專利名稱：β-葡聚糖酶活力的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種測(cè)定β “葡聚糖酶活力的方法，具體涉及用MBTH法測(cè)定β-葡聚糖酶活力的方法尤其涉及測(cè)定過(guò)程中關(guān)鍵參數(shù)的選擇。
背景技術(shù)：
β-葡聚糖是一類非淀粉類多糖，它是由β-1，3_葡萄糖苷鍵和/或β-1，4_葡萄 糖苷鍵組成的鏈狀多糖，是植物細(xì)胞壁的組成成分，存在于禾谷類(包括大麥、燕麥、黑麥 和小麥等)的糊粉層和胚乳細(xì)胞壁中。葡聚糖酶對(duì)葡聚糖中的糖苷鍵具有重要的 水解作用。目前，該酶已廣泛用于啤酒、飼料、紡織、造紙、醫(yī)藥等行業(yè)。該酶活力的檢測(cè)方 法有粘度法、熒光法、顯色底物法、凝膠擴(kuò)散法、還原糖測(cè)定法等，其中最常采用的方法為還 原糖測(cè)定法中的DNS法、鐵氰化鉀法和Somogyi-nelson法。由于這三種方法靈敏度較低， 很難測(cè)到酶解反應(yīng)的初速度，因此，準(zhǔn)確度較差。本發(fā)明以MBTH(3-甲基_2_苯并噻唑酮腙)試劑為顯色劑來(lái)測(cè)β _葡聚糖酶的活 力。該法不受低濃度醋酸鹽和丁二酸鹽緩沖液的干擾，所得酶濃度曲線與酶解反應(yīng)速度在 較寬的酶濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)已有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種葡聚糖酶活力的測(cè)定方法，該方法采 用3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法來(lái)測(cè)定β -葡聚糖酶的活力。以下詳細(xì)介紹本發(fā)明一種葡聚糖酶活力的測(cè)定方法，Α，制作用MBTH法測(cè)得的 葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B，用MBTH法檢測(cè)待測(cè)β-葡聚糖酶水 解β _葡聚糖后產(chǎn)生的相當(dāng)于葡萄糖的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作的葡萄糖濃度與測(cè)得 的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定待測(cè)β-葡聚糖酶的酶解產(chǎn)物中在單位時(shí) 間內(nèi)所產(chǎn)生的相當(dāng)于葡萄糖的還原糖的含量，以此來(lái)推算葡聚糖酶的活力。優(yōu)化地；上述步驟A的具體步驟是；作用MBTH法測(cè)得的葡萄糖吸光度值與其 相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；分別取6-15組不同濃度(0-30μ g/mL)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0. 6mL，加入0. 6mL0. 5當(dāng)量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0. 6mL于75_85°C水浴加熱 5-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長(zhǎng)620-680nm處測(cè)定葡萄糖的吸 光度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；以上加量可按比例增減；根據(jù)每組葡萄糖濃度與測(cè)得的 相應(yīng)吸光度值之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；優(yōu)化地；上述步驟B的具體步驟是；用MBTH法檢測(cè)β -葡聚糖酶的活力；將濃度 為l_5mg/mL的預(yù)熱至測(cè)定溫度的β -葡聚糖溶液，加入至預(yù)熱至測(cè)定溫度的β _葡聚糖 酶溶液中進(jìn)行酶解反應(yīng)，測(cè)定溫度為25-40°C，水解時(shí)間為60min以內(nèi)，取水解液迅速與等 體積的0. 5當(dāng)量的NaOH溶液充分混勻以終止反應(yīng)(可在反應(yīng)過(guò)程中分時(shí)間段取樣檢測(cè))， 取1. 2mL加入到試管中(做三個(gè)平行樣)，再加入MBTH試劑0. 6mL于75-85°C水浴加熱 5-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長(zhǎng)620-680nm處測(cè)定吸光度值，以上加量可按比例增減。根據(jù)上一步驟制作的葡萄糖的濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定待測(cè)β-葡聚糖酶的活力；β-葡聚糖酶的活力單位可被定義為在 上述條件下，每毫升反應(yīng)體系中，每分鐘產(chǎn)生Inmol相當(dāng)于葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活 力單位。其中MBTH試劑的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二 硫蘇糖醇溶液等體積混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配，一天內(nèi)有效。優(yōu)化地；上述硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5% (FeNH4(SO4)2) · 12Η20,0. 5%氨基磺酸，
0.5當(dāng)量鹽酸。優(yōu)化地；上述β -葡聚糖以50mM的丁二酸緩沖溶液或醋酸緩沖溶液為溶劑。優(yōu)化地；上述測(cè)定吸光度值的最佳波長(zhǎng)為650nm。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明用MBTH法對(duì)β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后所產(chǎn)生的葡 萄糖端基的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)以此來(lái)確定葡聚糖酶的活力；葡萄糖以及低聚葡聚糖是 β -葡聚糖酶水解的產(chǎn)物，因此對(duì)葡萄糖端基含量檢測(cè)的靈敏度直接決定著對(duì)β “葡聚糖 酶活力檢測(cè)的靈敏度。該方法比比濁法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、價(jià)廉。檢測(cè)限和工作濃度范圍都 明顯低于DNS法和鐵氰化鉀法，所以本方法的靈敏度明顯高于DNS法和鐵氰化鉀法。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 主要儀器水浴恒溫振蕩器，SHZ-82型，國(guó)華電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋， ΗΗ-4型，國(guó)華電器有限公司；數(shù)字酸度計(jì)，梅特勒-托利多公司；UV2100紫外分光光度計(jì)， 上海UNICO儀器有限公司；β-葡聚糖酶，寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；β-葡聚糖，百特 純大分子科技有限公司；移液器，F(xiàn)innpipette芬蘭雷勃。溶液配置MBTH顯色液3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶 液等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配，一天內(nèi)有效。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(30 μ g/mL)精確稱取干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖0. 3000g,用50mM pH5. 5的醋酸緩沖溶液溶解、轉(zhuǎn)移并定容至IOOmL,配成3. 00mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；從中 取ImL葡萄糖溶液，轉(zhuǎn)移并定容至IOOmL,即得30 μ g/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5% (FeNH4(SO4)2) · 12H20，0. 5%氨基磺酸，0. 5當(dāng)量鹽酸。步驟A，制作用MBTH法測(cè)得的葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲 線.
一入 ，分別加入8組不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 5mL,加入0. 5mL0. 5當(dāng)量的NaOH溶 液，混勻，再加入MBTH試劑0. 5mL于80°C水浴加熱ll-13min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑lmL， 室溫冷卻后于波長(zhǎng)650nm處測(cè)定葡萄糖的吸光度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；根據(jù)每組葡 萄糖溶液濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B,用MBTH法檢測(cè)的β -葡聚糖酶活力；將5mL β -葡聚糖溶液其濃度為2mg/mL，pH值為5. 5，加入到錐形瓶中于30°C的水 浴搖床中預(yù)熱lOmin，加入待測(cè)的β-葡聚糖酶溶液5mL進(jìn)行水解反應(yīng)，為確定合適的待測(cè) β-葡聚糖酶濃度可以將待測(cè)的β“葡聚糖酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個(gè)檢測(cè)，水解時(shí)間為60min以內(nèi)，取水解液2mL (可在反應(yīng)過(guò)程中分時(shí)間段取樣檢測(cè))，迅速加入2mL 0. 5當(dāng) 量的NaOH溶液中(做三個(gè)平行樣)，混勻，取ImL加入到試管中，再加入MBTH試劑0. 5mL于 80°C水浴加熱ll-13min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長(zhǎng)650nm處測(cè)定 吸光度值，根據(jù)上一步驟制作的葡萄糖濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲 線確定待測(cè)的葡聚糖酶的酶解產(chǎn)物中所含有的相當(dāng)于葡萄糖的還原糖的量。葡聚 糖酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生Inmol相當(dāng)于葡 萄糖的量的酶量為一個(gè)酶活力單位，從而根據(jù)酶活力定義來(lái)推算木葡聚糖酶的活力。實(shí)施例2 主要儀器電熱恒溫水浴鍋，ΗΗ-4型，國(guó)華電器有限公司；數(shù)字酸度計(jì)，梅特勒-托利多公司；UV2100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；葡 聚糖酶，武漢新華揚(yáng)生物有限責(zé)任公司；葡聚糖，百特純大分子科技有限公司；移液器， Finnpipette芬蘭雷勃集團(tuán)。溶液配置MBTH顯色液3mg/mL的3_甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶 液等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配，一天內(nèi)有效。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(30 μ g/mL)精確稱取干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖0. 3000g,用50mM pH4. 0的醋酸緩沖溶液溶解、轉(zhuǎn)移并定容至IOOmL,配成3. 00mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；從中 取ImL葡萄糖溶液，如前法操作并定容至IOOmL,即得30 μ g/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5% (FeNH4(SO4)2) · 12H20，0. 5%氨基磺酸，0. 5當(dāng)量鹽酸。步驟A，制作用MBTH法測(cè)得的葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲 線.
一入 ，分別加入8組不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液lmL，加入ImL 0. 5當(dāng)量的NaOH溶液，混 勻，再加入MBTH試劑ImL于80°C水浴加熱ll-13min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑2mL，室溫冷 卻后于波長(zhǎng)650nm處測(cè)定葡萄糖的吸光度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；根據(jù)每組葡萄糖溶 液濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B,用MBTH法檢測(cè)β -葡聚糖酶的活力；將0. 25mL β -葡聚糖溶液(其濃度為2mg/mL，pH值為5. 5)，加入試管中于30°C 的水浴鍋中預(yù)熱lOmin，加入待測(cè)的已預(yù)熱至30°C的β _葡聚糖酶溶液0. 25mL進(jìn)行水解反 應(yīng)，為確定合適的待測(cè)β-葡聚糖酶濃度可以將待測(cè)的β-葡聚糖酶溶液稀釋成不同濃度 梯度逐個(gè)檢測(cè)，水解時(shí)間為30分鐘，迅速加入0. 5mL 0. 5當(dāng)量的NaOH溶液充分混勻以終止 反應(yīng)，加入0. 5mL MBTH試劑，充分混勻，于80°C水浴加熱后趁熱加入硫酸鐵銨試劑lmL，室 溫冷卻后于波長(zhǎng)650nm處測(cè)定吸光度值，如法做三個(gè)平行樣，根據(jù)上一步驟制作的葡萄糖 濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定待測(cè)的β“葡聚糖酶的酶解產(chǎn) 物中所含有的相當(dāng)于葡萄糖的還原糖的量。β“葡聚糖酶的活力單位可被定義為在上述條 件下，每毫升反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生Inmol相當(dāng)于葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位， 從而根據(jù)酶活力定義來(lái)推算木葡聚糖酶的活力。當(dāng)然，上述說(shuō)明并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述操作，所有在本發(fā) 明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)作出的變化、改型、添加或替換，都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種β-葡聚糖酶活力的測(cè)定方法，其特征是；A，制作用MBTH法測(cè)得的葡萄糖的吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B，用MBTH法檢測(cè)待測(cè)β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后產(chǎn)生的相當(dāng)于葡萄糖的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作的葡萄糖濃度與測(cè)得的相應(yīng)的吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定待測(cè)β-葡聚糖酶的酶解產(chǎn)物中在單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的相當(dāng)于葡萄糖的還原糖的含量，以此來(lái)推算β-葡聚糖酶的活力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡聚糖酶活力的測(cè)定方法，其特征是；上述步驟A的具 體步驟是；分別取6-15組具有不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 6mL,濃度范圍在0_30微克/ 毫升之間，加入0. 6mL 0. 5當(dāng)量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0. 6mL于75_85°C水浴 加熱8-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長(zhǎng)620-680nm處測(cè)定吸光度 值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；以上加量可按比例增減；根據(jù)每組葡萄糖濃度與測(cè)得的吸光 度值之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葡聚糖酶活力的測(cè)定方法，其特征是；上述步驟B 的具體步驟是；將終濃度為l_5mg/mL的預(yù)熱至測(cè)定溫度的β _葡聚糖溶液，加入到預(yù)熱至 相應(yīng)溫度的β “葡聚糖酶溶液中開(kāi)始水解反應(yīng)，酶解溫度為25-40°C，水解時(shí)間為60min以 內(nèi)，將該酶解液與等體積的0. 5當(dāng)量的NaOH溶液迅速混合以終止反應(yīng)，可在反應(yīng)過(guò)程中分 階段取樣，從中取1. 2mL加入到試管中做三個(gè)平行樣，再加入MBTH試劑0. 6mL于75_85°C水 浴加熱5-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長(zhǎng)620-680nm處測(cè)定吸光 度值，根據(jù)步驟A制作的葡萄糖濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定 酶解產(chǎn)物中所含有的相當(dāng)于葡萄糖的還原糖濃度，以此來(lái)推算β-葡聚糖酶的活力；β-葡 聚糖酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反應(yīng)體系每分鐘產(chǎn)生Inmol相當(dāng)于葡 萄糖的量所需的酶量為一個(gè)酶活力單位；其中MBTH試劑的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯 并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶液等體積混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配，一天內(nèi)有效。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的葡聚糖酶活力的測(cè)定方法，其特征是；上述硫酸鐵銨試 劑的制法是0. 5% FeNH4(SO4)2 · 12Η20，0. 5%氨基磺酸，0. 5當(dāng)量鹽酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的葡聚糖酶活力的測(cè)定方法，其特征是；上述葡聚糖 酶溶液以50mM的丁二酸或醋酸溶液為溶劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的葡聚糖酶活力的測(cè)定方法，其特征是；上述測(cè)定吸光度 值的最佳波長(zhǎng)為650nm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種β-葡聚糖酶活力的測(cè)定方法，A，制作用MBTH法測(cè)得的葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B，用MBTH法檢測(cè)待測(cè)β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后產(chǎn)生的相當(dāng)于葡萄糖的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作的葡萄糖濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定待測(cè)β-葡聚糖酶的酶解產(chǎn)物中在單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的相當(dāng)于葡萄糖的還原糖的含量，以此來(lái)推算β-葡聚糖酶的活力。該方法測(cè)定葡萄糖的檢測(cè)限和工作濃度范圍都明顯低于DNS法、鐵氰化鉀法和Somogyi-Nelson，所以本方法的靈敏度明顯高于這三種方法，而且，采用本方法使底物β-葡聚糖的用量大大降低，因此可大大降低實(shí)驗(yàn)成本。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101819138SQ201010144060
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日
發(fā)明者葉慶國(guó), 張 杰, 張永勤, 張洪妮, 曾凡偉, 王哲平, 王斐 申請(qǐng)人:青島科技大學(xué)