鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法，該技術(shù)可直接應(yīng)用于羊及其他動物肌肉的生物化學(xué)研究。
【背景技術(shù)】
[0002]醫(yī)學(xué)等生命科學(xué)研究領(lǐng)域通常是通過同位素標(biāo)記法檢測生物體內(nèi)鈣蛋白酶的磷酸化水平，但同位素標(biāo)記檢測的方法繁瑣，且對人體的潛在傷害很大。但是，對于磷酸化鈣蛋白酶的生化變化進(jìn)行研究分析，以及對其他動物肌肉生理生化的研究來說，鈣蛋白酶的磷酸化是科學(xué)研究中必不可少的。雖然現(xiàn)有技術(shù)中也有針對蛋白酶磷酸化水平測定的較為安全的方式，但是由于鈣蛋白酶較為敏感，極易受外界環(huán)境影響，導(dǎo)致活性降低甚至失活等特性。故此，目前還沒有專門針對鈣蛋白酶磷酸化水平檢測的方法。因此，一種對人體安全、檢測快速準(zhǔn)確地測定鈣蛋白酶的磷酸化的方法是亟需的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。
[0004]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種鈣蛋白酶粗樣品的提取方法，通過本發(fā)明的組織裂解液提取的蛋白樣品中鈣蛋白酶的含量較高、活性較高，解決了在磷酸化水平測定過程中鈣蛋白酶容易部分失活或全部失活的問題。
[0005]本發(fā)明再有一個(gè)目的是提供一種鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法，本發(fā)明通過利用蛋白免疫沉淀和蛋白免疫技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對鈣蛋白酶磷酸化水平的測定，解決了現(xiàn)有方法中測定磷酸化水平時(shí)對人體危害較大和操作過程繁瑣等問題。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0007]一種鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法，包括:
[0008]步驟一、將含有鈣蛋白酶的蛋白樣品的蛋白濃度調(diào)至5.83?12.5 μ g/ μ 1，之后向其中加入磷酸化抗體，所述磷酸化抗體與所述含有鈣蛋白酶的蛋白樣品中的蛋白的總反應(yīng)量的質(zhì)量比為1:1750?2500，然后將含有鈣蛋白酶的蛋白樣品與磷酸化抗體于4°C下震蕩孵育，以形成免疫復(fù)合物，再通過蛋白質(zhì)免疫沉淀方法富集得到磷酸化的鈣蛋白酶樣品；以及，
[0009]步驟二、通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述步驟一中得到的所述磷酸化的鈣蛋白酶樣品的磷酸化水平。
[0010]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法中，所述步驟一中，通過蛋白質(zhì)免疫沉淀方法富集得到所述磷酸化的鈣蛋白酶樣品的具體步驟包括:
[0011]1.1)取Protein A/G瓊脂糖樹脂楽液并使其吸附在離心柱上，其中，所述ProteinA/G瓊脂糖樹脂漿液與所述鈣蛋白樣品的體積比為2?3:40?60，且每個(gè)離心柱內(nèi)加入的所述Protein A/G瓊脂糖樹脂漿液的體積為20-30 μ 1 ;
[0012]1.2)將所述免疫復(fù)合物加入經(jīng)過步驟1.1)處理后的吸附有所述Protein A/G瓊脂糖樹脂的所述離心柱中，并于4°C恒溫震蕩孵育lh，之后離心，然后使用IP洗滌緩沖液洗滌所述Protein A/G瓊脂糖樹脂三次，再用IP條件緩沖液洗滌所述Protein A/G瓊脂糖樹脂一次，最后所述離心柱上截留的即為鈣蛋白酶、磷酸化抗體和Protein A/G瓊脂糖樹脂的三元復(fù)合物；和，
[0013]1.3)向步驟1.2)中截留有所述三元復(fù)合物的所述離心柱中添加還原性上樣緩沖液，并于100°C下孵育5min，冷卻后在室溫下lOOOOXg離心lmin，所得的流穿液體即為富集的所述磷酸化的鈣蛋白酶樣品。
[0014]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法中，所述步驟二中，在通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述磷酸化的鈣蛋白酶樣品的磷酸化水平過程中，與所述鈣蛋白酶反應(yīng)的第一抗體采用μ -calpain單克隆抗體，所述第一抗體的濃度為1.4-2 μ g/ml。
[0015]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法中，所述步驟二中，在通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述磷酸化的鈣蛋白酶樣品的磷酸化水平過程中，與所述第一抗體結(jié)合的第二抗體采用ant1-mouse IgG，所述第二抗體的濃度為0.1-0.3 μ g/ml。
[0016]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法中，在所述步驟一之前還包括提取所述含有鈣蛋白酶的蛋白樣品的方法:
[0017]采集動物肌肉樣品，并按照質(zhì)量體積比1:6將所述動物肌肉樣品加入組織裂解液或者肌漿抽提液中，將所述動物肌肉樣品和所述組織裂解液于冰上勻漿至所述動物肌肉樣品和所述組織裂解液形成均一的勻漿液，然后將所述勻漿液于4°C下離心收集上清液即得到所述含有鈣蛋白酶的蛋白樣品；且所有步驟均在冰上操作或冰浴操作；
[0018]其中，所述組織裂解液包含濃度為25mM的N- 二甘氨酸和150mM的氯化鈉，所述組織裂解液的pH為7.6 ;
[0019]所述肌漿抽提液包含濃度為lOOmM的Tris base、10mM的EDTA和0.05%的巰基乙醇，所述肌漿抽提液的pH為8.3。
[0020]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法中，所述組織裂解液中還包含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，且所述磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑均需現(xiàn)用現(xiàn)加；
[0021]所述勻漿過程在冰上共進(jìn)行30s，且每次勻漿時(shí)間為10s，每兩次勻漿之間間隔20so
[0022]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法中，所述步驟一中，所述磷酸化抗體和所述含有該蛋白酶的蛋白樣品的總體積為400-600 μ 1，所述含有鈣蛋白酶的蛋白樣品中蛋白的總反應(yīng)量為3500-5000 μ go
[0023]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法中，所述步驟一中，所述磷酸化抗體的濃度為0.2-0.3 μ g/ μ 1，所述磷酸化抗體采用磷酸化絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸泛抗單克隆抗體。
[0024]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法中，所述步驟一中，所述含有鈣蛋白酶的蛋白樣品與磷酸化抗體于4°C下震蕩孵育2_14h，以形成所述免疫復(fù)合物。
[0025]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測定方法中，所述動物肌肉樣品取自羊。
[0026]本發(fā)明至少包括以下有益效果:
[0027]本發(fā)明的方法通過蛋白質(zhì)免疫沉淀和免疫印跡技術(shù)同樣可以在宰后肌肉中檢測出磷酸化的鈣蛋白酶，所需的肌肉樣品量少，操作過程較為簡單，重復(fù)性好，檢測所得條帶清晰，試驗(yàn)方法對人體的潛在傷害小，是一種高效測定宰后肌肉中μ -calpain磷酸化水平的方法。利用該方法可對羊骨骼肌中磷酸化鈣蛋白酶的生化變化進(jìn)行研究分析，也可延伸至其他動物肌肉生理生化的研究。
[0028]本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中4-氯-1-萘酚顯色法后的成像圖；
[0030]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中ECL顯色法后的曝光成像圖；
[0031 ]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中的ECL顯色法后的PVDF膜成像圖；
[0032]圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中的ECL顯色法后的曝光成像圖；
[0033]圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中的ECL顯色法后的曝光成像圖；
[0034]圖6為本發(fā)明實(shí)施例5中的ECL顯色法后的曝光成像圖；
[0035]圖7為本發(fā)明實(shí)施例5中曝光成像圖的Quantity One軟件分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0037]應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。
[0038]本發(fā)明中用到的試劑和試劑盒:
[0039]組織裂解液:25mM N_ 二甘氨酸，150mM氯化鈉，添加磷酸酶抑制劑(Roche，每10ml添加1片)和蛋白酶抑制劑(Roche，每50ml添加1片)，pH 7.6 ;
[0040]肌漿抽提液:lOOmMTris base，10mM EDTA，0.05%巰基乙醇，ρΗ8.3[0041 ]磷酸化抗體:phospho-Ser/Thr/Tyr antibody, Abeam abl5556:
[0042]2X 還原性上樣緩沖液:10% SDS 4mL，甘油 2mL，0.5M Tris-HCl pH6.82mL，1M DTT2.0mL，溴酸藍(lán) 0.0lg:
[0043]8% 的分離膠:雙蒸水 4.68ml，1.5M Tris-Hcl pH8.82.5ml, 10% SDS 100 μ 1，30% Acr-Bis(37.5:1)2.67ml，TEMED 5 μ 1，10%過硫酸銨 50 μ 1 ；
[0044]4% 的濃縮膠:雙蒸水 3.05ml，0.5Μ Tris-HCl (pH6.8) 1.25ml, 10 % SDS 50 μ 1,30% Acr-Bis(37.5:1)0.65ml，TEMED 5 μ 1，10%過硫酸銨 25 μ 1 ；
[0045]TBS 緩沖液:Tris 1.21 lg，NaCl 8.76g，lmol/L 的 HC1 調(diào) pH 至 7.5 ;
[0046]封閉液中包含:TBS50ml/L，Tween2025 μ 1/L，BSA 1.5g/L:
[0047]TBST1:每 500mLTBS 加 0.5mL Tween20 ；
[0048]