專利名稱：木聚糖酶活力的測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種測定木聚糖酶活力的方法，具體涉及用MBTH法測定木聚糖 酶活力的方法尤其涉及測定過程中關鍵參數(shù)的選擇。
背景技術：
木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶。近年來，因其在造紙工 業(yè)、食品工業(yè)、飼料工業(yè)、能源工業(yè)和環(huán)境科學等方面都具有較大的應用價值而引起 科研工作者的廣泛關注，并對其進行了相關研究。酶活力是衡量酶生物活力的重要指 標。木聚糖酶屬多糖水解酶，目前常用DNS法測定其酶活力，具體方法是分別取具有 一定濃度梯度的木糖溶液2mL于試管中，加入1.5-2. 5mLDNS試劑，混勻，在沸水浴 中加熱5-15分鐘，立即用冷水冷卻至室溫，加水定容至10-25rol,混勻，在540nm處 測吸光度A值?；厥章蕼y定以木糖樣品采用標準品隨行對照法分別加入不同量的標 準木糖溶液，方法同上，測定木糖含量并計算回收率。雖然此法簡便、快捷，但靈敏 度相對較低，不利于某些科學研究和產(chǎn)品質(zhì)量控制。
3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)可以與不同類型的有機化合物反應，例如含有 亞甲基的化合物，芳族胺類，羰基化合物，Schiff堿，糖類，苯酚類，甾類化合物等。 測定不受低濃度醋酸鹽和琥珀酸鹽緩沖液的干擾，對于不同聚合度的同類還原糖，其 還原端的顯色吸光系數(shù)基本相同。因此MBTH法的應用面不同，所采用的各項測定條 件也有所不同。3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法常用于微量甲醛含量的測定，如 果將此法用于木聚糖酶活力測定需要選擇適宜的酶活力測定條件，提高測定結果的準 確性。

發(fā)明內(nèi)容
針對己有技術的不足，本發(fā)明提供一種木聚糖酶活力的測定方法，該方法采用 3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法來測定木聚糖酶活力。以下詳細介紹本發(fā)明一種木聚糖酶活力的測定方法，A，制作用MBTH法測得的木 糖吸光度值與木糖濃度的標準對應關系曲線；B，用MBTH法檢測待測木聚糖酶水解木 聚糖后產(chǎn)生的相當于木糖的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作的木糖濃度與測得的木糖吸 光度值之間的標準對應關系曲線確定待查木聚糖酶的酶解產(chǎn)物中在單位時間內(nèi)所產(chǎn) 生的相當于木糖的還原糖的含量，以此來推算木聚糖酶的活力。
優(yōu)化地；上述步驟A的具體步驟是；作用MBTH法測得的木糖吸光度值與木糖濃 度標準對應關系曲線；分別取6-15組不同濃度(O-O. 032mg/mL)的木糖標準溶液2mL， 加入2mL 0. 5當量的NaOH溶液，混勻，取1. 2mL加入到試管中(做三個平行樣)，再 加入MBTH試劑0. 6mL于75-85'C水浴加熱15-30min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL， 室溫冷卻后于波長620-680nm處測定木糖的吸光度值；根據(jù)每組木糖濃度與測得的木
糖吸光度值之間的關系繪制標準對應關系曲線；
優(yōu)化地；上述步驟B的具體步驟是；用MBTH法檢測木聚糖酶的活力；將9. 9mL 木聚糖溶液其濃度為2-4mg /mL，加入到錐形瓶中于25-4(TC的水浴搖床中預熱 8-12min，加入預熱至相應溫度的木聚糖酶溶液0. lmL進行水解反應，水解時間為 30min，取水解液2mL，迅速加入到2mL 0. 5當量的NaOH溶液中，混勻，取1.2mL加 入到試管中(做三個平行樣)，再加入MBTH試劑0. 6mL于75—85"水浴加熱15-30min 后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL，室溫冷卻后于波長620-680nm處測定吸光度值，根 據(jù)上一步驟制作的木聚糖酶的活力與測得的木糖吸光度值之間的標準對應關系曲線 確定待查木聚糖酶的活力；木聚糖酶的活力單位可被定義為在上述條件下每分鐘產(chǎn)生 lnM相當于木糖的量為一個酶活力單位。其中MBTH試劑的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶液等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配， 一天內(nèi)有 效。
優(yōu)化地；上述硫酸鐵銨試劑的制法是0.5W(FeNH4(SOj2) 12H20, 0.5%氨基磺酸， 0.5當量鹽酸。
優(yōu)化地；上述木聚糖為樺木(birchwood)木聚糖或櫸木(beechwood)木聚糖。 優(yōu)化地；上述木聚糖以50mM的丁二酸緩沖溶液或醋酸緩沖溶液為溶劑。 優(yōu)化地；上述測定吸光度值的最佳波長為650nm。本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明用MBTH法對木聚糖酶水解木聚糖后所產(chǎn)生的木糖端基的 數(shù)量進行檢測以此來確定木聚糖酶的活力；木糖以及低聚木糖是木聚糖酶水解的最終 產(chǎn)物，因此對木糖端基含量檢測的靈敏度直接決定著對木聚糖酶活力檢測的靈敏度。 該方法測木糖的檢測限和工作濃度范圍都明顯低于DNS法，所以本方法的靈敏度明顯 高于DNS法。
具體實施方式
實施例1:
主要儀器水浴恒溫振蕩器，SHZ-82型，國華電器有限公司；數(shù)字酸度計，上
海大普儀器有限公司；721可見光分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；UV-2550 紫外可見分光光度計，SHIMADZU;木聚糖，來源于beechwood， sigma;木糖，sigma; 木聚糖酶(標準酶)，寧夏和氏璧生物技術有限公司，武漢新華揚生物有限責任公司。 溶液配置
MBTH顯色液3mg/raL的3_甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶 液等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配， 一天內(nèi)有效。
木糖標準溶液(0.032mg/mL):精確稱取干燥至恒質(zhì)量的木糖0. 3200g,用50mM pH5. 5的醋酸緩沖溶液溶解、轉移并定容至100mL，配成3. 2mg/mL的木糖標準溶液； 從中取lmL木糖溶液，如前法操作并定容至100mL，即得0. 032mg/mL的木糖標準溶 液。
硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5%(FeNH4(S04)2) '12仏0, 0. 5%氨基磺酸，0. 5當量鹽酸。 步驟A，制作用MBTH法測得的木糖吸光度值與木糖濃度的標準對應關系曲線； 分別加入8組不同濃度的木糖標準溶液2mL，加入2mL 0. 5當量的NaOH溶液， 混勻，取1.2mL加入到試管中(做三個平行樣)，再加入MBTH試劑0.6mL于8(TC水 浴加熱15-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL，室溫冷卻后于波長650nm處測定 木糖的吸光度值；根據(jù)每組木糖溶液濃度與測得的相應木糖吸光度值之間的關系繪制 標準對應關系曲線；
B，用MBTH法檢測木聚糖酶的活力；將9. 9mL木聚糖溶液其濃度為4mg/mL， pH值為5.5，加入到錐形瓶中于3(TC的 水浴搖床中預熱10min，加入待測的木聚糖酶溶液O. lmL進行水解反應，為確定合適 的待測木聚糖酶濃度可以將待測的木聚糖酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個檢測，水解 時間為60min以內(nèi)，取水解液2mL，迅速加入2mL 0. 5當量的NaOH溶液中(做三個 平行樣)，混勻，取1. 2mL加入到試管中，再加入MBTH試劑0. 6mL于75—85。C水浴 加熱20-25min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2raL，室溫冷卻后于波長650nm處測定吸 光度值，根據(jù)上一步驟制作的木糖濃度與測得的木糖吸光度值之間的標準對應關系曲 線確定待測的木聚糖酶的酶解產(chǎn)物中所含有的相當于木糖的還原糖的量。木聚糖酶的 活力單位可被定義為在上述條件下每分鐘產(chǎn)生lnM相當于木糖的量為一個酶活力單 位，從而根據(jù)酶活力定義來推算木聚糖酶活力。
當然，上述說明并非是對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述操作，所有在本 發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)作出的變化、改型、添加或替換，都應屬于本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1、一種木聚糖酶活力的測定方法，其特征是；A，制作用MBTH法測得的木糖吸光度值與木糖濃度的標準對應關系曲線；B，用MBTH法檢測待測木聚糖酶水解木聚糖后產(chǎn)生的相當于木糖的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作的木糖濃度與測得的木糖吸光度值之間的標準對應關系曲線確定待測木聚糖酶的酶解產(chǎn)物中在單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的相當于木糖的還原糖的含量，以此來推算木聚糖酶的活力。
2、 根據(jù)權利要求l所述的木聚糖酶活力的測定方法，其特征是；上述步驟A 的具體步驟是;分別取6-15組具有不同濃度的木糖標準溶液2raL,濃度范圍在0-32 微克/毫升之間，加入2mL 0. 5當量的NaOH溶液，混勻，取1. 2mL加入到試管中(做三個平行樣)，再加入MBTH試劑0. 6mL于75-85。C水浴加熱15-25min后趁熱 加入硫酸鐵銨試劑1. 2raL，室溫冷卻后于波長620-680nm處測定吸光度值；根據(jù)每組木糖濃度與測得的吸光度值之間的關系繪制標準對應關系曲線；。
3、 根據(jù)權利要求1或2所述的木聚糖酶活力的測定方法，其特征是；上述步 驟B的具體步驟是；將9. 9mL木聚糖溶液其濃度為2-4mg/mL，加入到錐形瓶中于 30-40。C的水浴搖床中預熱8-12min，加入預熱至相應溫度的木聚糖酶溶液0. lraL 進行水解反應，水解時間為60min以內(nèi)，取水解液2mL，迅速加入到2mL 0. 5當量 的NaOH溶液中，混勻，取1.2mL加入到試管中(做三個平行樣)，再加入MBTH試 劑0. 6mL于75—85。C水浴加熱20-30min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL，室溫冷 卻后于波長620-680nni處測定吸光度值，根據(jù)歩驟A制作的木糖濃度與測得的木 糖吸光度值之間的標準對應關系曲線確定酶解產(chǎn)物中所含有的相當于木糖的還原 糖濃度，以此來推算木聚糖酶的活力；木聚糖酶的活力單位可被定義為在上述條 件下每分鐘產(chǎn)生lnM相當于木糖的量為一個酶活力單位；其中MBTH試劑的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶液等量混合即 得，現(xiàn)用現(xiàn)配， 一天內(nèi)有效。
4、 根據(jù)權利要求3所述的木聚糖酶活力的測定方法，其特征是；上述硫酸鐵 銨試劑的制法是0.5呢(FeNH4(SO4)2) 12H20, 0. 5%氨基磺酸，0. 5當量鹽酸。
5、 根據(jù)權利要求3所述的木聚糖酶活力的測定方法，其特征是；上述木聚糖 來源為樺木(birchwood )、櫸木(birchwood)等。
6、 根據(jù)權利要求3所述的木聚糖酶活力的測定方法，其特征是；上述木聚糖 溶液以50mM的丁二酸或醋酸溶液為溶劑。
7、 根據(jù)權利要求3所述的木聚糖酶活力的測定方法，其特征是；上述測定吸 光度值的最佳波長為650nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木聚糖酶活力的測定方法，其特征是；A.制作用MBTH法測得的木糖吸光度值與木糖濃度的標準對應關系曲線；B.用MBTH法檢測待測木聚糖酶水解木聚糖后產(chǎn)生的相當于木糖的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作的木糖濃度與測得的木糖吸光度值之間的標準對應關系曲線確定待查木聚糖酶的酶解產(chǎn)物中在單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的相當于木糖的還原糖的含量，以此來推算木聚糖酶的活力。本發(fā)明用MBTH法對木聚糖酶水解木聚糖后所產(chǎn)生的木糖端基的數(shù)量進行檢測以此來確定木聚糖酶的活力。該方法測木糖的檢測限和工作濃度范圍都明顯低于DNS法和鐵氰化鉀法，所以本方法的靈敏度明顯高于DNS法和鐵氰化鉀法。
文檔編號G01N21/25GK101477035SQ20081024967
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月27日 優(yōu)先權日2008年12月27日
發(fā)明者張永勤, 王哲平 申請人:青島科技大學