一種酶法合成阿魏酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是一種川芎咖啡酸-〇甲基轉(zhuǎn)移酶（以下均縮 寫為C0MT)基因在體外異源高效原核表達(dá)的重組大腸桿菌的基因工程菌株構(gòu)建并通過咖 啡酸甲基化轉(zhuǎn)化成阿魏酸的酶法轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 阿魏酸是植物界普遍存在的一種酚酸，化學(xué)名稱為4-羥基-3甲氧基肉桂酸。它有 許多保健功能，如清除自由基、抗血栓、抗菌消炎、抑制腫瘤、防治高血壓、心臟病、增強(qiáng)精子 活力、抑制人表皮黑素細(xì)胞增殖、黑素合成及酪氨酸酶活性等，應(yīng)用于保鍵化妝品領(lǐng)域。阿 魏酸在食品工業(yè)中主要用于制備天然香蘭索、抗氧化劑、防腐劑、交聯(lián)劑和機(jī)能促進(jìn)劑等， 同時(shí)阿魏酸阿魏酸毒性低，易于為人體代謝，在醫(yī)學(xué)上治療心腦血管疾病，保護(hù)肝臟、腎臟， 抗炎以及治療白內(nèi)障等疾病方面很有價(jià)值，應(yīng)用前景廣泛。
[0003] 目前阿魏酸可通過化學(xué)合成法和提取法等四類方法獲得?；瘜W(xué)合成法多以香蘭醛 和丙二酸為原料，以無水吡啶為溶劑，哌啶作催化劑，通過縮合反應(yīng)獲得。但是該法反應(yīng)時(shí) 間過長(zhǎng)、易產(chǎn)生順反混合體、溶劑用量大，產(chǎn)率低。第二類是采用不同提取方法從不同材料 中提取，比如工業(yè)上主要采用堿法分解米糠中的谷維素生產(chǎn)高純度的阿魏酸，但是該 法產(chǎn)量低、產(chǎn)生環(huán)境污染且成本高，從而制約了阿魏酸大規(guī)模的生產(chǎn)及應(yīng)用。第三類是采 用水解法從阿魏酸酯制備阿魏酸、阿魏酸鈉；第四類方法是生物合成法，比如用幾種微生物 (ArthrobacterBlobiformis)將丁香油中提取得到的丁子香酷肉桂酸醋轉(zhuǎn)化為阿魏酸。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的以上不足，本發(fā)明的目的是提供一種酶法合成阿魏酸的方法，并 使其具有工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化成本低等優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過如下的手段實(shí)現(xiàn)的。
[0006] 一種酶法合成阿魏酸的方法，將S-腺苷甲硫氨酸（SAM)上的甲基轉(zhuǎn)移至咖啡酸 上，最終形成產(chǎn)物阿魏酸，包括以下步驟：
[0007]a)通過大腸桿菌的發(fā)酵高效表達(dá)川芎C0MT，通過離心收集菌體，用Tris-HCl緩沖 液重懸菌體，超聲裂解菌體，獲得含有川芎C0MT酶的混合酶液；
[0008]b)由a)所獲川芎C0MT將SAM提供的甲基轉(zhuǎn)移至咖啡酸，最后轉(zhuǎn)化成阿魏酸。
[0009] 在實(shí)際實(shí)施過程中，上述a)步驟包含如下具體工藝：
[0010] A構(gòu)建生產(chǎn)轉(zhuǎn)化菌株：
[0011] 1).用分別帶有EcoRl和BamHl雙酶切位點(diǎn)的引物（A1:CGCGGATCCATGAATACGGAG CTGATCCCACC;A2 :CGGAAITCACATTAAGCAGATGCCAGACACCC)從川芎cDNA中通過PCR擴(kuò)增出川 芎C0MT基因的全長(zhǎng)閱讀框；
[0012] 2)?將擴(kuò)增出來的川芎C0MT基因片段和pET28a分別用EcoRl和BamHl雙酶切 消化，獲得兩端帶有粘性末端的片段；用T4DNA連接酶連接兩個(gè)片段，體系為10*T4DNA ligasebuffer2.5ul、雙酶切后的川芎COMTDNA片段6ul、雙酶切后的pET28a載體2ul、T4DNAligaselul，用滅菌的雙蒸水補(bǔ)足25ul;16°C連接過夜；獲得連接好的重組質(zhì)粒；
[0013] 3).取10ul重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化成功的重組BL21基因工程菌 涂布于含有50mg/L卡那霉素的平板中篩選陽性克??；
[0014] 4.將初步篩選出來的重組菌株用菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定后，經(jīng)測(cè)序以確定閱 讀框的正確，得到預(yù)期的重組菌株。
[0015] B發(fā)酵擴(kuò)大重組菌株
[0016] 1).發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L;溶解后，高溫高壓 滅菌；
[0017] 2).發(fā)酵條件：37°C，200rpm將重組菌株培養(yǎng)至0D600 = 0. 6 ;加入IPTG，使其終濃 度為ImM/L，17~20°C培養(yǎng)8~10h。
[0018] 在實(shí)際實(shí)施過程中，上述b)步驟包含如下具體工藝：：
[0019] 1).將獲得的發(fā)酵液4°C，5000g離心10min離心收集菌體。
[0020] 2).用10ml20mM的Tris-HclpH7. 9的緩沖液重懸菌體，超聲裂解菌體。超聲程 序?yàn)?0W，工作9s、暫停6s，冰浴條件下重復(fù)199次。4°C，13000g離心去除細(xì)胞碎片。收集 上清，獲得含有川芎C0MT的混合酶液。
[0021] 3)反應(yīng)體系：500uM的咖啡酸，ImMSAM，lOOmMMgC12,ImMDIT，lOOmM的磷酸鉀緩 沖液100ml，l-5ml的混合酶液；
[0022] 4)37°C靜置6~8h;加5-10ml濃HC1，終止反應(yīng)；
[0023] 5)用乙酸乙酯萃取4次，獲得阿魏酸粗提液。
[0024] 采用本發(fā)明方法，具有工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化成本低等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0025] 圖1本發(fā)明的技術(shù)路線圖。
[0026] 圖2重組質(zhì)粒pET28a-C0MT的質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】：
[0027] 實(shí)施例1 :pET28a-C0MT重組質(zhì)粒的構(gòu)建：
[0028] 1.pET28a質(zhì)粒為Novagen公司產(chǎn)品，大小為5369bp，含有一個(gè)17強(qiáng)啟動(dòng)子，一個(gè) 卡那霉素抗性基因，乳糖抑制子lacI基因。
[0029] 2.設(shè)計(jì)兩條包含川芎C0MT完整閱讀框以及正向含BamHl、反向含EcoRl兩個(gè)酶切 位點(diǎn)的表達(dá)引物（A1:CGCGGATCCATGAATACGGAGCTGATCCCACC;A2:CGGAAITCACATTAAGCAGATG CCAGACACCC)，從川芎cDNA中通過PCR擴(kuò)增出兩端含有BamHl和EcoRl兩個(gè)酶切位點(diǎn)的川 芎C0MT片段。PCR體系為：Primerstarmix(寶生物公司）25ul、cDNA2ul、引物1 2ul、引 物 2 2ul，雙蒸水補(bǔ)足 50ul。PCR體系為 94°C5min，94°Clmin、66 ~68°Clmin、72°C2min， 35 個(gè)循環(huán)，72°C10min，4°Cm。
[0030] 3.膠回收后用BamHl和EcoRl分別雙酶切擴(kuò)增出的川芎COMT片段和pET28a載體。 酶切體系為：BamH10.5ul，EcoR10.5ul，10*KBuffer2ul，DNA片段 9ul，雙蒸水補(bǔ)足 20ul。 37°C酶切4h。膠回收后獲得兩端分別含粘性末端的川芎COMTDNA片段和pET28a質(zhì)粒
[0031] 4?采用T4DNA連接兩個(gè)粘性末端，體系為10*T4DNAligasebuffer2. 5ul、雙酶切 后的川芎COMTDNA片段6ul、雙酶切后的pET28a載體2ul、T4DNAligaselul，用滅菌的 雙蒸水補(bǔ)足25ul。16°C連接過夜。獲得連接好的重組質(zhì)粒。
[0032] 5.將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含10g/L蛋