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一種土壤抑菌活性的測定方法及其應用的制作方法

文檔序號:471532閱讀:280來源:國知局
一種土壤抑菌活性的測定方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種土壤抑菌活性的測定方法及其應用,該方法的步驟為,取一定量的土壤浸出液,接種某一土壤病原菌,在移液槍槍頭中進行微培養(yǎng),通過對病原菌的生長量測定,來測定土壤的抑菌活性,實現(xiàn)了從宏觀上量化土壤的抑菌能力。同時,采用該測定方法,可以用來測定施用了土壤添加劑的土壤的抑菌活性,以篩選土壤抑菌活性高的土壤添加劑。
【專利說明】一種土壤抑菌活性的測定方法及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種土壤抑菌活性的測定方法,及其在篩選土壤添加劑中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]自然界中廣泛的存在抑菌型土壤(抑病型土壤),一般認為病原菌不能在這些土壤中定殖,或者能定殖但危害很小或沒有危害。抑菌型土壤一般可以分為普通抑菌土壤和特異抑菌土壤,普通抑菌土壤一般不具有轉(zhuǎn)移性,但特異抑菌土壤具有轉(zhuǎn)移性,可以通過一定的農(nóng)業(yè)措施來進行培育,然而對于土壤抑菌活性的宏觀量化卻一直缺少合適的方法。
[0003]土壤中微生物的代謝產(chǎn)物要作用于植物,首先這些物質(zhì)要溶于植物根際土壤的水中,因此土壤浸出液的抑菌活性能反應土壤本身的抑菌活性,所以測定土壤浸出液的抑菌活性,能從宏觀上量化土壤的抑菌能力。植物土傳病害主要為真菌病害,所以土壤浸出液對植物真菌病害的抑制能力可以在一定程度上用于表征土壤的抑菌活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供了一種土壤抑菌活性的測定方法
[0005]為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種土壤抑菌活性的測定方法,其特征在于,取一定量的土壤浸出液,接種某一土壤病原菌,在移液槍槍頭中進行微培養(yǎng),通過對病原菌的生長量測定,來測定土壤的抑菌活性。
[0006]所述測定方法具體包括以下步驟:
[0007](I) 土壤浸出液的收集:將待測定土壤中加入去離子水;靜置過夜;收集土壤的浸出的液體,離心,取上清液,用微孔濾膜進行上清液的過濾除菌處理,收集無菌的土壤浸出液,備用;
[0008](2) 土壤病原菌的接種、培養(yǎng):將稱重后的空槍頭進行滅菌,將土壤浸出液加入空槍頭中,槍頭下端先用parafilm膜包裹以防漏液,將槍頭放入玻璃試管中,加入培養(yǎng)液,病原菌液,槍頭上端蓋上無菌塑料蓋,將試管放置在泡沫箱中進行保濕培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為28°C,培養(yǎng)時間為4到6d ;培養(yǎng)后期用針刺穿parafilm膜,將槍頭進行離心,去除液體,菌絲體仍保留在槍頭中,去除槍頭下端的parafi Im膜后,對槍頭進行稱重;
[0009](3)重復步驟(2),將土壤浸出液替換為無菌水,作為對照組;
[0010](4)菌絲體重量的計算:根據(jù)步驟(2)稱量出的培養(yǎng)前空槍頭的重量與培養(yǎng)后槍頭的重量,做差,得出培養(yǎng)組菌絲體重量W2 ;
[0011]根據(jù)步驟(3)稱量出的培養(yǎng)前空槍頭的重量與培養(yǎng)后槍頭的重量,做差,得出對照組菌絲體重量Wl ;
[0012](5) 土壤抑菌活性的計算:
[0013]Iw= (W1-W2)/ffl*100% ;
[0014]其中:Iw為土壤抑菌活性。 [0015]進一步的,所述步驟(1)中將60份土壤分裝到三個花盆中,分別向每個花盆中加Λ 3份去離子水,靜置后,將三個花盆中的浸出液體混合,離心,取上清液,過濾除菌,收集無菌的土壤浸出液。
[0016]其中,靜置時間為12小時,離心速度為lOOOOrpm。
[0017]所述步驟(2)中的培養(yǎng)液為真菌培養(yǎng)液,所述病原菌液為病原真菌孢子液。優(yōu)選的,所述真菌培養(yǎng)液為GY培養(yǎng)液。
[0018]所述步驟(2)中土壤浸出液、培養(yǎng)液、病原真菌孢子液的體積比為7:1:0.05,所述步驟(2)中槍頭的離心速度為lOOOrpm,離心時間為40s。
[0019]優(yōu)選的,所述病原真菌孢子液為寄生曲霉孢子懸液。
[0020]本發(fā)明的另一目的在于,提供一種土壤抑菌活性的測定方法在篩選土壤添加劑中的應用。
[0021]采用的技術(shù)方案是:利用上述土壤抑菌活性的測定方法,測定施用了土壤添加劑的土壤的抑菌活性,以篩選土壤抑菌活性高的土壤添加劑。
[0022]進一步的,包括如下步驟:
[0023]( I)對施用土壤添加劑A的土壤,利用所述土壤抑菌活性的測定方法,測定其土壤抑菌活性Iwa ;
[0024](2)對未施用任何土壤添加劑的土壤,利用如權(quán)利要求1所述的測定方法,測定其土壤抑菌活性Iwtl ;
[0025](3)當Iwa高于Iwtl時,說明土壤添加劑A能特異性的增加土壤的抑菌活性。
[0026]本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是:本發(fā)明的測定方法,利用Tip-culture微培養(yǎng)法,定量檢測出土壤浸出液的抑菌活性,實現(xiàn)了從宏觀上量化土壤的抑菌能力,既能對各種抑菌土壤進行判定,同時利用本測定方法,能精確的判斷出土壤添加劑對土壤抑菌能力的增強作用。
【具體實施方式】
[0027]實施例1
[0028]選取兩種土壤添加劑:土壤添加劑A、土壤添加劑B。將這兩種土壤添加劑施用于土壤,形成土壤添加劑A組、土壤添加劑B組,將未施用任何土壤添加劑的土壤作為對照組;試驗在盆栽的條件下進行,三組土壤分別在施用30天、60天、90天后進行抑菌活性檢測,以寄生曲霉孢子液為病原真菌接種液。
[0029]1.土壤抑菌活性的檢測;
[0030]分別對三組土壤的三個時間段的土壤進行如下步驟的處理:
[0031]1.1 土壤浸出液的收集:
[0032]將6kg待測定土壤分裝到三個帶托盤的花盆中;向各花盆中澆300mL ;靜止放置12h后,收集三個托盤中的浸出液,混合;對浸出液進行離心,離心速度為:10000rpm。取上清并用微孔濾膜對離心后的上清進行過濾除菌處理,收集過濾后的無菌的土壤浸出液,備用。
[0033]1.2 土壤病原菌的接種、培養(yǎng):
[0034]首先將700 μ L過濾后的土壤浸出液加入稱好重量的無菌5mL空槍頭中,槍頭下端事先用parafilm膜包裹以防止漏液,將槍頭放入試管架上的玻璃試管中;加入100 μ L GY培養(yǎng)液(GY培養(yǎng)液為普通的葡萄糖、酵母培養(yǎng)液,由20g/L葡萄糖溶液加5g/L酵母粉組成);加入5μ L的寄生曲霉孢子懸液,槍頭上端蓋上無菌的塑料蓋;將試管架放置在底部鋪有濕紗布的泡沫箱中進行保濕培養(yǎng);培養(yǎng)溫度為28°C,培養(yǎng)時間為4到6d ;培養(yǎng)到期后用針刺穿parafilm膜,并在1000rpm條件下離心40s去掉培養(yǎng)槍頭中的液體,此時菌絲體保留在槍頭中;然后用鑷子去掉槍頭下端的parafilm膜,并對槍頭進行稱重。
[0035]1.3重復步驟(2),將土壤浸出液替換為無菌水,作為對照組;
[0036]1.4菌絲體重量的計算:根據(jù)步驟(2)稱量出的培養(yǎng)前空槍頭的重量與培養(yǎng)后槍頭的重量,做差,得出培養(yǎng)組菌絲體重量W2 ;
[0037]根據(jù)步驟(3)稱量出的培養(yǎng)前空槍頭的重量與培養(yǎng)后槍頭的重量,做差,得出對照組菌絲體重量Wl ;
[0038]1.5 土壤抑菌活性的計算:
[0039]Iw= (W1-W2)/Wl*100%。
[0040]2.實驗結(jié)果
[0041]以寄生曲霉孢子純培養(yǎng)為對照進行數(shù)據(jù)處理,試驗結(jié)果如下表:
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種土壤抑菌活性的測定方法,其特征在于,取一定量的土壤浸出液,接種某一土壤病原菌,在移液槍槍頭中進行微培養(yǎng),通過對病原菌的生長量測定,來測定土壤的抑菌活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法,其特征在于:所述測定方法具體包括以下步驟: (1)土壤浸出液的收集:將待測定土壤中加入去離子水,靜置過夜;收集土壤的浸出的液體,離心,取上清液,用微孔濾膜進行上清液的過濾除菌處理,收集無菌的土壤浸出液,備用; (2)土壤病原菌的接種、培養(yǎng):將稱重后的空槍頭進行滅菌,將土壤浸出液加入空槍頭中,槍頭下端先用parafilm膜包裹以防漏液,將槍頭放入玻璃試管中,加入培養(yǎng)液,病原菌液,槍頭上端蓋上無菌塑料蓋,將試管放置在泡沫箱中進行保濕培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為28°C,培養(yǎng)時間為4到6d ;培養(yǎng)后期用針刺穿parafilm膜,將槍頭進行離心,去除液體,菌絲體仍保留在槍頭中,去除槍頭下端的paraf i Im膜后,對槍頭進行稱重; (3)重復步驟(2),將土壤浸出液替換為無菌水,作為對照組; (4)菌絲體重量的計算:根據(jù)步驟(2)稱量出的培養(yǎng)前空槍頭的重量與培養(yǎng)后槍頭的重量,做差,得出培養(yǎng)組菌絲體重量W2 ; 根據(jù)步驟(3)稱量出的培養(yǎng)前空槍頭的重量與培養(yǎng)后槍頭的重量,做差,得出對照組菌絲體重量Wl ; (5)土壤抑菌活性的計算:
Iw= (W1-W2) /ffl*100% ; 其中:Iw為土壤抑菌活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定方法,其特征在于:所述步驟(1)中將60份土壤分裝到三個花盆中,分別向每個花盆中加入3份去離子水,靜置后,將三個花盆中的浸出液體混合,離心,取上清液,過濾除菌,收集無菌的土壤浸出液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定方法,其特征在于:靜置時間為12小時,離心速度為1000Orpm0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定方法,其特征在于:所述步驟(2)中的培養(yǎng)液為真菌培養(yǎng)液,所述病原菌液為病原真菌孢子液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測定方法,其特征在于:所述真菌培養(yǎng)液為GY培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測定方法,其特征在于:所述步驟(2)中土壤浸出液、培養(yǎng)液、病原真菌孢子液的體積比為7:1:0.05,所述步驟(2)中槍頭的離心速度為lOOOrpm,離心時間為40s。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測定方法,其特征在于:所述病原真菌孢子液為寄生曲霉孢子懸液。
9.一種如權(quán)利要求1所述的測定方法的應用,其特征在于:利用所述測定方法,測定施用了土壤添加劑的土壤的抑菌活性,以篩選土壤抑菌活性高的土壤添加劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用,其特征在于,包括如下步驟: (1)對施用土壤添加劑A的土壤,利用如權(quán)利要求1所述的測定方法,測定其土壤抑菌活性Iwa ; (2)對未施用任何土壤添加劑的土壤,利用如權(quán)利要求1所述的測定方法,測定其土壤抑菌活性Iwtl ;(3)當Iwa高 于Iwtl時,說明土壤添加劑A能特異性的增加土壤的抑菌活性。
【文檔編號】C12Q1/18GK103789398SQ201410088337
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】肖偉, 龔娜, 陳珣, 王娜, 歐陽欣嵐, 費小丹, 吳燕, 劉國麗, 法伊茲.穆罕默德, 穆罕默德.阿斯拉姆.布茲達 申請人:肖偉
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