肪烴具有至少3個(gè)碳并具有附著至2位或3位碳的氫，所述方法包括使所述脂肪烴與過(guò)氧化氫以及權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的多肽接觸。
20.一種用于在脂質(zhì)的酰基的末端的2位或3位進(jìn)行羥化的方法，包括使所述脂質(zhì)與過(guò)氧化氫以及權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的多肽接觸。
21.一種用于在取代的或未取代的、直鏈的或支鏈的脂肪烴的至少兩端的第二個(gè)或第三個(gè)碳處引入羥基或酮基的方法，所述脂肪烴具有至少5個(gè)碳并具有至少一個(gè)附著至所述第二個(gè)或第三個(gè)碳的氫，所述方法包括使所述脂肪烴與過(guò)氧化氫以及權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的多肽接觸。
22.根據(jù)權(quán)利要求19~21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述脂肪烴是烷烴。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述烷烴是戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷或十六烷、或其異構(gòu)體。
24.根據(jù)權(quán)利要求19~23中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述脂肪烴是未取代的。
25.根據(jù)權(quán)利要求19~24中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述脂肪烴是直鏈的。
26.根據(jù)權(quán)利要求19~25中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述脂肪烴通過(guò)引入兩個(gè)羥基而轉(zhuǎn)化為二醇。
27.根據(jù)權(quán)利要求19~25中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述脂肪烴是脂肪酸。
28.一種用于生產(chǎn)聚氨酯的酶促方法，包括根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法將脂肪烴轉(zhuǎn)化為二醇，并使用所述二醇來(lái)生產(chǎn)聚氨酯。
29.根據(jù)權(quán)利要求26生產(chǎn)的二醇用于生產(chǎn)聚氨酯的用途。
【文檔編號(hào)】C12N9/00GK103748217SQ201280039133
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月10日
【發(fā)明者】S·蘭德維克, L·H·厄斯特高, L·卡盧 申請(qǐng)人:諾維信公司