專利名稱：通過pepc酶活性測(cè)定判斷鳳眼蓮單株干重的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)旺盛生長(zhǎng)期內(nèi)鳳眼蓮的單株干重檢測(cè)新方法及其應(yīng)用，尤其是引入PEPC酶活性測(cè)定技術(shù)判斷鳳眼蓮單株干重，用于對(duì)人工種養(yǎng)鳳眼蓮的生長(zhǎng)期進(jìn)行管理。
背景技術(shù)：
鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)屬維管束水生植物，俗稱水葫蘆，具有發(fā)達(dá)的根系、旺盛的生長(zhǎng)繁殖及超強(qiáng)的吸收能力。鳳眼蓮引入中國最早是用于飼料。但是，鳳眼蓮原產(chǎn)地巴西、阿根廷和秘魯?shù)葒?，一般分布于南?2. 3度和北緯32度之間的世界大部分地區(qū)，在25 35°C下生長(zhǎng)速度驚人，通常在8個(gè)月內(nèi)就能從10棵增至60萬棵，是公認(rèn)的生長(zhǎng)最快的植物之一。計(jì)算發(fā)現(xiàn)，只要條件允許，單株鳳眼蓮一年內(nèi)可以產(chǎn)生1.4億棵分株，可以鋪滿HOhm2的水面，鮮重可達(dá)^000t，可見其種群恢復(fù)和擴(kuò)散能力極強(qiáng)，為其利用的生態(tài)安全帶來了很高的風(fēng)險(xiǎn)。目前，我國南部17個(gè)省市都存在嚴(yán)重的鳳眼蓮泛濫問題，鳳眼蓮也成為世界十大害草之一。近年來也用于食用菌的培養(yǎng)基質(zhì)及沼氣發(fā)酵等，特別是在富營養(yǎng)化水體治理工程中被廣泛應(yīng)用胡長(zhǎng)偉，孫占東，李建龍，等.鳳眼蓮在城市重污染河道修復(fù)中的應(yīng)用[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2007，1(12) :P. 51-56 ；齊玉梅，高偉生.鳳眼蓮凈化水質(zhì)及其后處理工藝探討[J].環(huán)境科學(xué)進(jìn)展，1999，7( :P. 136-140，使其成為現(xiàn)代高效生態(tài)農(nóng)業(yè)的一種重要利用資源周文兵，譚良峰，劉大會(huì)，等.鳳眼蓮及其資源化利用研究進(jìn)展[J]，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，MG) :P. 423-428;盛婧，陳留根，朱普平，等.高養(yǎng)分富集植物鳳眼蓮的農(nóng)田利用研究[J]·中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，18(1) :P. 46-49，也為人們有效控制該物種提供了新出路。隨著鳳眼蓮人工種養(yǎng)地點(diǎn)的增加，栽培工作者發(fā)現(xiàn)不同地點(diǎn)種養(yǎng)的鳳眼蓮形態(tài)有差異，諸如葉片數(shù)目、株高和根長(zhǎng)等。雖然鳳眼蓮的生長(zhǎng)速度很快，但是生長(zhǎng)的方向則有不同，當(dāng)植株較小，并有開闊的空曠的水面時(shí)，其呈匍匐形水平生長(zhǎng)，等充滿了整個(gè)水面之后，則改為植株縱向生長(zhǎng)。當(dāng)鳳眼蓮生長(zhǎng)受到生長(zhǎng)環(huán)境限制時(shí)，植株則會(huì)脫落老的植株來優(yōu)先保證新生植株的營養(yǎng)供應(yīng)，如果不及時(shí)收獲而任由衰老的植株脫落在水里，則可能造成水體的兩次污染，因此，準(zhǔn)確地判定鳳眼蓮的最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，及時(shí)的采收， 則是鳳眼蓮在富營養(yǎng)化水域高效利用的最關(guān)鍵的問題。如何判定鳳眼蓮在不同地區(qū)的生長(zhǎng)狀況，確定適宜的收獲時(shí)期，也成為鳳眼蓮資源化高效利用技術(shù)在中國廣大富營養(yǎng)化水域地區(qū)推廣的關(guān)鍵問題。世界上鳳眼蓮屬有8種植物，但根據(jù)細(xì)胞學(xué)和分子遺傳學(xué)的研究結(jié)果，目前分布在我國的僅有來自南美州巴西的1種汪光熙，王徽勤.鳳眼蓮的核型研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1989，4 :Ρ· 131-132 ;REN M X，ZHANG Q G & ZHANG D Y. Random amplified polymorphic DNA markers reveal low genetic variation and a single dominant genotype in Eichhornia crassipes populations throughout China[J]. Weed Research, 2005,45 :P. 236-244，這表明鳳眼蓮屬植物在中國的分布與我國的生態(tài)條件有關(guān)。王桂榮和張春新研究了某些環(huán)境條件對(duì)鳳眼蓮生物生產(chǎn)力影響李學(xué)寶，何光源，吳振斌，等.鳳眼蓮、水花生若干光合作用參數(shù)與酶類的研究[J].水生生物學(xué)報(bào)，1995，19 (4) P. 333-336，并發(fā)現(xiàn)鳳眼蓮對(duì)低溫的適應(yīng)性比水花生(Alternanthera philoxeroides)差李學(xué)寶，何光源，吳振斌，等.鳳眼蓮、水花生若干光合作用參數(shù)與酶類的研究[J].水生生物學(xué)報(bào)，1995，19 (4) :P. 333-336。朱慧等從鳳眼蓮的入侵性和光合能力的角度表明，廣東地區(qū)的鳳眼蓮具有較高的光能利用力與較強(qiáng)的光合響應(yīng)機(jī)制，這是它比大藻具有更強(qiáng)入侵力的生理基礎(chǔ)朱慧，馬瑞君，2種水生入侵植物光合特征的比較[J]，西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，38(5) :P.193-198。已有研究表明，南京地區(qū)8月鳳眼蓮葉片的光合能力顯著高于水稻，并與玉米接近李霞，任承鋼，王滿，等。江蘇地區(qū)鳳眼蓮葉片光合作用對(duì)光強(qiáng)與溫度響應(yīng)[J]，江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，26 (5) :P. 943-947，這些研究都是鳳眼蓮對(duì)當(dāng)?shù)毓鉁刭Y源利用的表現(xiàn)，而且鳳眼蓮在高光強(qiáng)和高溫條件下具有高光效特性。王強(qiáng)等研究表明，兩優(yōu)培九較高的光能和CO2利用效率、較強(qiáng)的抗光抑制能力、以及較高的C4 途徑酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)的表達(dá)水平是其超高產(chǎn)的重要原因王強(qiáng)，盧從明，張其德，等.超高產(chǎn)雜交稻兩優(yōu)培九的光合作用、 光抑制和C4途徑酶特性[J],中國科學(xué)[C輯]，2002，32(6) :Ρ· 482-487。PEPC在C4植物中起濃縮CO2以提高光合效率的作用，尤其在C4型ρ印c光合基因?qū)隒3植物水稻，并高表達(dá)后，PEPC酶就成為一個(gè)重要的水稻高光效的篩選指標(biāo)，而備受植物生理學(xué)家和作物育種學(xué)家廣泛關(guān)注，已成為作物育種學(xué)家研究的熱點(diǎn)問題Ku MSB, Sakae A, Mika N, et al. High-level expression of maize phosphoenolpyruate carboxylase in transgenic rice plants [J], Nature Biotechnology, 1999,17 :P. 76 78 ；李霞等，PEPC 酶活性作為水稻高光效育種篩選指標(biāo)的研究，江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24 (5) :P. 559-564。我們的研究表明，鳳眼蓮是適合高光強(qiáng)和高溫條件的高光效的水生挺水植物。鳳眼蓮人工栽培工作者檢測(cè)其生長(zhǎng)狀況通常是參照水生植物干物質(zhì)累積的測(cè)定方法，定期測(cè)定植株的鮮重，通過烘箱烘干至恒重，測(cè)定植株的干重，最后確定其適宜的采收時(shí)期，該方法在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)小范圍的研究是適合的。但隨著鳳眼蓮的規(guī)?；B(yǎng)殖的范圍的不斷擴(kuò)大，而且由于鳳眼蓮的高生物量，水分含量很高，特別生長(zhǎng)旺盛的時(shí)期植株的葉體積很大，干重通常只占鮮重的十分之一，因此，由于鳳眼蓮的獨(dú)特生物學(xué)組成，勢(shì)必需要增加烘干稱重匹配的大體積烘箱等儀器設(shè)備以及較長(zhǎng)時(shí)間的烘干時(shí)間，再加上由于鳳眼蓮形態(tài)生長(zhǎng)的變化很大，客觀判定一個(gè)較大種養(yǎng)地區(qū)的生物量的累積也需要增加不同的取樣地點(diǎn)，因此檢測(cè)樣品的數(shù)量也大大增加，極大地增大了鳳眼蓮栽培工作者定量檢測(cè)鳳眼蓮生長(zhǎng)狀況的工作量。長(zhǎng)期以來，人們期盼能夠有一種更為方便簡(jiǎn)潔的檢測(cè)方法替代繁瑣復(fù)雜的定期測(cè)定植株的鮮重，通過烘箱烘干至恒重，測(cè)定單株干重的方法，用于鳳眼蓮的管理，確定最佳收割期。最近也有人將現(xiàn)代遙感技術(shù)用于對(duì)鳳眼蓮規(guī)?；N養(yǎng)的檢測(cè)中，但是遙感技術(shù)通常是通過植株葉片發(fā)射的光譜，比如綠色葉片來判定生長(zhǎng)的狀況，但是這種方法也只對(duì)鳳眼蓮的水平匍匐狀的生長(zhǎng)狀況的判定相對(duì)有利，而對(duì)鳳眼蓮在水面充滿后的縱向生長(zhǎng)則無法判定，而且這種方法還需要大型的儀器設(shè)備，而且借助衛(wèi)星等的相關(guān)資料，不僅成本高， 而且需要專門的人員操作，應(yīng)用起來有一定困難。
鑒于目前使用的鳳眼蓮生長(zhǎng)檢測(cè)的技術(shù)和手段的不足，在一定程度上限制了鳳眼蓮在中國廣大富營養(yǎng)化水域資源化利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前對(duì)鳳眼蓮檢測(cè)的技術(shù)和手段存在的耗時(shí)長(zhǎng)和工作量大等不足，給，提供鳳眼蓮生長(zhǎng)期管理帶來的不便，提供一種通過PEPC酶活性測(cè)定判斷鳳眼蓮單株干重的方法及其在鳳眼蓮生長(zhǎng)期管理中的應(yīng)用。我們的研究表明，水稻生育后期是決定水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵時(shí)期，開花后光合作用的 70%都用于形成產(chǎn)量，其中劍葉的光合作用占整個(gè)葉片光合作用的50%以上，與水稻植株的地上和地下部分的生理表現(xiàn)有著密不可分的關(guān)系。研究進(jìn)一步看出，水稻葉片的PEPC 酶活性與凈光合速率有很好的相關(guān)性，特別在產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時(shí)期-孕穗期早期(開花后 5-10天之間)上午10 00-12:00之間，外源PEPC基因水稻高水平表達(dá)與凈光合速率的高值出現(xiàn)期表現(xiàn)一致，而且相對(duì)穩(wěn)定，確定劍葉PEPC活性可作為水稻高光合速率的可靠分子育種指標(biāo)。我們?cè)谘芯坎煌貐^(qū)鳳眼蓮的光合特性的研究發(fā)現(xiàn)，在不同生態(tài)地區(qū)生長(zhǎng)的鳳眼蓮的高生物量的生理基礎(chǔ)在于其具有高光合特性特性，而且單株干重的累積與葉片的PEPC 酶活性的表現(xiàn)有一致關(guān)系，據(jù)此確定了本發(fā)明利用在同一生態(tài)地區(qū)自然光溫條件下，重點(diǎn)在鳳眼蓮關(guān)鍵的生長(zhǎng)時(shí)期，分別對(duì)其不同生長(zhǎng)時(shí)期的功能葉片PEPC酶活性進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)， 同時(shí)對(duì)功能葉片的最大凈光合速率和單株干重等進(jìn)行平行測(cè)定的技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)，通過在同一生態(tài)環(huán)境下，不同時(shí)期形態(tài)和生理指標(biāo)的測(cè)定和數(shù)據(jù)分析，研究PEPC酶活性與高光合速率以及干物質(zhì)累積的關(guān)系，以確定PEPC酶活性作為鳳眼蓮高生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定條件， 這對(duì)于篩選和檢測(cè)鳳眼蓮等高生物量的生長(zhǎng)狀況具有重要意義，并將對(duì)建立高通量高效鳳眼蓮高生物量高光效種質(zhì)的篩選技術(shù)體系都有重要作用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種通過PEPC酶活性測(cè)定判斷鳳眼蓮單株干重的方法，其特征在于，通過測(cè)定種養(yǎng)期內(nèi)鳳眼蓮功能葉片的PEPC酶活性來判斷其單株干重； 所述的鳳眼蓮功能葉片材料是指除去鳳眼蓮的心葉和最后一片衰老葉片后的其他葉片。在本發(fā)明中對(duì)種養(yǎng)期內(nèi)鳳眼蓮的功能葉片的PEPC酶活性測(cè)定包括a)稱取0. 2g待測(cè)鳳眼蓮的功能葉片材料放入預(yù)冷的研缽，加入pH7. 8的粗酶提取緩沖液50mM/L Tris-HCl,5mM/L 二硫蘇糖醇，ImM/L氯化鎂，2%聚乙烯吡咯烷酮，研磨，經(jīng) 4層紗布過濾，過濾的研磨液收集離心管，在4°C，12000rpm下，離心20min，取上清液，即為粗酶液；b)葉綠素含量測(cè)定取40ul粗酶液加到960 μ 1無水乙醇中，分別在649nm、663nm 和665nm下測(cè)定光吸收值，總?cè)~綠素含量Chl =葉綠素a含量+葉綠素b含量；葉綠素 a(mg/L) = 12. 7XA665-2. 59XA649 ；葉綠素 b (mg/L) = 22. 9 X A649-4. 67 X A663 ；式中A665是指OD值在665nm測(cè)定的吸光值，A649是指OD值在649nm下測(cè)定的吸光值，A663是指OD值在663nm下測(cè)定的吸光值；c) NADH吸光度變化反應(yīng)體系中加入pH8. 0的50mmol Hepes-KHO,以及IOmmol碳酸氫鈉，5mmol氯化鎂，0. 2mmol NADH-Na2, 50 μ 1粗酶液，1. 5u蘋果酸脫氫酶，用蒸餾水定容到1ml，混勻后加入5mmolPEP，在紫外分光光度計(jì)上記錄90s內(nèi)每15s記錄1次340nm的光密度的下降數(shù)值，d) PEPC 酶的活性(ymol/mg. chl. h) = Δ 0D340 X IO3/[6. 3 X Chl X (反應(yīng)體系量 /粗酶液體量)X反應(yīng)時(shí)間)]。在本發(fā)明中待測(cè)鳳眼蓮的功能葉片材料源于取樣點(diǎn)，取樣點(diǎn)分布在被測(cè)種養(yǎng)區(qū)域中的取樣區(qū)域內(nèi)，取樣區(qū)域不小于6m2。在本發(fā)明中單株干重與功能葉片的PEPC酶活性呈正相關(guān)，它們之間的決定系數(shù)為 r2 = 0. 8894**，r2 = 0. 036，相關(guān)系數(shù)為 r = 0. 943***，r = 0. 190。
一種上述方法的應(yīng)用，其特征在于通過對(duì)旺盛生長(zhǎng)期鳳眼蓮的功能葉片的PEPC 酶活性的測(cè)定獲得的單株干重，確定鳳眼蓮規(guī)模化人工種養(yǎng)期收獲的鑒定指標(biāo)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，在判斷旺盛生長(zhǎng)期鳳眼蓮的單株干重時(shí)，利用成熟的PEPC酶活性檢測(cè)技術(shù)，相對(duì)于傳統(tǒng)的鳳眼蓮單株干重檢測(cè)方法，不僅取樣少，而且耗時(shí)短，大大減少了檢測(cè)的工作量。將PEPC酶的活性檢測(cè)技術(shù)用于規(guī)?；斯しN養(yǎng)旺盛期的鳳眼蓮進(jìn)行管理，可以大大提高工作效率。


圖1是2009年南京地區(qū)種養(yǎng)的鳳眼蓮功能葉片生長(zhǎng)期內(nèi)的Pmax的變化；圖2是2009年南京地區(qū)種養(yǎng)的鳳眼蓮功能葉片生長(zhǎng)期內(nèi)的PEPC酶活性的變化；圖3是2009年南京地區(qū)種養(yǎng)的鳳眼蓮生長(zhǎng)期內(nèi)單株干重的變化；圖4是2009鳳眼蓮材料單株干重與PEPC酶的活性的相關(guān)性；圖5是2009鳳眼蓮材料單株干重與最大凈光合速率Pmax的相關(guān)性；圖6是2009鳳眼蓮材料PEPC酶的活性與最大凈光合速率Pmax的相關(guān)性；圖7是2010年南京地區(qū)7月 9月種養(yǎng)的鳳眼蓮生長(zhǎng)期內(nèi)單株干重、葉片PEPC 酶活性和最大凈光合速率的變化
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1鳳眼蓮材料的種養(yǎng)鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)，屬雨久花科鳳眼蓮屬，是一種浮生于水面的水生植物。在自然條件下，大部分不結(jié)實(shí)，主要靠分株繁殖，葉腋有腋芽，能抽出匍匐枝，其頂端長(zhǎng)出莖，葉和根系，成為新株。本試驗(yàn)江蘇南京(試驗(yàn)區(qū)水體總氮為3. 82mg · L—1，總磷為 0. 09mg · L—1，水溫為26-30°C )的鳳眼蓮人工種養(yǎng)實(shí)驗(yàn)地進(jìn)行。鳳眼蓮在2009年5月1日的初始放養(yǎng)量為每平方米2kg。采用毛竹圍欄小區(qū)試驗(yàn)，小區(qū)面積為6m2。生長(zhǎng)2個(gè)月后，于 7月，選取單枝、葉片數(shù)為9士3個(gè)，白色須根10個(gè)的綠色健壯植株，在不同生長(zhǎng)期中進(jìn)行植株形態(tài)和光合生理生態(tài)指標(biāo)的測(cè)定。實(shí)施例2鳳眼蓮葉片測(cè)定時(shí)間的選擇鳳眼蓮的不同生長(zhǎng)期中每隔30天分別取鳳眼蓮功能葉片(去除心葉和最后一個(gè)衰老葉片)，并上午10:00-12:00取鳳眼蓮葉片，每測(cè)定點(diǎn)取10個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定3次，分別進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。實(shí)施例3鳳眼蓮葉片最大凈光合速率(Pmax)測(cè)定的變化采用美國LI-COR公司生產(chǎn)的LI-6400便攜式光合測(cè)定儀，為開放系統(tǒng)，使用紅藍(lán)光源測(cè)定，光量子通量密度(PPFD)為1600 μ mol/m2. s,流速設(shè)為500 μ mol/s,室外5月 11月自然條件測(cè)定條件為晴天上午10:00 12:00的自然平均氣溫為(23 35°C )°C，相對(duì)濕度為 67% 79%，光強(qiáng)為 1800士50 μ mol/m2 · s, CO2 濃度為 390. 0士 10. 5 μ mol/mol， 分別測(cè)定了不同葉位葉片的Pmax。從圖1可以看出，從開始放養(yǎng)的5月份到最后收獲的11 月份鳳眼蓮Pmax的變化呈現(xiàn)單峰變化趨勢(shì)，其中7月 9月是Pmax最大的三個(gè)月。實(shí)施例4鳳眼蓮葉片PEPC酶活性測(cè)定的年變化根據(jù)Gonzalez等人(1984)的方法。主要步驟如下，取將稱取0. 2g不同生長(zhǎng)月份的待測(cè)鳳眼蓮的功能葉片材料放入預(yù)冷的研缽，加入粗酶提取緩沖液50mM/L Tris-HCl (pH7. 8)，5mM/L 二硫蘇糖醇，ImM/L氯化鎂，2%聚乙烯吡咯烷酮，研磨，經(jīng)4層紗布過濾，過濾的研磨液收集離心管，在4°C，12000rpm下，離心20min，取上清液，即為粗酶液。葉綠素含量測(cè)定取40 μ 1粗酶液加到960 μ 1無水乙醇中，分別在649nm、663nm 和665nm下測(cè)定光吸收值，總?cè)~綠素含量(Chl)=葉綠素a含量+葉綠素b含量葉綠素 a(mg/L) = 12. 7XA665-2. 59XA649葉綠素 b (mg/L) = 22. 9 X A649-4. 67 X A663式中A665是指OD值在665nm測(cè)定的吸光值；A649是指OD值在649nm下測(cè)定的吸光值；A663是指OD值在663nm下測(cè)定的吸光值。NADH吸光度變化反應(yīng)體系中加入50mmol Hepes-KHO (pH8. 0)，IOmmol碳酸氫鈉， 5mmol氯化鎂，0. 2mmol NADH-Na2 (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸鈉鹽)，50 μ 1粗酶液，1. 5u蘋果酸脫氫酶，用蒸餾水定容到Iml，混勻后加入5mmolPEP (磷酸烯醇式丙酮酸)，在紫外分光光度計(jì)上記錄90s內(nèi)340nm下光密度的下降(每1 記錄1次數(shù)值)PEPC 酶的活性(ymol/mg. chl. h) = Δ 0D340 X IO3/[6. 3 X Chl X (反應(yīng)體系量 / 粗酶液體量)X反應(yīng)時(shí)間)]。從圖2可以看出，從開始放養(yǎng)的5月份到最后收獲的11月份鳳眼蓮功能葉片PEPC 酶活性的變化也呈現(xiàn)單峰變化趨勢(shì)，其中8月-10月是酶活性最大的三個(gè)月。實(shí)施例5鳳眼蓮單位面積干重生物量測(cè)定的年變化參照李衛(wèi)國和王建波[14]的方法[李衛(wèi)國，王建波，光照和氮素對(duì)外來植物鳳眼蓮生長(zhǎng)和生理特性的影響.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版)，2007，53 (4) :457-462]，植株培養(yǎng)的不同天數(shù)，每隔30天后收獲，從每一地點(diǎn)取出10個(gè)植物個(gè)體；水洗后，用濾紙吸干水分，于 85°C下烘箱中烘干24h至恒重后，用感量為0. OOOlg的電子天平稱量干重，取平均值。從圖3可以看出，從開始放養(yǎng)的5月份到最后收獲的11月份鳳眼蓮單株干重的變化也呈現(xiàn)單峰變化趨勢(shì)，其中9月-11月是酶活性最大的三個(gè)月。實(shí)施例6
2009年鳳眼 蓮生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果的分析結(jié)合上述的研究結(jié)果，進(jìn)一步將不同月份鳳眼蓮功能葉片的PEPC酶活性、功能葉片的最大凈光合速率以及不同種養(yǎng)取樣點(diǎn)單位面積內(nèi)單株干重進(jìn)行相關(guān)分析，從見圖4，5， 6看出，單株干重分別與功能葉片的PEPC酶活性以及最大凈光合速率呈正相關(guān)，決定系數(shù)分別為 r2 = 0. 8894**，r2 = 0. 036，相關(guān)系數(shù)為 r = 0. 943***，r = 0. 190，PEPC 酶活性與最大凈光合速率也呈正相關(guān)，決定系數(shù)分別為r2 = 0. 1677，相關(guān)系數(shù)為r = 0. 410，其中放養(yǎng)時(shí)期單株干重分別與功能葉片的PEPC酶活性呈極顯著正相關(guān)，進(jìn)一步分析，種養(yǎng)的旺盛的7月-9月的光合參數(shù)的相關(guān)性，單株干重分別與功能葉片的PEPC酶活性以及最大凈光合速率呈極顯著正相關(guān)，決定系數(shù)分別為r2 = 0. 935**，r2 = 0. 786**，相關(guān)系數(shù)為r = 0. 967***，r = 0. 887**，PEPC酶活性與最大凈光合速率也呈極顯著正相關(guān)，決定系數(shù)分別為r2 = 0. 1677,相關(guān)系數(shù)為r = 0. 0. 744#，可見，測(cè)定鳳眼蓮?fù)⑸L(zhǎng)期7月-9月功能葉片的PEPC活性，可替代不同時(shí)期單株干重的測(cè)定，作為鳳眼蓮生物量累積的可靠生理指標(biāo)。實(shí)施例7通過PEPC酶活性測(cè)定判斷鳳眼蓮單株干重的方法的應(yīng)用在2009年獲得試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，于2010年在江蘇南京的鳳眼蓮人工種養(yǎng)實(shí)驗(yàn)地進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用的試驗(yàn)。在2010年6月1日，鳳眼蓮的初始放養(yǎng)量為每平方米2kg，采用毛竹圍欄小區(qū)試驗(yàn)，小區(qū)面積為6m2。分別于7月、8月和9月，選取單枝、葉片數(shù)為9士3個(gè)， 白色須根10個(gè)的綠色健壯植株，進(jìn)行植株單株干重和最大凈光合速率的測(cè)定，并選取葉片倒2葉，測(cè)定葉片的PEPC酶活性，從圖7可見，在9月時(shí)，鳳眼蓮葉片的PEPC酶活性最高， 其植株的單株干重也最大，最大的凈光合速率也最高，而且，在水體養(yǎng)分的初始濃度為TN 5. 17mg ·Γ\ΤΡ 0. 36mg ·ΙΛΚ 10. 67mg .Γ1條件下，鳳眼蓮植株在種養(yǎng)60d，含Ν、Ρ、Κ量分別達(dá) 4. 5%,0. 7%,8. 0%，60d 水葫蘆 Ν、Ρ、Κ 吸收總量分別達(dá) 57. 57,8. 95 和 111. 14g ·πΓ2， 并根據(jù)鳳眼蓮葉片的PEPC酶活性的變化判斷其干重，確定鳳眼蓮的最佳收獲的時(shí)間，使試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)水體的Ν、Ρ、Κ的清除率分別為75%、71%和86%，可見，即使在鳳眼蓮生長(zhǎng)的最旺盛時(shí)期，也對(duì)水體具有很好的清除效果。
權(quán)利要求
1.一種通過PEPC酶活性測(cè)定判斷鳳眼蓮單株干重的方法，其特征在于，通過測(cè)定鳳眼蓮?fù)⑸L(zhǎng)期內(nèi)功能葉片的PEPC酶活性來判斷其單株干重；所述的鳳眼蓮?fù)⑸L(zhǎng)期是指每年的7 9月期間；所述的鳳眼蓮功能葉片材料是指除去鳳眼蓮的心葉和最后一片衰老葉片后的其他葉片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過PEPC酶活性測(cè)定判斷鳳眼蓮單株干重的方法，其特征在于對(duì)旺盛生長(zhǎng)期內(nèi)鳳眼蓮的功能葉片的PEPC酶活性測(cè)定包括a)稱取0.2g待測(cè)鳳眼蓮的功能葉片材料放入預(yù)冷的研缽，加入pH7. 8的粗酶提取緩沖液50mM/L Tris-HCl,5mM/L 二硫蘇糖醇，ImM/L氯化鎂，2%聚乙烯吡咯烷酮，研磨，經(jīng)4層紗布過濾，過濾的研磨液收集離心管，在4°C，12000rpm下，離心20min，取上清液，即為粗酶液；b)葉綠素含量測(cè)定粗酶液取40ul加到960ul無水乙醇中，分別在649nm、663nm和 665nm下測(cè)定光吸收值，總?cè)~綠素含量Chl =葉綠素a含量+葉綠素b含量；葉綠素 a = 12. 7XA665-2. 59XA649 ；葉綠素 b = 22. 9XA649-4. 67XA663 ；式中A665是指OD值在665nm測(cè)定的吸光值，A649是指OD值在649nm下測(cè)定的吸光值，A663是指OD值在663nm下測(cè)定的吸光值；c)NADH吸光度變化反應(yīng)體系中加入pH8.0的50mmol Hepes-KHO,以及IOmmol碳酸氫鈉，5mmol氯化鎂，0. 2mmol NADH-Na2, 50ul粗酶液，1. 5u蘋果酸脫氫酶，用蒸餾水定容到 lml，混勻后加入5mmolPEP，在紫外分光光度計(jì)上記錄90s內(nèi)每1 記錄1次340nm的光密度的下降數(shù)值，d)PEPC酶的活性=A0D340X 103/T6. 3\011\(反應(yīng)體系量/粗酶液體量)\反應(yīng)時(shí)間)]。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過PEPC酶活性測(cè)定判斷鳳眼蓮單株干重的方法，其特征在于待測(cè)鳳眼蓮的功能葉片材料源于取樣點(diǎn)，取樣點(diǎn)分布在被測(cè)種養(yǎng)區(qū)域中的取樣區(qū)域內(nèi)， 取樣區(qū)域不小于6m2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的通過PEPC酶活性測(cè)定判斷鳳眼蓮單株干重的方法， 其特征在于單株干重與功能葉片的PEPC酶活性呈正相關(guān)，它們之間的決定系數(shù)為r2 = 0. 8894**，r2 = 0. 036，相關(guān)系數(shù)為 r = 0. 943***，r = 0. 190。
5.一種如權(quán)利要求4所述方法的應(yīng)用，其特征在于在鳳眼蓮?fù)⑸L(zhǎng)內(nèi)，通過對(duì)鳳眼蓮的功能葉片的PEPC酶活性的測(cè)定獲得的單株干重，確定鳳眼蓮規(guī)模化人工種養(yǎng)期收獲的鑒定指標(biāo)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過PEPC酶活性測(cè)定判斷鳳眼蓮單株干重的方法及其應(yīng)用，其特征在于，通過測(cè)定鳳眼蓮?fù)⑸L(zhǎng)期內(nèi)功能葉片的PEPC酶活性來判斷其單株干重；所述的鳳眼蓮?fù)⑸L(zhǎng)期是指每年的7～9月期間；所述的鳳眼蓮功能葉片材料是指除去鳳眼蓮的心葉和最后一片衰老葉片后的其他葉片。在鳳眼蓮?fù)⑸L(zhǎng)內(nèi)，通過對(duì)鳳眼蓮的功能葉片的PEPC酶活性的測(cè)定獲得的單株干重，確定鳳眼蓮規(guī)模化人工種養(yǎng)期收獲的鑒定指標(biāo)。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102353635SQ201110160189
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月15日
發(fā)明者叢偉, 李霞 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院