專利名稱：一種具有蛋白酶活性的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種DNA構(gòu)建體-它編碼一種具有蛋白酶活性的酶、一種生產(chǎn)此酶的方法、一種具有蛋白酶活性的酶以及一種含有此酶的酶制品。
蛋白酶是能夠分解肽鍵的酶。發(fā)現(xiàn)酸性蛋白酶(即具有酸性最適pH的蛋白酶)由包括哺乳動物和微生物的許多不同生物體產(chǎn)生。例如，發(fā)現(xiàn)微生物酸性蛋白酶由細(xì)菌菌株，如芽孢桿菌屬之種(Bacillus sp.)菌株(JP 01240184)，真菌菌株，如根霉屬之種(Rhizopus sp.)(EP 72978)、Schytalidium SP.(JP 48091273)、Sulpholobus sp.和Thermoplasma sp.(WO/90 10072)以及曲霉屬之種(Aspergillus sp.)(JP 50121486、EP 82 395)產(chǎn)生。
JP 305879公開了一種編碼來自雪白根霉(R.niveus)的一種酸性蛋白酶的基因克隆及其重組表達(dá)。來自Cryphonectiraparasitica編碼一種天冬氨酸蛋白酶的一種基因的克隆和表達(dá)被Choi等(1993)、Takahashi等(1991)、Inoue等(1991)描述過。而JP 407 5586公開了來自黑曲霉(Aspergillus niger)的編碼一種酸性蛋白酶(蛋白酶A)的基因克隆。
Berka等(1990)公開了編碼來自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的天冬氨酸蛋白酶曲霉菌素胃蛋白酶A的基因。編碼來自米曲霉(Aspergillus oryzae)的天冬氨酸蛋白酶曲霉菌素胃蛋白酶O的基因克隆被Berka等(1993)描述過。編碼來自米曲霉的酸性蛋白酶(PEPA)的基因克隆被Gomi等(1993)公開了。酸性蛋白酶在工業(yè)上被廣泛地應(yīng)用，例如用于制備食品和飼料、制革工業(yè)(如給皮革除毛)、蛋白水解物生產(chǎn)、以及釀酒工業(yè)。
在許多不同的應(yīng)用上，尤其在食品和飼料工業(yè)中，需要單一成份的酸性蛋白酶。
本發(fā)明的目的是制備單一成份的蛋白酶。
因此，首先本發(fā)明是有關(guān)于編碼具有蛋白酶活性的酶的DNA序列的DNA構(gòu)建體，這段DNA序列含有顯示于SEQ ID No.1中的DNA序列或者含有與此序列(SEQ ID No..1)至少有80％同源性的類似序稱。
其次，本發(fā)明是關(guān)于含有編碼具有蛋白酶活性的酶的DNA序列的DNA構(gòu)建體、這段DNA序列含有SEQ ID No..2中的DNA序列或者含有與此序列(SEQ ID No..2)至少80％同源性的類似序列。
SEQ ID No.1中的DNA序列編碼一種酶，此酶在以下敘述公開中被稱為蛋白酶I。而被SEQ ID No.2中的DNA序列編碼的酶被稱為蛋白酶II。
通過數(shù)據(jù)庫的同源性搜尋，已發(fā)現(xiàn)SEQ ID No.1和No.2中的DNA序列通常是新的。發(fā)現(xiàn)，SEQ ID No.1中DNA序列與已知蛋白酶基因的最高同源性是與黑曲霉酸性蛋白酶A有74.7％的同源性，據(jù)測定兩者有538個(gè)核苷酸的重疊。據(jù)測定蛋白酶II基因與米曲霉曲霉菌素胃蛋白酶O基因的同源性最高，為75.5％，兩者有343個(gè)核苷酸重疊。
第三本發(fā)明是關(guān)于含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體、一種含有該DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的細(xì)胞和一種生產(chǎn)具有蛋白酶活性的酶的方法，此方法包括在允許酶的產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述的細(xì)胞并從培養(yǎng)基中回收酶。
第四，本發(fā)明是關(guān)于一種具有蛋白酶活性的酶，這種酶由上述定義的DNA構(gòu)建體所編碼，或由本發(fā)明吉的方法所生產(chǎn)。
第五個(gè)重要方面，本發(fā)明是關(guān)于一種具有蛋白酶活性的酶，這種酶在pH值小于7.0和高于3％的過氧化氫存在的條件下具有活性。在本文中，有關(guān)這種酶所使用的術(shù)語“有活性”是指這種酶在上述條件下能水解底物，如在本實(shí)施例五所敘述的那樣。
本發(fā)明的酶是在pH值小于7.0和高于3％的過氧化氫存在條件下有活性，并且它在實(shí)施例五所特定的條件下能從透鏡中除去至少80％的溶菌酶。在下列公開中本發(fā)明的這種酶被叫做“對過氧化氫穩(wěn)定的蛋白酶”。通常認(rèn)為這種酶是新的。
并且，本發(fā)明提供了一種具有蛋白酶活性的酶，它在pH值小于7.0條件下有活性并且它對苯丙氨酸-纈氨酸或者賴氨酸-酪氨酸中的肽鍵具有專一性。術(shù)語“專一性”是指在底物是牛胰高血糖素條件下此酶主要斷裂這些肽鍵。在此敘述的蛋白酶I和蛋白酶II是本發(fā)明酶的優(yōu)選實(shí)施例。這些酶已被發(fā)現(xiàn)是酸性蛋白酶，即具有酸性最適pH值的蛋白酶。
通過本發(fā)明就有可能提供高度純化的蛋白酶，即純度大于70％，優(yōu)選大于90％，這正如通過本文的材料與方法部分所敘述的SDS凝膠電泳所測定的那樣。
最后，本發(fā)明是關(guān)于含有本發(fā)明酶的酶制品和適于不同目的的酶或酶制品的使用，其中對含蛋白質(zhì)物質(zhì)的修飾或降解是理想的。
本發(fā)明的DNA構(gòu)建體、載體和方法在本文中關(guān)于本發(fā)明中定義的DNA構(gòu)建體的術(shù)語“類似物”理解為包括任何如下DNA序列它編碼具有蛋白酶活性的酶并且分別與顯示于SEQ ID No.1或No.2的DNA序列至少有80％的同源性。類似的DNA序列可以是一段在下列條件下同與編碼蛋白酶DNA具有相同序列的探針進(jìn)行雜交的DNA序列。在5XSSC中預(yù)浸泡并在5XSSC、5X Denhardt’s溶液、50mM磷酸鈉、pH6.8和5μg變性聲處理過的小牛胸腺DNA的溶液中在-55℃下預(yù)雜交1小時(shí)，然后在添加了50μCi 32-P-dcTP標(biāo)記探針的上述溶液中于-55℃雜交18小時(shí)，接著在2XSSC、0.2％SDS中于55℃洗三次，每次30分鐘。類似DNA序列優(yōu)選地與SEQ ID No.1或No.2所示的序列至少有90％的同源性。而與所棕序列優(yōu)選地至少有95％的同源性。
類似DNA序列可以是從其它生物體中分離的，也可以是在SEQID No.1或No.2中所示DNA序列基礎(chǔ)上制備的，例如通過引進(jìn)不會產(chǎn)生蛋白酶的另一種氨基酸序列的而只相應(yīng)于宿主生物體選用密碼子的核苷酸取代基，或者通過引進(jìn)會產(chǎn)生不同的氨基酸序列并進(jìn)而可能產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能產(chǎn)生具有野生的酶所沒有的特性的蛋白酶突變型的構(gòu)建體或核苷酸取代基。其它可能的修飾例子是在序列中插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸、在序列中的兩端之一增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸、或者在序列的兩端之一或中間缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
再者，優(yōu)選地，由類似DNA序列編碼的蛋白酶會與針對SEQ IDNo.1或No..2所示DNA編碼的純化蛋白酶而產(chǎn)生的抗體具有免疫交叉反應(yīng)。
能夠與SEQ ID No.1所示序列類似的DNA序列雜交的核苷酸探針例如可以根據(jù)以下DNA序列之一或其組合制備(a)AATTAAGCAT CCTCCATCTT(b)CAAAGCTCAA TCTCGCTAAC(C)TCCCGCTCTT CTCTCGATCT(d)CATCATCCCA ATAACTCGGA(e)CAAAATGAAG ACCTCTGCTC(f)TCTTGACCGC TGGCCTGTTG(g)GCACCGCTGC TATTGCTGCT(h)CCTCTCACCG CGAAGCGCGC(i)ACGTGCTCGC GCTGCCAAGC(j)TGGCACCAGC CGCAAGAGCA(k)AGGGGGGTCT CAAGCCCGGC(l)ACCCAGCGAG GCCATAACCT(m)GACCGGCTCC AAGAACACCG(n)GAGGTACTCG TCCAACTGGG(o)CCGGCGCCGT GCCAT(p) AATTAAGCAT CCTCCATCTT CAAAGCTCAA TCTCGCTAAC TCCCGCTCTTCTCTCGATCT CATCATCCCA ATAACTCGGA CAAAATGAAG ACCTCTGCTCTCTTGACCGC TGGCCTGTTG GCACCGCTGC TATTGCTGCT CCTCTCACCGCGAAGCGCGC ACGTGCTCGC GCTGCCAAGC TGGCACCAGC CGCAAGAGCAAGGGGGGTCT CAAGCCCGGC ACCCAGCGAG GCCATAACCT GACCGGCTCCAAGAACACCG GAGGTACTCG TCCAACTGGG CCGGCGCCGT GCCAT這些序列構(gòu)成了SEQ ID No.1顯示的DNA序列或如此序列的類似物。
能夠與SEQ ID No.2所示DNA序列類似物雜交的核苷酸探針可以是根據(jù)以下DNA序列之一或其組合制備(p1)CTGCTTCTCC TTCTCTTCCT(q)CCTCGTGATA TCTGCTTGAA(r)CATCTCCTCA TCATGGTCGT(s)CCTCAACAAG GTGCAGCCTT(t)CTTCTGGGTC TGACCACCGC(u)CGCCACTGGT CCCCTGGCCG(v)AGCCGCAGGC TTCTGTCCGG(w)TCAAGAACTT CTCCGTCAAG(x)CAGGTCGAGA AGGCGGGCAG(y)CAAGGGACGT ACCGTTAACC(z)TGCCGGGTCT GTATGCGAAT(aa)GCGCTGGCCA AGTATGGCGC(bb)CCAGGTGCGG CCAGCGTCAA(cc)GGCCGCCGCC GTCAGTGGCA(dd)GCGTCGTGAC CACCCGCAGG CCAACGACG(ee)CTGCTTCTCC TTCTCTTCCT CCTCGTGATA TCTGCTTGAA CATCTCCTCATCATGGTCGT CCTCAACAAG GTGCAGCCTT CTTCTGGGTC TGACCACCGCCGCCACTGGT CCCCTGGCCG AGCCGCAGGC TTCTGTCCGG TCAAGAACTTCTCCGTCAAG CAGGTCGAGA AGGCGGGCAG CAAGGGACGT ACCGTTAACCTGCCGGGTCT GTATGCGAAT GCGCTGGCCA AGTATGGCGC CCAGGTGCGGCCAGCGTCAA GGCCGCCGCC GTCAGTGGCA GCGTCGTGAC CACCCGCAGG CCAACGACG這些序列構(gòu)成SEQ ID No.2顯示的DNA序列或如此序列的類似物。
本發(fā)明中的DNA序列可以通過有關(guān)的一般方法分離出。
-在合適的載體中克隆來自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)中的DNA文庫，-用所述的載體轉(zhuǎn)化合適的酵母宿主細(xì)胞，-在合適的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞以表達(dá)由DNA文庫中克隆所編碼的感興趣的酶，并且-通過測定由這些克隆所產(chǎn)生的酶的蛋白酶活性來篩選陽性克隆。
有關(guān)此篩選方法的更詳細(xì)的描述在下面的實(shí)施例1和WO 93/11249中給出了，其內(nèi)容在此列入僅供參考。
例如編碼此酶的DNA序列可以通過篩選棘孢曲霉和CBS101.43菌株，它可公開地從the Centraalbureau voor Schimmel-cultures，Delft，NL得到-的cDNA文庫和選擇能表達(dá)適當(dāng)酶活性的克隆而分離出(此酶活性如所定義的，也即酶水解蛋白質(zhì)和肽中的肽鍵的能力)。因而合適的DNA序列可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法從克隆中分離出，正如實(shí)施例1中所描述的。
可期待的是，編碼同源酶的DNA序列，即同源DNA序列可以類似地通過篩選另一微生物尤其是真菌的一個(gè)cDNA文庫而得到，例如另一種曲霉屬菌株尤其是棘孢曲霉或黑曲霉菌株，或者一種木霉屬之種(Trichodermasp.)菌株，尤其是T.harzianum或者T.reesie菌株，或者一種鐮孢屬之種(Fusarium sp.)菌株，尤其是尖鐮孢(F.oxyssporum)菌株，或者一種根霉屬之種的菌株，例如雪白根霉菌株，或者一種Schytalidiumsp.菌株，或者一種腐質(zhì)霉屬之種(Humicola sp.)菌種。
另一選擇是，與眾所周知的程序一致，本發(fā)明的DNA序列可以方便地利用在此說明書中的DNA序列基礎(chǔ)上制備的人工合成的寡聚核苷酸探針從合適的生物體的DNA中分離出來。例如，合適的寡聚核苷酸探針可以在上面所示的核苷酸序列之一的基礎(chǔ)上制備。
隨后，該DNA序列可以被插入到重組表達(dá)載體中。這可以是任何方便地適于重組DNA程序的載體，并且載體的選擇常常依賴于被引入的宿主細(xì)胞。因此，該載體可以是自主復(fù)制載體，即以染色體外的實(shí)體形式存在并且其復(fù)制不依賴于染色體而復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒。該載體也可以是當(dāng)被引入宿主細(xì)胞時(shí)會整合到宿主細(xì)胞基因組中并且隨著被整入染色體的復(fù)制而復(fù)制的載體。
在載體中，編碼蛋白酶的DNA序列應(yīng)該合并地連接到一個(gè)合適的啟動子和終止子序列上。啟動子可以是任一在選用的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因中得到的DNA序列。分別把編碼蛋白酶的DNA序列、啟動子和終止子連接起來并把它們插入到合適的載體中的程序是為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。(例如，參見Sambrook等的分子克隆，一本實(shí)驗(yàn)手冊，Cold Spring Harbor，NY，1989)。被轉(zhuǎn)化編碼本發(fā)明酶DNA序列的宿主細(xì)胞最好是真核細(xì)胞，尤其是真菌細(xì)胞例如酵母或絲狀真菌細(xì)胞。特別地，該細(xì)胞可以屬于曲霉屬的一個(gè)種，最好是米曲霉或黑曲霉。真菌細(xì)胞可被如下有關(guān)過程轉(zhuǎn)化形成原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，然后以本質(zhì)上已知的方式再生細(xì)胞壁。使用米曲霉作為宿主微生物的方法在EP 238 023(在Noro Noridisk A/S中)描述過。其內(nèi)容在此列入僅供參考。宿主細(xì)胞也可以是酶母細(xì)胞，例如一種酵母屬(Saccharomyces)菌株尤其是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克魯弗酵母(Saccharomyces Kluyveri)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)，一種裂殖酵母屬之種(Schizosaccaromyces sp.)菌株例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，一種漢遜酵母屬之種(Hansenula sp.)菌株，畢赤酵母屬之種(Pichiasp.)菌株，Yarrowia sp.菌株如Yarrowia lipolytica，或者克魯維酵母屬之種(Kluyreromyces sp.)菌株如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)。
再者，本發(fā)明是關(guān)于生產(chǎn)具有蛋白酶活性的酶的一種方法，其中被轉(zhuǎn)化編碼該酶的本發(fā)明吉DNA構(gòu)建體的合適的宿主細(xì)胞是在允許該酶的產(chǎn)生條件下得到培養(yǎng)，并從培養(yǎng)基中回收產(chǎn)生的酶。
被用來培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于所研究的宿主細(xì)胞生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基。表達(dá)的蛋白酶可以主便地分泌到培養(yǎng)基中并且可以從那通過已知的操作程序回收，這些程序包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞、利用如硫酸銨的鹽沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成份、然后再進(jìn)行層析，如離子交換層析、親和層析或類似的過程。
本發(fā)明中的酶本發(fā)明中的蛋白酶(如對過氧化氫穩(wěn)定的蛋白酶或者對肽鍵賴氨酸-酪氨酸或苯丙氨酸-纈氨酸具有專一性的蛋白酶)的活性范圍在pH值為2-7為好，例如在pH值小于6.0，再如在pH值2-6，并且大多數(shù)情況下在pH4-6范圍內(nèi)更好。
可以理解，兩種酸性蛋白酶在0.01-5％的過氧化氫，如0.1-5％、0.5-4％、1-4％或2-3％的過氧化氫存在的條件下具有活性，并且它們可應(yīng)用于隱形眼鏡的清洗。
本發(fā)明中對過氧化氫穩(wěn)定的蛋白酶的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例是被SEQID No..1所示DNA序列或者上述的與其具有至少80％同源性的同源序列所編碼的酶。
本發(fā)明中對賴氨酸-酪氨酸或苯丙氨酸-纈氨酸具有專一性的蛋白酶的優(yōu)選實(shí)施例是被SEQ ID No..2所示序列或上述的與其至少具有80％同源性的同源序列所編碼的酶。
本發(fā)明中的酶更好地是與針對來自棘孢曲霉，CBS101.43并且被SEQ ID No..1或No..2所示的DNA序列所編碼的純化蛋白酶而培育的抗體具有免疫反應(yīng)。本文中術(shù)語“來自”不僅指蛋白酶由CBS 101.43菌株產(chǎn)生，而且指蛋白酶被從CBS 101.43菌株分離的DNA序列所編碼并且在被轉(zhuǎn)化了該DNA序列的宿主體中產(chǎn)生。
盡管本發(fā)明中對過氧化氫穩(wěn)定的蛋白酶和對賴氨酸-酪氨酸或苯丙氨酸-纈氨酸有專一性的蛋白酶都是從真菌種棘孢曲霉中的一種菌株中獲取，但是要考慮到這些酶也可以從其它生物體，尤其是微生物中獲取。
因此，本發(fā)明中的酶最好從細(xì)菌中或真菌如曲霉屬、根霉屬、木霉屬(如T.reesei或T.harzianum)、青霉屬、鐮孢屬、Schytalidium或腐質(zhì)霉屬(如H.insolens或H.lanuginosa)等菌株或者芽孢桿菌屬菌株中獲取。
曲霉屬之種的例子包括黑曲霉、米曲霉或棘孢曲霉如棘孢曲霉CBS 101.43。
再者，本發(fā)明是關(guān)于一種用來降解或修飾包括材料的蛋白酶的酶制品，該酶制品經(jīng)濃縮而富含上述具有蛋白酶活性的酶。
已被濃縮而富含本發(fā)明酶的酶制品可以含有多種酶活性，尤其是含有多種降解植物細(xì)胞壁的酶如PectinexR、Pectinex Ultra SPR、Gamanase、Celluclast、纖維素水解酶或者蛋白酶和/或者含外肽酶的酶制品如NeutraseR、AlcalaseR或者HavourzymeR(這些都可從Novo Nordisk A/s獲取)。在本文，術(shù)語“濃縮而富含”是指酶制品的蛋白酶活性已經(jīng)增強(qiáng)了，如具有至少1.1的濃縮因子，這可方便地加入經(jīng)上述方法制備的本發(fā)明酶的加入而達(dá)到。
作為選擇富含具有蛋白酶活性的酶的酶制品可以是含有作為主要酶成份的本發(fā)明中的一種酶，如單一成份酶制品。
酶制品可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法制備而且可以制成液體形式干制品。例如，酶制品可制成顆粒狀或微小顆粒狀。酶制品所含的酶可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法而穩(wěn)定化。
根據(jù)本發(fā)明而得的酶制品可以作為用來降解或改變植物細(xì)胞壁的試劑。象伸展蛋白之類的某些蛋白是組成植物細(xì)胞壁的成份。蛋白酶因而會加速植物細(xì)胞壁的降解和改變。象這樣的含蛋白酶的植物細(xì)胞壁降解酶制品能應(yīng)用于許多不同的方面，如林橄欖和油菜之類的植物材料中提煉油或者從不同水果如蘋果、梨、檸檬等中生產(chǎn)果汁。
酶制品另外還可含有一種或多種其它降解植物細(xì)胞壁的酶，如pectin lyase、pectate lyase、endoglucanase、arabinanase、xylanase、glu-canase、galactanase、mannanse、α-galactosidase、rhamnogalacturonase、pectin acetylesterase.polygalacturonase、蛋白酶、肽鏈端解酶或果膠甲基酯酶。酶制品甚至可以含有一種或多種具有針對上述內(nèi)切酶所起作用的底物而起作用的外切酶活性的酶。根據(jù)本發(fā)明，蛋白酶在與許多其它細(xì)胞壁降解酶起作用的相同的pH值和溫度條件下起作用，因而特別適用于上面應(yīng)用。
其它酶也通過曲霉屬，最好是黑曲霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉或米曲霉或者木霉屬的微生物生產(chǎn)出來。
本發(fā)明的酶制品也可在釀酒工業(yè)中被用來防止酒霾或者溶解酒霾，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)常參與討厭的酒霾的形成。本發(fā)明的蛋白酶在發(fā)酵和成酒的條件下具有活性，因而在此方面特別有用。
本發(fā)明中的酶或酶制品可應(yīng)用于烤制行業(yè)中如用來弱化面粉中的面筋成份以便從所謂的硬面粉中得到軟化面粉。軟化面粉在需具有很大伸展性但無彈性的生粉制作中是重要的，例如在對外烤制品、餅干和其它在運(yùn)輸和烤制中必須保持其本來形狀的產(chǎn)品等的制作中。本發(fā)明蛋白酶優(yōu)選地被通常用來軟化面粉的試劑如焦亞硫酸鈉(SMS)，作為理想的選擇。因?yàn)镾MS對健康有潛在的危害性，SMS的使用被認(rèn)為是不理想的。
蛋白酶制品也可在食品和飼料工業(yè)中被用來提高蛋白質(zhì)的可消化率。例如，酶或酶制品可被加入動物飼料中或者被用來加工動物飼料，尤其是仔豬或禽類飼料。因而，飼料成份的可消化率可被提高，進(jìn)而動物的生長速度和其對飼料的利用效率都被提高。參見Brenes等(1993)。
而且，本發(fā)明的酶或酶制品可用來從蔬菜蛋白如大豆、花生、羽扇豆或油菜籽蛋白、牛奶如酪蛋白、肉蛋白或魚類蛋白等中制作蛋白水解產(chǎn)物。蛋白酶可被用來制作蛋白水解產(chǎn)物以便提高可溶性、稠度、口味或發(fā)酵能力，降低抗原性，或因其它目的而制作食品、飼料或醫(yī)用產(chǎn)品。本蛋白酶可單獨(dú)使用，也可與其它蛋白酶或象外肽酶之類的其它酶共同使用。本發(fā)明的蛋白酶與富含外肽解酶的酶制品共同使用會提高蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的品味。
本蛋白酶制品也可用來改變蛋白質(zhì)，如減少全部或部分由蛋白質(zhì)引起的粘性。這種粘性問題已聞名于對象大豆、花生之類的植物材料所含蛋白質(zhì)的加工行業(yè)中。
甚至，本酶或酶制品可用于對魚肉或獸肉的加工中以改變其結(jié)構(gòu)和/或者粘性。
本蛋白酶制品也可用來加速發(fā)酵過程，例如為了生產(chǎn)啤酒而對大麥、麥芽及其它原料進(jìn)行的酵母發(fā)酵。
再者，本發(fā)明的酶或酶制品可用在制革工業(yè)中從毛皮中除毛。由于隨后的鞣革是在酸性條件下進(jìn)行，因此本蛋白酶的低最適pH值是一大優(yōu)點(diǎn)。本蛋白酶制劑有助于從蛋白質(zhì)中生產(chǎn)肽，在此它的優(yōu)點(diǎn)是使用克隆的酶而不受其它蛋白水解活性的影響。
而且，本蛋白酶制品能用于降解蛋白質(zhì)以利于提高不同產(chǎn)品的純度或質(zhì)量，如提高guar gum、Xanthan gum之類橡膠的純度和質(zhì)量，給絲脫膠或者提高毛物質(zhì)量。
由于它們對過氧化氫的穩(wěn)定性，本發(fā)明的兩種蛋白酶在清洗隱形眼鏡或其它涉及過氧化氫又必須去除含蛋白物質(zhì)的應(yīng)用方面都特別有用。
針對以上各種用途，本發(fā)明的酶制品的使用量和其它使用條件可以在本領(lǐng)域已知方法的基礎(chǔ)上確定下來。
本發(fā)明也在進(jìn)一步附圖中加以描述，其中，

圖1分別說明了蛋白酶I和II的pH值活性曲線，圖2分別為蛋白酶I和II的溫度一活性曲線，圖3和圖4分別為蛋白酶I和II對pH值的穩(wěn)定性曲線，
圖5和圖6分別為蛋白酶I和II對溫度的穩(wěn)定性曲線，圖7表示各種蛋白酶在隱形眼鏡清洗中的作用，圖8表示本發(fā)明的一種酶對面筋伸展的效應(yīng)。
在下列實(shí)施例中更為詳細(xì)地加以描述了本發(fā)明，但無論如何，不只限于權(quán)利要求書的本發(fā)明范圍。材料和方法供體生物體mRNA從棘孢曲霉CBS 101.43中分離，后者生長在常攪拌以保證足夠氧氣的含大豆的發(fā)酵培養(yǎng)基中。生長3至5天后收集菌絲體，立即在液氮中冰凍并保存于-80℃。
酵母菌株使用的釀酒酵母菌株是yNG231(MATalpha，leu2，ura3-52，his4-539，pep4-delta 1，Cir+)或者JG 169(MATc；ura 3-52；leu2-3，112；his 3-D200；pep4-113；prc 1HIS 3；prb1 LUE2；cir+)。
質(zhì)粒含酵母TPI啟動子的表達(dá)質(zhì)粒pYH17是從市面上可買到的pYES II質(zhì)粒(Invitrogen)中制備的。這種質(zhì)粒及其構(gòu)建在WO 93/11249中描述了，在此其內(nèi)容列入僅供參考。
曲霉表達(dá)載體pHD 414是質(zhì)粒p775的衍生物(在EP 238 023中被描述)。pHD 414還在WO 93/11249中被描述。pHD414含有A.-niger葡萄糖淀粉酶終止子和A.oryzae TAKA淀粉酶啟動子。
總RNA提取先用硫氰酸胍(guanidinium thiocyanate)抽提，然后通過5.7M CsCl墊超速離心而得，這正如Chirgwin等，1979和WO 93/11249中所描述的一樣。
poly(A)+RNA的分離poly(A)+RNA是經(jīng)寡聚dT-纖維素親和層析(Aviv & Leder，1972)而分離出。典型地，0.2g寡聚dT纖維素(Boehringer Mannheim)預(yù)溶脹于10ml 1x柱填充緩沖液(20mMTris-Cl，pH7.6，0.5M NaCl，1mM EDTA，0.1％SDS)中，裝入經(jīng)DEPC處理的、塞好的塑料柱(Poly Prep層析柱，Bio Rad)并用20ml1x填充緩沖液平衡?？俁NA在65℃加熱8分鐘，在冰上冷卻5分鐘，加入1體積2X柱填充緩沖液到RNA樣品中后裝入柱中。收集洗脫物并重裝2-3次，但裝樣前要象上面一樣給樣品加熱并在冰上冷卻。寡聚dT柱先用10體積1X填充緩沖液，再用了體積培養(yǎng)基鹽緩沖液(20mM Tris-Cl，pH7.6，0.1M NaCl，1mM EDTA，0.1％SDS)洗，然后用3體積洗脫緩沖液(10mM Tris-Cl，pH7.6，1mMEDTA，0.05％SDS)洗脫poly(A)+RNA，預(yù)熱至+65℃，每次收集500μl洗脫物。測定每次收集的洗脫物的OD260值，將各次含mRNA洗脫物合并并且在-20℃用乙醇沉淀12小時(shí)。離心收集poly(A)+RNA，重新懸浮于DEPC-DIW中并以5-10μg等分試樣形式在-80℃貯存。
Northern印跡分析從各種菌絲體分離的poly(A)+RNA(5μg/樣品)在1.2瓊脂糖-2.2M甲醛膠(Sambrook等，1989)中電泳，并以10XSSC(Sambrook等，1989)作為轉(zhuǎn)移緩沖液將其印跡到尼龍膜(Hybond-N，Amersham)上。在各次雜交中使用了三種隨機(jī)引物(Feinberg和Vogelstein，1983)32P-標(biāo)記的cDNA探針1)來自棘孢曲霉的多聚半乳糖苷酶I的1.3kb的NotI-SpeI片段，2)來自棘孢曲霉編碼葡萄糖內(nèi)切酶I的1.3kb Noti-Spe片段，3)來自棘孢曲霉編碼半乳聚糖酶I的1.2kb EagI片段。Northern雜交是在5XSSC(Sambrook等，1989)、5X Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS(W/V)和100μg/ml變性鮭精子DNA中與濃度為Ca.2ng/ml的探針在65℃雜交16小時(shí)，在65℃雜交16小時(shí)，在65℃用5XSSC漂洗二次，每次15分鐘，在2XSSC、0.5％SDS中漂洗一次30分鐘，在0.2XSSC、0.5％SDS中漂洗一次30分鐘，再用5XSSC漂洗2次每次15分鐘。在-80℃放射自顯影12小時(shí)，之后根據(jù)制造商的說明書將1號探針從濾膜上除掉，重新與2號探針雜交，最后與3號探針雜交。以來自Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室的梯度RNA作為分子量大小標(biāo)記物。cDNA合成第一條鏈的合成使用發(fā)夾修飾用RNA聚合酶H方法(Gubler和Hoffman 1983，Sambrook等1989)從5μg來自 棘孢曲霉的poly(A)+RNA中合成雙鏈cDNA。poly(A)+RNA(5μg溶于5μlDEPC處理過的水中)在70℃加熱8分鐘，在冰上冷卻，然后與如下試劑混合，最終體積為50μl含有1mM每種dNTP(Pharmacia)的逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(50mM Tris-Cl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、10mMDTF、Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室)、40單位的人胎盤核糖核酸酶抑制因子(RNasin，Promega)、10μg位寡聚(dT)12-18引物(Pharmacia)和1000單位SuperScript II RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶(Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室)。反應(yīng)混合物在45℃保溫1小時(shí)即可合成第一條鏈cDNA。
第二條鏈的合成待合成后，加入30μl 10mM Tris-Cl、pH 7.5、1mM EDTA，加入40μg糖原載體(Boehringer Mannbeim)、0.2體積10M NH4Ac和2.5體積96％EtoH(乙醇)讓mRNAcDNA雜交分子經(jīng)在-20℃乙醇沉淀12小時(shí)。離心回收雜交分子，用70％的乙醇洗滌，干燥，并且重懸浮于含有100μM各種dNTP、44單位大腸桿菌DNA聚合酶I(Amersham)、6.25單位核糖核酸酶H(Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室)和10.5單位大腸桿菌DNA連接酶(New EnglandBiolabs)的250μl第二條鏈緩沖液(20mM Tris-Cl、pH7.4、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM(NH2)2SO4，16μM BNAD+)中。在16℃將上述反應(yīng)管溫育3小時(shí)，加入EDTA使終濃度為20mM就可中止反應(yīng)，然后用酚抽提即可合成第二條鏈cDNA。
Mung菜豆核酸酶處理加入2體積96％乙醇、0.1體積3MNaAc、pH5.2，在-20℃用乙醇沉淀雙鏈cDNA 12小時(shí)，經(jīng)離心回收，70％乙醇洗滌，干燥(真空干燥)，并重新懸浮于30μl Mung菜豆核酸酶緩沖液(30mM NaAc、pH4.6、300mM NaCl、1mM ZnSO4、0.35mM DTT，2％甘油)內(nèi)含36單位Mung菜豆核酸酶(Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室)中。將該反應(yīng)物在30℃溫育30分鐘，然后經(jīng)加入70μl10mM Tris-Cl、pH7.5、1mM EDTA、酚抽提物，并用2體積96％乙醇、0.1體積3M NaAc、pH5.2在-20℃下乙醇沉淀12小時(shí)，這樣就可對單鏈發(fā)夾DNA進(jìn)行修剪。
用T4DNA聚合酶平末端化將含有0.5mM各種dNTP和7.5單位T4DNA聚合酶(Invitrogen)的50μl T4DNA聚合酶緩沖液(20mMTris-乙酸、pH7.9、10mM MgAc、50mM KAc、1mM DTT)于+37℃溫育反應(yīng)混合物15分鐘，就可將雙鏈cDNA平末端化。加EDTA使最終濃度為20mM即可終止反應(yīng)，然后用酚抽提和乙醇沉淀。
連接接頭的連接和大小篩選將含有600pmol BstX I連接接頭和含5單位T4連接酶(Invitrogen)的30μl連接緩沖液(50mMTris-Cl、pH7.8、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP、25μg/ml小牛血清蛋白質(zhì))在+16℃溫育12小時(shí)，在此填充反應(yīng)之后，cDNA就被連接到非回文的BstX I接頭(1μg/μl，Invitrogen)上。在+70℃加熱5分鐘使反應(yīng)終止，用瓊脂糖膠(0.8％HSB-瓊脂糖，F(xiàn)MC)電泳將被連接的cDNA按大小分開以便分離沒有連接上的接頭和小的cDNA。切T.0.7kb對cDNA進(jìn)行大小篩選，并在10mM Tris-Cl、pH7.5、1mM EDTA中，100伏將瓊脂糖膠電洗脫1小時(shí)，用酚抽提并同上面一樣于-20℃經(jīng)乙醇沉淀12小時(shí)。
cDNA文庫的構(gòu)建被連接的雙鍵cDNA經(jīng)離心回收、用70％乙醇洗滌并重新懸浮于25ml DIW中。在大規(guī)模文庫連接之前，4種檢測連接在各含如下物質(zhì)的10μl連接緩沖液(同上)中進(jìn)行每種含1μl雙鏈DNA(1-3號反應(yīng)管)、2單位T4連接酶(Invitrogen)和50ng(1號管)、100ng(2號管)和200ng(3號和4號管)BstXI切割的酵母表達(dá)載體(或Invitrogen的PYES 2.0載體或yHD17)。將上述反應(yīng)物在+16℃溫度12小時(shí)，在70℃加熱五分鐘即完成連接反應(yīng)，1μl各種連接液經(jīng)電穿孔(200Ω，2.5KV，25μF)進(jìn)入40μl感受態(tài)大腸桿菌1061細(xì)胞(OD600＝0.9，每升LB-broth，在冷DIW中洗二次，20ml 10％甘油中洗一次，重懸于2ml 10％甘油)。在每種轉(zhuǎn)化混合物中加入1ml SOC后，讓細(xì)胞在+37℃生長1小時(shí)，取50μl涂市于LB+ampicillin平板上(100μg/ml)并在+37℃生長12小時(shí)。
使用上述實(shí)驗(yàn)中的最佳條件，大量連接在含有9單位T4連接酶的40μl連接緩沖液中進(jìn)行，并且反應(yīng)液在+16℃溫育12小時(shí)。在70℃加熱5分鐘以終止連接反應(yīng)，在-20℃經(jīng)乙醇沉淀12小時(shí)，經(jīng)離心回收并重懸于120μl DIW中。使用同上的電穿孔條件將1μl分裝的各樣品轉(zhuǎn)化到電感受態(tài)的大腸桿菌1061細(xì)胞中，測定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的滴度并將文庫涂布于LB+ampicillin平板上(5000-7000c.f.u./平板)。每個(gè)平板加3ml培養(yǎng)基。到下細(xì)菌，加1ml甘油并一起在-80℃貯存作為貯存庫。余下的2ml用作DNA分離。如果DNA的數(shù)量不足以產(chǎn)生所需數(shù)量的酵母轉(zhuǎn)化體，大量DNA從已接種上50μl-80℃貯存的過夜繁殖了的細(xì)菌貯存液的500ml培養(yǎng)基(TB)中制備。
酵母文庫的構(gòu)建為了保證所有細(xì)菌克隆在酵母中被檢測，酵母轉(zhuǎn)化體的數(shù)量要五信倍于原庫中的細(xì)菌克隆數(shù)，以此作為最低限度。
來自貯備庫中的各1μl分裝的純化的質(zhì)粒DNA(100mg/μl)經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化(200Ω1，.5KV，25μF)gc 40μl感受態(tài)S.cerevisiae JG 169細(xì)胞中(OD600＝1.5，每500ml YPD，在冷DIW中洗二次，在冷的1M山梨醇中洗一次，重懸于0.5ml 1M山梨醇中，Becker和Guarate，1991)。加入1ml 1M冷的山梨醇后，80μl分裝的樣品輔板于SC+葡萄糖-尿嘧啶培養(yǎng)基上以達(dá)到250-400c.f.u/板，并在30℃培育3-5天。
在曲霉菌中表達(dá)的cDNA基因的分離一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)生蛋白酶的菌溶接于20ml含YNB-1肉湯培養(yǎng)基的50ml玻璃試管中。在30℃搖蕩2天。以3000rpm離心10分鐘收集細(xì)胞。
細(xì)胞被重懸于1ml 0.9M山梨醇、0.1M EDTA、pH7.5的溶液中。將其沉淀物轉(zhuǎn)移到一個(gè)Eppendorf管中，全速旋轉(zhuǎn)30秒。將細(xì)胞沉淀重懸于0.4ml 0.9M山梨醇、0.1M EDTA、14mM β-巰基乙醇中。加入100μl 2mg/ml Zymolase將其在37℃溫育30分鐘并離心30秒。沉淀物(球芽)被重懸于0.4ml TE中。加入90μl溶液(1.5ml0.5M EDTA pH8.0、0.6ml 2M Tris-Cl pH8.0、0.6ml 10％SDS)并在65℃溫育30分鐘。加入80μl 5M KOAc并冰育至少60分鐘，全速離心15分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到裝滿乙醇(室溫)的新試管中，然后輕輕地使其充分混勻，離心30秒。用70％的冷乙醇洗滌沉淀，離心30秒并在室溫下干燥。將沉淀重懸于50μl TE中并離心15分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到一新試管中。加入2.5μl 10mg/ml的核糖核酸酶，然后在37℃溫育30分鐘并緩緩加入500μl異丙醇，輕輕將其混勻。離心30秒，棄去上清。用96％乙醇洗滌沉淀并于室溫干燥。該DNA溶于50μl水中使其終濃度約為100μl/ml。
米曲霉或黑曲霉的轉(zhuǎn)化(一般步驟)在100ml YPD(Sherman等，酵母遺傳學(xué)方法，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1981)中接種上A.oryzae或A.niger的孢子并在37℃搖蕩培育約2天。用細(xì)布(miracbth)過濾收集菌絲體并用200ml 0.6M MgSO4洗滌。將菌絲體懸浮于15ml 1.2M MgSo4、10mM NaH2PO4、pH＝5.8溶液中。將懸浮在冰上冷卻，加入1ml含有120mg NovozymR234、批號1687的緩沖液。5分鐘后，加入1ml 12mg/ml BSA(Sigma型號H25)并在37℃下輕輕搖蕩溫育1.5-2.5小時(shí)，直至經(jīng)檢查的樣品在顯微鏡下可見到大量原生質(zhì)體。
用細(xì)布過濾懸濁液，將濾液轉(zhuǎn)移到一個(gè)滅菌過程的試管中并加上一層5ml 0.6M山梨醇、100ml Tris-Cl、pH＝7.0。在100g離心15分鐘，收集MgSO4上層的原生質(zhì)體。加工體積的STC(1.2M山梨醇、10mM Tris-HCl、pH＝7.5、10mM CaCl2)于原生質(zhì)體懸浮液中并在1000g離心5分鐘。將原生質(zhì)沉淀重懸于3ml STC并重新離心沉淀，再重復(fù)一次。最后將原生質(zhì)體懸浮于0.1-2ml的STC中。
100μl原生質(zhì)體懸液與含有5-25μg合適DNA的10μl STC相混合。原生質(zhì)體與p3SR2(一種攜帶構(gòu)巢曲霉amds基因的質(zhì)粒)相混合。混合物于室溫放置25分鐘。加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH29576)、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl、pH＝7.5的溶液并仔細(xì)混勻(2次)，最后加入0.85ml如上溶液并仔細(xì)混勻?；旌衔镌跍厥曳胖?5分鐘、2500g離心15分鐘并將沉淀重懸于2ml 1.2M山梨醇中。再沉淀一次后，涂布原生質(zhì)體于合適的平板上。原生質(zhì)體被涂布于含有1.0M蔗糖、pH7.0、10mM作為氮源的乙酰胺和20mM用來抑制背境生長的氯化銫的小平板上[Cove Biochem.Biophys.Acta113(1966)51-56]。于37℃培育4-7天后，收集和涂市孢子以獲取單菌落。重復(fù)此步驟并將第二次重復(fù)分離后的單菌落孢子作為指定的轉(zhuǎn)化體而貯存起來。
免疫交叉反應(yīng)利用純化的蛋白酶可制備用來檢測免疫交叉反應(yīng)的抗體。更具體地，根據(jù)N.Axelson等在A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications，1973，第二十三章或者A.Johnstone或R.Thorpe的Immunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publications，1982(尤其第27-31頁)中所描述的步驟，抗本發(fā)明蛋白酶的抗血清可經(jīng)免疫兔(或其它嚙齒動物)培育出。從這些抗血清中可獲取純化免疫球蛋白，例如通過鹽沉淀((NH4)2SO4)，然后經(jīng)透析和離子交換層析如DEAE-葡聚糖層析等制備?？赏ㄟ^如下方法之一來分析蛋白的免疫化學(xué)特性O(shè)utcherlony雙擴(kuò)散分析法[O.OuchterlonyHandbook of Experimental Immunology(D.M.Weir編輯)，Blackwell Scientific Publications，1967，第655-706頁]、交叉免疫電泳法(N.Axelsen等，同上，第3、4章)和火箭免疫電泳法(N.Axelsen等，第2章)。
培養(yǎng)基YPD10g酵母提取物、20g胰蛋白胨、加水至810ml，高壓滅菌，加入90ml 20％葡萄糖(滅菌過濾)。
10X基礎(chǔ)鹽66.8g酵母氮基質(zhì)、100g琥珀酸、60g NaOH、加水至1000ml，滅菌過濾。
SC-URA90ml 10X基礎(chǔ)鹽、22.5ml 20％酪蛋白氨基酸、9ml1％胰蛋白胨、加水至806ml、高壓滅菌、加3.6ml 5％蘇氨酸、和90ml 20％葡萄糖或者20％半乳糖。
SC-H肉湯培養(yǎng)基7.5g/l無氨基酸的酵母氮基質(zhì)、11.3g/l琥珀酸、6.8g/l NaOH、5.6g/l無維生素的酪氨酸、0.1g/l胰蛋白胨。在121℃高壓滅菌20分鐘。高壓后每100ml培養(yǎng)基中加入10ml 30％半乳糖溶液、5ml 30％葡萄糖溶液和0.4ml 5％蘇氨酸溶液。
SC-H瓊脂7.5g/l去氨基酸的酵母氮基質(zhì)、11.3g/l琥珀酸、6.8g/l NaOH、5.6g/l無維生素的酶氨酸、0.1g/l胰蛋白胨和20g/l瓊脂(Bact)。于121℃高壓滅菌20分鐘。高壓后，每450ml瓊脂加入55ml 22％半乳糖溶液和1.8ml 5％蘇氨酸溶液。
YNB-1瓊脂3.3g/l KH2PO4、16.7g/l瓊脂、調(diào)pH值至7.0，在121℃高壓滅菌20分鐘。高壓后，每450m瓊脂膠加入25ml13.6％無氨基酸的酵母氮基質(zhì)、25ml 40％葡萄糖溶液、1.5ml 1％L-亮氨酸溶液和1.5ml 1％組氨酸溶液。
YNB-1肉湯組成同YNB-1瓊脂一樣，但無瓊脂。
FG-4-瓊脂35g/l瓊脂、30g/l大豆粉、15g/l麥芽糖糊精(Glucidex 6)、5g/L細(xì)菌蛋白胨、pH7.0，在121℃下高壓滅菌40分鐘。
FG-4培養(yǎng)基30g/L大豆粉、15g/L麥芽糖糊精(Glucidex 6)、5g/L細(xì)菌蛋白胨。在121℃高壓滅菌40分鐘。
MDU-2培養(yǎng)基45g/L麥芽糖、1g/L MgSO4·7H2O、1g/L NaCl、2g/L K2SO4、12g/L KH2PO4、0.1ml/L Pluronic 61L、0.5ml/L微量金屬溶液，pH5.0，在121℃高壓滅菌20分鐘高壓后加入15ml/L 50％滅菌過濾的尿素。
酪蛋白薄膠1％瓊脂糖、0.5％的溶于pH值為5.5緩沖液中的酪蛋白。將膠煮沸，冷卻至55℃，再將薄膠倒在瓊脂平板上。
原料批量發(fā)酵從A.Oryzae獲取蛋白酶I和II的原料批量發(fā)酵所用的培養(yǎng)基是由作為碳原的麥芽糖糊精、作為氮源的尿素和酵母提取物組成。
原料批量發(fā)酵是這樣進(jìn)行的把一搖瓶有關(guān)米曲霉宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物接種在含有3.5％碳源和0.5％氮源的培養(yǎng)基中。在pH5.0和34℃條件下培養(yǎng)，每24小時(shí)后重新補(bǔ)充碳源和氮源。以碳源作為限制因子而保證氮的充分供應(yīng)。原料批量培養(yǎng)持續(xù)4天之后即可回收所需酶。
酶的特性蛋白水解活性1個(gè)血紅蛋白酶單位(hpu)是指在如下描述的標(biāo)準(zhǔn)條件下釋放1毫摩爾基本氨基(通過與絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)比較來測定)所需的酶量用Britton和Robinson在J.Chem.Soc，193l中第1451頁所描述的通用緩沖液調(diào)節(jié)pH值至5.5從而制備2％(W/V)血紅蛋白(牛的，由Sigma供應(yīng))溶液。將2ml底物溶液在25℃水浴預(yù)培育10分鐘，相應(yīng)加入1ml含6g/ml酶制品的酶溶液-于約0.2-0.3hpu/ml通用緩沖液(pH5.5)。在25℃培育30分鐘后，加入一種冷卻劑(將5ml含17.9克三氯乙酸、29.9克乙酸鈉和19.8克乙酸的溶液，用去離子水稀釋至500ml)終止反應(yīng)。空白對照溶液的制備與檢測溶液基本一致，只是要先加冷卻劑再加酶溶液。將反應(yīng)物在水浴中保持20分鐘。此后用Whatman 42濾紙過濾。
基本氨基可通過它們與O-phthaldialdehyde(OPA)的顏色反應(yīng)來測定。方法如下將7.62克disodium tetraborate decahydrate和2.0克Sodium dodecylsulfate溶于150ml水中。同時(shí)加入溶于4ml甲醇的160mg OPA溶液和400μlβ-巰基乙醇，之后加水至200ml。每3mlOPA反應(yīng)物加入400μl上面所獲的濾液，混勻。約5分鐘后測定340nm處光密度(OD)。OPA檢驗(yàn)也可在含10mg蘇氨酸的100ml通用緩沖液(pH5.5)制成的蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)液中進(jìn)行。不含蘇氨酸的通用緩沖液用作空白對照。根據(jù)如下公式，蛋白酶的活性可由OD測量值算出hpu/每毫升酶溶液(OD1-OD6)×Cser×Q(ODser-ODB)×MWser×ti]]>hpu/每克酶制品＝hpu/mlb其中，OD1、OD6、ODser和ODB分別是檢測溶液、對照溶液、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液和緩沖液的光密度值，Cser是標(biāo)準(zhǔn)液中絲氨酸濃度(mg/ml)(在此處為0.1mg/ml)，MWser是絲氨酸的分子量(105.0g)，Q是酶溶液的稀釋因子(在此處為8)，而ti是培養(yǎng)時(shí)間的分鐘數(shù)(在此為30分鐘)。
抑制檢測下列抑制因子Pepstatin(天冬氨酸抑制因子)(1mM)PMSF(絲氨酸蛋白酶抑制因子)(0.1％)PEFABLOC(絲氨酸蛋白酶抑制因子)(0.1％)EDTA(金屬蛋白酶抑制因子)(0.1M)PEFABLOC可從Pentapharm，Basel，瑞土買到，其它的都可以Sigma公司買到。
殘余活性可通過pH5.5下的HPU/L來測定。
pH值活性曲線是由不同pH值下的HPU/L值來確定。
對pH值的穩(wěn)定性是按下方式測定在50℃和各種不同pH值(4-5-6-7-8)下分別讓酶溶液停留30分鐘、60分鐘和120分鐘，并測定放置前后酶的水解蛋白質(zhì)活性。
溫度活性曲線是由不同溫度(15-70℃)下的HPU/l來確定。
溫度穩(wěn)定性按如下方式測定在pH值為5.0和各種不同溫度下(25-40-50-60℃)分別讓酶溶液(0.3HPU/l)放置30分鐘、60分鐘和120分鐘，并測定放置前后其水解蛋白質(zhì)活性。
SDS凝膠電泳和等電聚焦是根據(jù)制造商的說明書分別在8-25濃度梯度的來自Pharmacia公司的Phast系統(tǒng)和IEF 3-9上進(jìn)行。
專一性本發(fā)明蛋白酶的專一性按如下方式測定0.5ml 1mg/ml人胰島素或牛胰高血糖素的通用緩沖液，pH5.5(參考上文)分別和75μl的蛋白酶I和II(0.6hpu/l)的同樣通用緩沖液溶液在37℃溫育120分鐘。加50μl 1N鹽酸可使反應(yīng)中止。
人胰島素分子或牛胰高血糖素被切為許多肽片段。利用合適的C-18柱(Hibar Lichrosorb RP-18，Merck AG，Darmstadt，F(xiàn)RG提供了5μm顆粒)反相HPLC分離提取各片段。這些片段可通過下列溶液A.0.2M硫酸鈉和0.1M磷酸，pH2.5；
B.乙腈/水，50％；在從90％A/10B到80％A/20％B的線性梯度上先洗脫0-5分別再用80％A/20％B洗脫50分鐘。使用AppLied Biosystems(FosterCity，CA，USA)Model 470 A氣相測序儀通過自動Edman降解對分離提取的片段進(jìn)行測序，并且這些乙內(nèi)酰苯硫脲(PTH-)氨基酸再通過高效液相色譜進(jìn)行分析，這正如L.Thim等的“通過轉(zhuǎn)化酶母細(xì)胞分泌人胰島素”，F(xiàn)EBS Letters 212(2)，1987，第307頁所描述的那樣，據(jù)此胰島素或胰高血糖素分子的酶切位點(diǎn)加以確定。
實(shí)施例1在150個(gè)庫中構(gòu)建了由大約1.5×106個(gè)單一克隆組成的A.ac-uleatus文庫。
從文庫的20個(gè)單一克隆中分離DNA并分析其cDNA插入。發(fā)現(xiàn)插入頻率＞90％且平均插入子大小大約為1400bp。
將一些庫中的DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中，從每個(gè)庫中獲得含200-500個(gè)酵母菌落的50-100個(gè)平板。生長3-5天后，瓊脂板復(fù)制涂布到幾組瓊脂板上。然后，一組平板在30℃培養(yǎng)2-4天并用一層酪蛋白覆蓋凝膠覆蓋以檢測蛋白酶活性。30℃培養(yǎng)過夜后，鑒定蛋白酶陽性菌落，為被白色暈圈包圍的菌落。
涂布酶陽性菌落的細(xì)胞使在其瓊脂上分布成單個(gè)菌落。挑選生產(chǎn)酶的單個(gè)菌落，用于鑒定每個(gè)生產(chǎn)蛋白酶的菌落。
以單個(gè)菌落的形式獲得陽性克隆，使用生物素標(biāo)記的多聚接頭引物直接從酵母菌落中擴(kuò)增cDNA插入子，用磁珠(Dynabead m-280，Dynal)系統(tǒng)純化，并使用鏈末端終止法(Sanger et al.，1977)和測序酶系統(tǒng)(United states Biochemical)分別對每個(gè)cDNA克隆的5’端測序來鑒定。兩個(gè)酶基因的DNA序列分別在SEQ ID Nos.1和2中顯示。
接著，按上面所述分離用于在 曲霉 中表達(dá)的編碼蛋白酶的cDNA并使用標(biāo)準(zhǔn)程序轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中。從每次轉(zhuǎn)化中分離2個(gè)大腸桿菌菌落并用剪切DNA插入子的限制性酶Hind III和XbaI分析。將這些克隆中的一個(gè)的DNA重新轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母菌株JG 169中。
測定了幾個(gè)陽性克隆的DNA序列。編碼蛋白酶的2個(gè)DNA序列分別在SEQ ID Nos.1和2中顯示。
實(shí)施例2為了在曲霉中表達(dá)基因，使用上述程序，經(jīng)用HindIII/XbaI或其它合適的限制性酶消化，在凝膠上進(jìn)行大小分離和純化從每個(gè)家族的一個(gè)或多個(gè)代表物中分離cDNA，接著連接到pHD414上，產(chǎn)生質(zhì)粒pAlP1和pAlP2。在大腸桿菌中擴(kuò)增后，根據(jù)上面所述的一般程序?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)米曲霉或黑曲霉中。米曲霉 轉(zhuǎn)化子試驗(yàn)將每個(gè)轉(zhuǎn)化子接種到含F(xiàn)G-4瓊脂的培養(yǎng)皿中央。30℃下培養(yǎng)5天后，用木栓旋孔裝置從菌落中心取出4mm直徑的瓊脂栓，將瓊脂栓包括于含0.5％酪蛋白和1％瓊脂糖，溶于pH5.5的緩沖液中的酪蛋白覆蓋凝膠中，40℃下培養(yǎng)過夜。按上面所述鑒定蛋白酶活性。有些轉(zhuǎn)化子的暈圈明顯要比米曲霉背景大。這證實(shí)了蛋白酶在米曲霉中的有效表達(dá)。挑選具有最高蛋白酶活性的8個(gè)轉(zhuǎn)化子并在YPG瓊脂上接種和保存。
分別將8個(gè)選出的轉(zhuǎn)化子從YPG瓊脂斜面接種到含F(xiàn)G-4和MDU-2培養(yǎng)基的500ml搖瓶中。充分?jǐn)嚢枰员ＷC通氣良好，發(fā)酵3-5天后，以2000g將培養(yǎng)液離心10分鐘并分析上清液。
從每份上清液中取15μl的體積加入在酪蛋白覆蓋凝膠(25ml鋪于13cm直徑的培養(yǎng)皿中)上挖出的4mm直徑的孔中。以培養(yǎng)后白色暈圈的形成來鑒定蛋白酶活性。飼養(yǎng)批量發(fā)酵隨后，使用上面所述的程序經(jīng)過對表達(dá)酶的米曲霉進(jìn)行飼養(yǎng)批量發(fā)酵來分別生產(chǎn)蛋白酶I和II。
實(shí)施例3蛋白酶I和II的鑒定從上面飼養(yǎng)批量發(fā)酵產(chǎn)生的上清液用于接上面材料和方法部分所述進(jìn)行鑒定。使用上面所述程序在pH5.5的條件下測定蛋白水解活性(HPU/l)。
抑制試驗(yàn)得到下面的結(jié)果
胃酶抑制劑對蛋白酶II的抑制表明它是一種胃蛋白酶型天冬氨酸蛋白酶。蛋白酶I不受胃酶抑制劑的抑制，因此不能鑒定為天冬氨酸蛋白酶陽性。另一方面，它在pH5的最佳活性表明它是一種酸性蛋白酶。
圖1顯示了pH活性曲線?？梢妰煞N酶都在pH5具有最佳活性，并且蛋白酶I比蛋白酶II在更窄的范圍內(nèi)有活性。因此，蛋白酶I在pH4-6的范圍內(nèi)表現(xiàn)出超過60％的活性，而蛋白酶II在pH4-7的范圍內(nèi)表現(xiàn)出超過60％的活性。
以SDS凝膠分析分別估計(jì)了蛋白酶I和II的分子量，分別為23,000和37,000KD。經(jīng)過IEF分析，估計(jì)兩種酶的PI都大約為4。
圖2顯示了溫度活性曲線。兩種酶非常相似，但最適溫度略有區(qū)別、蛋白酶I為50℃，蛋白酶II為45℃。
圖3和4顯示了pH穩(wěn)定性。對于每個(gè)pH，假定零時(shí)活性為100％，因此獲得的絕對值是不同的。兩種蛋白酶在pH4和5都穩(wěn)定，在pH6時(shí)，蛋白酶I不穩(wěn)定，而蛋白酶II具有一定程度的穩(wěn)定性(30分鐘后保留40％的活性)。兩種酶在pH7都不穩(wěn)定。
圖5和圖6顯示了溫度穩(wěn)定性。對于每一溫度、假定零時(shí)活性為100％，且獲得的絕對值是不同的。兩種蛋白酶在50℃仍穩(wěn)定，但在60℃不穩(wěn)定。
根據(jù)蛋白酶I和蛋白酶II水解胰島素和胰高血糖素獲得的結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白酶II不與胰島素反應(yīng)，而兩種蛋白酶都水解胰高血糖素?？傻贸鼋Y(jié)論蛋白酶I是一種相當(dāng)無特異性的蛋白酶，而蛋白酶II具有更高的特異性。發(fā)現(xiàn)蛋白酶II能分解在中胰高血糖素中發(fā)現(xiàn)的Lys-Tyr和Phe-Val鍵(這一序列見Bromer，Sinn，and Behrens，J.Amer.Chem.Soc.，Vol.79，P2807，1958)。
分別試驗(yàn)了本發(fā)明的蛋白酶I和II在去掉隱形眼鏡上的變性蛋白質(zhì)方面的能力。將它們與目前所用的絲氨酸蛋白酶及豬胃蛋白酶進(jìn)行了比較，盡管豬胃蛋白酶從技術(shù)前景上而不是商用前景上令人感興趣。
實(shí)驗(yàn)方案如下材料母雞溶菌酶(Hen Lysozyme)、L-6878，來自Sigma“Rythmic”隱形眼鏡來自Essilor(II型透鏡，高水，無離子)；蛋白酶I按上述生產(chǎn)；蛋白酶II按上述生產(chǎn)；豬胃蛋白酶，P-6887來自Sig-ma；枯草桿菌蛋白酶carlsberg，清潔透鏡蛋白酶(clear-Lens proR)(Novo Nordisk A/S)標(biāo)準(zhǔn)緩沖液0.05M Na2HPO4，0.9％NaCl，pH7.5。試劑緩沖液0.05M Na2HPO4，0.9％NaCl，3％H2O2，pH3.5。閃爍液Optiphase“Hisafe III”。
來自Sigma的母雞溶菌酶通過還原甲基化用14C來標(biāo)記并純化。
配制含0.05M Na2HPO4，0.9％NaCl和0.2mg/ml溶菌酶pH7.5的溶液。加入一定量的14C標(biāo)記的溶菌酶，使CPM(每分鐘計(jì)數(shù)值)大約為200，000。將1.0ml溶液轉(zhuǎn)移到向爍玻璃管中，加入隱形眼鏡并將玻璃管放入85℃水溶中處理30分鐘。
然后將隱形眼鏡在3×3ml的試劑緩沖液中漂洗。用解剖刀將它切成四塊，每塊轉(zhuǎn)移到含3ml試劑緩沖液的新閃爍玻璃管中。
加入不同量的試驗(yàn)蛋白酶使終濃度為0.1，0.5，2.5，5，12.5，50和200μg酶蛋白/ml試劑緩沖液。
反應(yīng)在25℃進(jìn)行超過4小時(shí)。在2×3ml標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中清洗1/4的透鏡。加入12ml閃爍液并在Packard 2500TR液閃計(jì)數(shù)器中測量CPM。
每種蛋白酶需要4個(gè)透鏡來評估在2天內(nèi)進(jìn)行2次測量，每個(gè)透鏡需要一個(gè)空白對照。
計(jì)算質(zhì)量相等的每個(gè)1/4塊透鏡中，在消毒/清潔過程中去掉的溶菌酶相對量。圖7給出了不同蛋白酶的效果圖。
兩種蛋白酶都非常適于隱形眼鏡的清潔目的。發(fā)現(xiàn)蛋白酶I與其它蛋白酶相比非常優(yōu)越。蛋白酶II的效果與豬胃蛋白酶非常相近，而目前使用的比氨酸蛋白酶表現(xiàn)出較差的效果。本發(fā)明的酸性蛋白酶的進(jìn)一步的優(yōu)勢在于在淚液中發(fā)現(xiàn)的中性pH下活性較低。這降低了由于消毒/清潔后未完全洗凈時(shí)透鏡引起刺激的危險(xiǎn)。
實(shí)施例6本發(fā)明的蛋白酶在烘烤中的應(yīng)用程序向10克糕粉中加入5.9g水。水中含有不同濃度的蛋白酶I、蛋白酶II和NeutraseR(從Novo Nordisk A/S獲得)。將生面在Glutamic22000混合器中混合一分鐘。然后將它放入塑料代中在32℃下溫育25分鐘。
然后使用Glutamic混合器以2％NaCl(水溶液)洗滌生面以去掉淀粉并留下生面中的面筋。
用手滾動面筋團(tuán)直到勻質(zhì)并將它壓入一個(gè)大約0.5cm高、直徑為2.5cm、中央有一孔的環(huán)形模子中。面筋團(tuán)在25℃壓30分鐘使成形。接著，將面筋環(huán)懸掛在鉤上并在孔中放入2g砝碼。所有物質(zhì)放入25℃的水下。
然后每15分鐘測量面筋環(huán)的伸展直到斷裂。
酶的用量根據(jù)Anson單位(AU)開始嘗試為7.5mAU/kg粉，這一用量是NeutraseR的最佳劑量。(在用于測定蛋白水解活性的An-son-血紅蛋白方法中，在溫度為25℃、pH7.5，反應(yīng)時(shí)間為10分鐘的條件下消化變性的血紅蛋白。用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血紅蛋白，用酚試劑測定TCA可溶性產(chǎn)物的量，酚試劑與酪氨酸和色氨酸產(chǎn)生藍(lán)色。1AU是指以起始速率消化血紅蛋白時(shí)每分鐘釋放的TCA可溶產(chǎn)品的量與酚試劑產(chǎn)生的顏色和1毫當(dāng)量的酪氨酸相同時(shí)的酶量)。
圖8顯示了不含酶和含有NeutraseR，蛋白酶I及蛋白酶II的面筋的伸長曲線。曲線意味著用相同劑量的酶測定6-7次，正如所見，所有3種蛋白酶的加入都導(dǎo)致面筋伸長得更快。
7.5mAU/kg粉劑量的蛋白酶I使面筋脆弱的程度不及相同劑量的NeutraseR。在它斷裂前，面筋環(huán)伸得更長且伸長速率較慢。
2.3mAU/kg粉的蛋白酶II的加入(在這一系統(tǒng)中這是可能的最大量)使面筋脆弱的程度幾乎與7.5 mAU/kg的NeutraseR一樣。面筋斷裂稍遲，且曲線的形狀不同。這表明蛋白酶II在使面筋脆弱中，其以AU為基礎(chǔ)的效力大約是NeutraseR的3倍。
總之，對于通常用于使面筋脆弱的化學(xué)制劑(廣泛使用的一個(gè)例子是SMS(Sodium netabisulphite))而言，本發(fā)明的蛋白酶是理想的選擇。
實(shí)施例7本發(fā)明的蛋白酶在動物飼料中的應(yīng)用在下面所述條件下將基本上脫脂的飼料規(guī)格大豆與去離水混合。水解分兩步進(jìn)行以模擬胃和小腸的pH條件。比較了本發(fā)明的蛋白酶II與Bio-Feed Pro的效果，后者由Brenes等1993證突當(dāng)用于烤焙飲食時(shí)引起重量收益改進(jìn)和飼料效率提高。水解條件水解混合物70g基本上脫脂的大豆330g去離子水溫度40℃pH第一步4.0
第二6.5時(shí)間第一步180分鐘第二步180分鐘酶第一步I)胃蛋白酶1.92g(Merckart.7190)II)I+Bio-Feed Pro 3.0L 5.5AU/kg大豆III)I+蛋白酶II 0.19 AU/kg大豆第二步I)胰酶6g(Sigma P1750)II)I+Bio-Feed Pro 3.0L 5.5AU/kg大豆III)I+蛋白酶II 0.19AU/kg大豆Bio-Feed ProR可從Novo Nordisk A/S獲得。蛋白酶II按上面所述獲得。
酶在開始0分鐘時(shí)加入。在水解過程中，隨著反應(yīng)的進(jìn)程測定白利糖度(Brix)和滲透壓。根據(jù)Adler-Nissen(1986)，滲透壓值可用于以下面的等式計(jì)算水解程度(DH) 其中△是滲透壓mOSM的增加，s％是蛋白質(zhì)濃度，ω是滲透壓、計(jì)的校準(zhǔn)系數(shù)，htot是蛋白質(zhì)底物中肽鍵的總數(shù)(mequv/g蛋白質(zhì))，fosm是將％轉(zhuǎn)化為g/kg H2O的系數(shù)。fosm=1000100-DM%=]]>進(jìn)一步分析了90分鐘(第一步)和0.15和180分別(第二步)后水解混合物N-成份磺基水楊酸可溶相的平均分子量。用下面方法進(jìn)行分子量分析1.原理樣品經(jīng)稀釋，過濾并注射到液相色譜系統(tǒng)中，以凝膠透過色譜(GPC)的方式操作。這種分離技術(shù)使液體流過填有孔直徑被精確限定的多孔顆粒的柱子。當(dāng)具有不同分子大小的肽溶液通過柱時(shí)，小肽能流進(jìn)孔中而大肽被孔排除。于是，由于大肽從柱中洗脫比小肽快，因此根據(jù)分子大小(和重量)將溶液中的肽分離。用檢測器在柱的出口連續(xù)測量流出物，用具有已知分子量的肽來校準(zhǔn)色譜系統(tǒng)。2.色譜裝置2.1 HPLC系統(tǒng)由下列部分組成高壓泵，WATERS M 510，流速為0.7ml/分鐘。
注射器，Waters WISP M 710檢測器，Waters M 440，波長延伸到214nm。2.2.GPC柱，3×TSK G 2000 SWXL，7.8mm×300mm，以一系列相連并在環(huán)境溫度下操作。2.3.綜合/數(shù)據(jù)處理，選擇810/820 GPC的Waters 820 MAximASIM色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)。3.試劑3.1.磷酸鹽緩沖液，NaH2PO4·2H2O3.2.氯化銨，NH4Cl3.3.三氟乙酸(TFA)，CF2COOH3.4乙腈，CH2CN3.5移動相
0.05M磷酸鹽緩沖液/含0.1％TFA和25％乙腈的0.5M氯化銨溶液。4.描述4.1.校準(zhǔn)經(jīng)注射已知分子量的為數(shù)眾多的多肽標(biāo)準(zhǔn)品的方法來校準(zhǔn)色譜系統(tǒng)。給出每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品分子量對為從柱上洗脫該多肽觀察到的所需移動相體積的半對數(shù)。經(jīng)計(jì)算最小值平方計(jì)算最適第3項(xiàng)多項(xiàng)式。曲線代表校準(zhǔn)曲線。4.2.分析樣品稀釋/溶解于移動相中達(dá)到大約5mg/ml。通過22μm濾膜過濾溶液并取20μl用于注射到色譜中。記錄檢測器讀數(shù)與洗脫體積。記錄的曲線(色譜圖)表示了樣品實(shí)際分子量的分布。為了便于計(jì)算(如計(jì)算累加的重量分布和平均分子量)，將色譜圖分成小的時(shí)間(和洗脫體積)片段，每個(gè)片段的特征為具有洗脫體積和在該時(shí)間間隔內(nèi)的色譜圖面積。5.計(jì)算以重量和數(shù)目平均分子量形式給出結(jié)果。M‾w=Σi(Ai*Mw,i)ΣiAi,M‾n=ΣiAiΣi(Ai/Mw,i),]]>其中Mw重量平均分子量Mn數(shù)目平均分子量Ai每片段色譜圖的面積，以在每段時(shí)間間隔內(nèi)累加的檢測器讀數(shù)來測量Mw.i每個(gè)片段相應(yīng)的分子量。以校準(zhǔn)曲線的方法使用該時(shí)間間隔內(nèi)的平均洗脫體積來計(jì)算該值。結(jié)果OBrix，mOSM和％DH的值在下面表中列出
用胃蛋白酶，B10-FEED PRO，蛋白酶II和胰酶水解飼料大豆
下面列出了分子量分析的結(jié)果
由于未消化的大豆蛋白質(zhì)在pH6.5的可溶性比在pH4.0時(shí)更強(qiáng)，因此當(dāng)pH調(diào)到6.5時(shí)表觀分子量增加。
可見蛋白酶II與Bio-Feed Pro相比釋放更多的蛋白質(zhì)和多肽，并降解更多的蛋白質(zhì)，因此可得出結(jié)論蛋白酶II優(yōu)于Bio-FeedPro。
由于本發(fā)明的蛋白酶II在酶性pH范圍具有最佳活性，因而該酶在動物胃中已開始作用，因此當(dāng)它用于幼年動物飼料中時(shí)，與Bio-Feed Pro相比會使飼料效率得到綜合提高。上面結(jié)果證實(shí)了這一結(jié)論。
序列描述(1)一般資料(i)申請人(A)姓名NOVO NOROISK A/S(B)街道NOVO Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國家丹麥(F)郵編(郵編號)DK-2880(G)電話+45 44448888(H)電傳+45 44493256(I)電報(bào)37304(ii)發(fā)明題目棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)蛋白酶(iii)序列數(shù)2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容性(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0.Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征(A)長度1124堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(iii)假定的非(iv)反義非(v)原始來源(A)微生物棘孢曲霉(xi)序列描述SEQ ID NO1AATTAAGCAT CCTCCATCTT CAAAGCTCAA TCTCGCTAAC TCCCGCTCTT CTCTCGATCT 60CATCATCCCA ATAACTCGGA CACAATGAAG ACCTCTGCTC TCTTGACCGC TGGCCTGTTG 120GCCACCGCTG CTATTGCTGC TCCTCTCACC GAGAAGCGCG CAGCTGCTCG CGCTGCCAAG 180CGTGGCACCA GCCGCAAGAG CAACCCCCCT CTCAAGCCCG GCACCAGCGA GGCCATCAAC 240CTGACCGGCT CCAAGAACAC CGAGTACTCG TCCAACTGGG CCGGCGCCGT GCTCATCGGC 300ACCGGCTACA CTGCCGTCAC CGCCGAGTTC ACCATTCCCA CCCCCTCTCT CCCCTCCGGT 360GCCTCCAGCC GCGAGCAGTA CTGTGCCTCC GCCTGGGTCG GTATCGACGG TGACACCTGC 420GACACCGCCA TCCTGCAGAC CGGTCTCGAC TTCTGTATCG AGGGCAGCAC CGTTAGCTAC 480GACGCCTGGT ACGAGTGGTA CCCCGACTAT GCCTACGACT TCAGCGGCAT CAGCTTCTCC 540GCCGGCGACG TTGTCAAGGT CACCGTCGAC GCCACCAGCA AGACCGCCGG TACCGCCACC 600GTCGAGAACG TCACCAAGGG CACCACCGTC ACCCACACCT TCAGCGGTGG TGTTGATGGT 660GATCTCTGCG AGTACAACGC CGAGTGGATC GTCGAGGACT TCGAGGAGAA CTCCTCCCTC 720GTCCCCTTCG CCGACTTCGG CACCGTCACC TTCTCCAGCG CCTACGCCAC CAAGAGCGGC 780TCCACCGTTG GTCCCTCCGG CGCCACCATC ATCGACATCG AGCAGAACAA CAAGGTTCTC 840ACCTCCGTCT CGACCTCCAG CAGCTCCGTC ACCGTCGAGT ATGTTTGAAG GGGACTCCTG 900GGGATGTGAA GCGAGAATGC GGCTTGGGTG GTTGGAGGTC CTTTGGGACG TCGAACGCCT 960AGGATTCAAC GGGATGAGAT CATTGGAAAT GAAGACGAGA ATGAGCGAAT ACTGTCACTG1020ATTGAGATTG TGCTTTGTTG ATTGTGTTAG GGGCTTGCCT CTGAAAATTG AGCTTAGTGT1080TGCTGCAATA TGATTGCTGT GGTTGAGAAA AAAAAAAAAA AAAA 1124(2)SEQ ID NO2(i)序列特征(A)長度1425堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(iii)假定的非(iii)反義非(vi)原始來源(A)棘孢曲霉(xi)序列描述SEQ ID NO2CTGCTTCTCC TTCTCTTCCT CCTCGTGATA TCTGCTTGAA CATCTCCTCA TCATGGTCGT60CCTCAACAAG GCTGCAGCCC TTCTTCTGGG TCTGACCACC GCCGCCACTG CGGCTCCCCT 120GGCCGAGAAG CAGGCTTCTG TCCCGGTCAA GAACTTCTCC GTCAAGCAGG TCGAGAAGGA 180GGGCAGCAAG GGACGTACCG TTAACCTGCC GGGTCTGTAT GCGAATGCGC TGGCCAAGTA 240TGGCGCCCAG GTGCCGGCCA GCGTCAAGGC CGCCGCCGTC AGTGGCAGCG TCGTGACCAC 300CCCGCAGGCC AACGACGTCT CCTACCTGAC CCCCGTCACC GTGGGCAGCT CGACCTTGAA 360CCTGGACTTC GACACCGGAT CCGCCGATCT CTGGGTCTTC TCCTCGGAGC TGGCCGCCTC 420CTCGCGCACC GGCCACAGCA TCTACACCCC CGGCAGCACC GCCCAGAAGC TGTCCGGCTA 480CAGCTGGAGC ATCTCCTACG GCGACGGCAG CTCCGCCAGC GGCGACGTCT ACAAGGACAA 540GGTCACCGTC GGCACGGTGA CGGCCAGCAG CCAGGCCGTC GAGGCCGCCA GCCGCATCAG 600CTCCGAGTTC GTCCAGGACA CCGACACCGA CGGTCTGTTG GGTCTGGCCT TCAGCTCGAT 660CAACACGGTC TCCCCCCGGG CCCAGACCAC CTTCTTCGAC ACCGTCAAGT CCAGCCTGGA 720CAGCCCCCTC TTCGCCGTCG ACCTGAAGTA CCACGCCGCC GGTACCTACG ATTTCGGGTT 780CATCGACTCC TCCAAGTACA CCGGCTCCCT GACCTACGCC AACGTCGACG ACTCCCAGGG 840CTTCTGGCAA TTCACCGCCA GCGGCTACAG CGTGGGCTCG GCCTCCCACT CCTCCTCTTT 900CTCCGCCATT GATGACACCG GCACCACCCT CATCCTCCTC GACGACTCCA TCGTCTCCAC 960CTACTACAAG AGCGTCAGCG GCGCCTCCTA CAGCTACAAC TACGGCGGCT ACGTCTTCTC 1020CTGCTCCGCC AGCCTGTCCA ACTTCAGCGT CAAGATCGGC TCCTACACCG CCGTCGTCCC 1080CGGCAAGTAC ATCAACTACG CCCCCATCTC CACCGGCAGC TCCACCTGCT ACGGCGGCAT 1140CCAGTCCAAC GAGGGCCTCG GTCTGTCCAT CCTGGGTGAT GTCTTCCTCA AGAGCCAGCA 1200CGTGGTGTTT GACTCGCAGG GTCCGAGAAT CGGGTTCGCC GCGCAGGCCT AGATCGTTTG 1260ATTGGGGTTG TGGATGTGGG TGATGCTTGG TGGTGGTCTG AGTCGTGGTC TATGTGGGCG 1320TGAATATAGT ACTGTATATA GTACTGTACA TAGGGGGGTG GTGAACATAT GGTCTGGTCG 1380ATGAATATAT GTCTTTGATG TTATGCTTCT GTGGAAAAAA AAAAA 1425
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權(quán)利要求
1.一種DNA構(gòu)建體，包含編碼表現(xiàn)出蛋白酶活性的酶的DNA序列，該DNA序列包含SEQ ID NO.2所示DNA序列或具有與SEQ ID No.2所示DNA序列存在至少80％同源性的類似序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中所述類似序列與SEQ IDNO2所示DNA序列存在至少90％同源性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中所述類似序列與SEQ IDNO2所示DNA序列存在至少95％同源性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中編碼表現(xiàn)出蛋白水解活性的酶的DNA序列可從微生物中獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的DNA構(gòu)建體，其中的DNA序列可從絲狀真菌或酵母中獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA構(gòu)建體，其中的DNA序列可從曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、木霉屬(Trichoderma)，青霉屬(Penicillium)，鐮孢屬(Fusarium)，Schytalidium或腐質(zhì)霉屬(Humicola)的菌株中獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建體，其中的DNA序列可從曲霉屬菌株中獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的DNA構(gòu)建體，其中的DNA序列可從棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株中獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的DNA構(gòu)建體，其中的DNA序列以棘孢曲霉CBS 101.43DNA文庫為基礎(chǔ)分離或產(chǎn)生。
10.一種重組表達(dá)載體，包含根據(jù)權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建體。
11.一種細(xì)胞，包含根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求10的重組表達(dá)載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的細(xì)胞，它是一種真核細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的細(xì)胞，它是真菌細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的細(xì)胞，它是酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中的細(xì)胞屬于曲霉屬菌株。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中的細(xì)胞屬于黑曲霉或米曲霉菌株。
17.一種生產(chǎn)表現(xiàn)出蛋白水解活性的酶的方法，該方法包含在能使酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求11-16任一項(xiàng)的細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收該酶。
18.一種表現(xiàn)蛋白水解活性的酶，該酶由根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建體編碼或由根據(jù)權(quán)利要求17的方法生產(chǎn)。
19.具有蛋白酶活性的酶，該酶的pH低于7和在高達(dá)5％過氧化氫存在時(shí)具有活性。
20.一種具有蛋白酶活性的酶，該酶優(yōu)選水解牛胰高血糖素中的Phe-Val或Lys-Tyr連接鍵。
2 1.根據(jù)權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)的酶，它與抗棘孢曲霉CBS101.43中得到的，由SEQ ID NO.2所示DNA序列編碼的純化蛋白酶的抗體可發(fā)生免疫反應(yīng)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的酶，它可以從微生物中獲得。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的酶，它可從細(xì)菌或真菌中獲得。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的酶，它可從曲霉屬，根霉屬、木霉屬、青霉屬、鐮孢屬、Schytalidium或腐質(zhì)霉屬的菌株中獲得。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的酶，它可從棘孢曲霉菌株中獲得。
26.可用于降解植物細(xì)胞壁成份的酶制品，所說的制品富含根據(jù)權(quán)利要求18-25任一項(xiàng)的表現(xiàn)出蛋白酶活性的酶。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的制品，它還包含一種或多種其它植物細(xì)胞壁降解酶。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的酶制品，其中所述其它植物細(xì)胞壁降解酶選自下述中的一種或多種果膠裂解酶，果膠酸鹽裂解酶，萄聚糖內(nèi)部裂解酶，阿拉伯聚糖酶，木聚糖酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶，甘露聚糖酶，α-半乳糖苷酸，鼠李半乳糖醛酸酶，果膠乙酰脂酶，多聚半乳糖醛酸酶，蛋白酶，肽鏈端解酶或果膠甲酯酶。
29.根據(jù)權(quán)利要求18-25任一項(xiàng)的酶或根據(jù)權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)的酶制品在含蛋白質(zhì)物質(zhì)的降解或修飾中的應(yīng)用。
30.根據(jù)權(quán)利要求18-25中任一項(xiàng)的酶或根據(jù)權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)的酶制品在隱形眼鏡清潔中的應(yīng)用。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的應(yīng)用，其在H2O2存在的條件下進(jìn)行。
32.根據(jù)權(quán)利要求3 1的應(yīng)用，其在3％H2O2存在的條件下進(jìn)行。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32的應(yīng)用，其中與過氧化氫酶組合以中和H2O2。
34.根據(jù)權(quán)利要求18-25任一項(xiàng)的酶或根據(jù)權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)的酶制品在烘烤產(chǎn)品制備中的應(yīng)用。
35.根據(jù)權(quán)利要求18-25任一項(xiàng)的酶或根據(jù)權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)的酶制品在動物飼料制備中的應(yīng)用。
全文摘要
一種DNA構(gòu)建體包含編碼表現(xiàn)出蛋白酶活性的酶的DNA序列之DNA構(gòu)建體，其中的DNA序列包含SEQ ID NO.1或2所示的DNA序列或與SEQ ID NO.1或2所示DNA序列具有至少80％同源性的這些序列的任一類似物。由該DNA序列編碼的蛋白酶具有酸性的最適pH值。
文檔編號C11D3/39GK1412310SQ0212208
公開日2003年4月23日 申請日期2002年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月6日
發(fā)明者H·達(dá)伯格, S·克里斯高, L·N·安德森, L·V·考福德, M·S·高品恩, J·B·尼爾森, C·達(dá)姆曼 申請人:諾沃奇梅茲有限公司