獲得高活性Cry1Ai蛋白突變體的方法及其突變體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是涉及一種獲得高活性CrylAi蛋白突變體的方 法，以及采用該方法獲得的高活性的CrylAi蛋白突變體。
【背景技術】
[0002] crylAi基因為本申請人于2009年所克隆（專利號：ZL200910241558. 8 ;束 長龍等，2013)，其表達產物對亞洲玉米螟（Ostriniafurnacalis)、小菜蛾（Plutella xylostella)、水稻二化螟（Chilosuppressalis)、美國白蛾（Hyphantriacunea)及家香 (Bombyxmori)等鱗翅目昆蟲具有較好的殺蟲活性，但對棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera) 僅具有體重抑制作用，在某種程度上限制了crylAi基因的應用范圍。crylAhl(專利號： ZL200410009918. 9 ;張杰等，2006)，其編碼的CrylAh蛋白對棉鈴蟲、亞洲玉米螟和水稻二 化螟等鱗翅目害蟲具有很高的毒殺活性，而CrylAh蛋白對重要的經濟昆蟲家蠶卻表現出 較低的生物活性，顯示出良好的環(huán)境安全性。CrylAh蛋白和CrylAi蛋白活性區(qū)域的氨 基酸相似性為84%，兩者DomainIII完全一致，DomainI的差異集中定位在helixα-3、 helixα-4和helixα-6上，在DomainII的差異主要集中在loop2和loop3上。
[0003] 近年來大量的研究表明，Cry蛋白上某些氨基酸位點或區(qū)域與殺蟲特異性有關。 DomainII是Cry毒素結構中變化最多的結構域。主要是頂端的環(huán)（loop)，其長度、構象和 序列都可以有很大的變化。CrylA、Cry2A、Cry3A、Cry4A和Cry5A頂端loop的長度變化較 大，Cry5A的loop最長，Cry3A的loop最短，由于DomainII的多變性，該區(qū)域被認為是與 Cry毒素作用的特異性有關。研究發(fā)現：CrylAb蛋白的loop2上某些氨基酸與其對煙草 天蛾的活性有關；Cry4Ba蛋白的loopα-8參與其與埃及伊蚊（Aedesaegypti)的結合過 程；CryllBa蛋白的loopsα-8、1和3參與受體結合，并與對伊蚊的殺蟲活性有關。Cryl9Aa 蛋白的loop1中357W與其對尖音庫蚊（Culexpipiens)的活性有關，loop2中的410Y、 416W、418D與其對尖音庫蚊和埃及伊蚊的活性有關。但也有研究發(fā)現：Cry4Aa蛋白對尖音 庫蚊的活性相關區(qū)域不是DomainII的loops，可能是DomainIII的某個位點。上述研究 結果充分說明了Cry蛋白的loop區(qū)域與其殺蟲活性有著密不可分的關系，但Cry類蛋白對 棉鈴蟲殺蟲特異性相關氨基酸區(qū)域尚無明確報道，且多數突變體為單點突變且活性大多喪 失，是反面推測該位點可能與殺蟲特異性相關的位點，而改變殺蟲特異性、提高新活的成功 案例較少。

【發(fā)明內容】

[0004] 針對上述領域中的缺陷，本發(fā)明提供一種獲得高活性Cry蛋白突變體的方法，采 用多點連續(xù)突變的方法，得到了高活性的蛋白突變體。
[0005] 本發(fā)明采用該方法，對CrylAi蛋白進行突變，獲得的兩個突變體，該兩個突變體 對某些鱗翅目害蟲有毒殺效果有明顯的提高。
[0006] 獲得高活性Cry蛋白突變體的方法，對Cry蛋白立體結構DomainII的1οορ2或/ 和1〇〇ρ3中的氨基酸序列進行連續(xù)多點突變，所述連續(xù)多點突變?yōu)檫B續(xù)10個以上的氨基酸 序列的改變。
[0007] 所述Cry蛋白為CrylAi或CrylAh蛋白。
[0008] 所述突變?yōu)镃rylAi蛋白loop2或/和loop3中氨基酸序列突變。
[0009] 所述突變?yōu)镃rylAi突變體蛋白loop 2中的369RPFNIGINNQQ3?序列突變，或/和 CrylAi突變體蛋白loop 3中的435SMFRSGSSSSVSIIR449序列突變。
[0010] 上述方法得到的蛋白突變體。
[0011] 所述蛋白突變體的氨基酸序列為SEQIDN0:2或SEQIDN0:4。
[0012] 編碼上述蛋白突變體的基因。
[0013] 所述基因的序列分別為SEQIDN0:1或SEQIDN0:3。
[0014] 本發(fā)明明確了CrylAh蛋白與棉鈴蟲ΑΡΝΙ片段H3的結合區(qū)域是loop2和loop 3的基礎上，在比對分析CrylAh蛋白和CrylAi蛋白DomainII中4個loop的差異后，將 CrylAi蛋白的loop2和loop3進行連續(xù)多點氨基酸突變（10個氨基酸序列以上），增強 其與受體的結合能力，以提尚殺蟲毒力。
[0015] 本發(fā)明連續(xù)多點突變體ModCrylAid-loop2對棉鈴蟲的殺蟲活性提高了約13倍； 連續(xù)多點突變體ModCrylAi-loop2對玉米螟的活性比改造前的CrylAi蛋白提高了近9 倍；連續(xù)多點突變體ModCrylAi-loop2和連續(xù)多點突變體ModCrylAi-loop3對水稻二化 螟的活性比改造前的CrylAi蛋白提高5倍-6倍左右。
【附圖說明】
[0016] 圖1反向PCR示意圖，
[0017] 圖2Western Blot分析CrylAh蛋白的標記情況，
[0018] 圖3 SDS-PAGE分析ΑΡΝΙ片段的表達情況，
[0019] 圖4棉鈴蟲ΑΡΝΙ結合區(qū)域的鑒定，
[0020] 圖5CrylAh蛋白上受體結合區(qū)域的鑒定，
[0021] 其中A:飽和結合濃度篩選；B:loop多肽競爭結合；C:loop多肽組合競結合，
[0022] 圖6CrylAh蛋白和CrylAi蛋白DomainII中l(wèi)oop區(qū)域對應的氨基酸，
[0023] 圖7反向PCR擴增構建連續(xù)多點突變體，
[0024]其中M :marker ; 1 :modcrylAi_loop 2 ;2 :modcrylAi_loop 3，
[0025] 圖8 TG1中陽性克隆的PCR鑒定結果，
[0026] 圖9Rosetta(DE3)中陽性克隆的PCR鑒定結果，
[0027] 1，2 :modcrylAi_loop 2 ;3,4 :modcrylAi_loop 3，
[0028] 圖10 SDS-PAGE分析連續(xù)多點突變體蛋白在Rosetta (DE3)的表達情況（包涵體 蛋白），
[0029]其中1 :pEB載體；2 :CrylAi ;3 :ModCrylAi_loop 2 ;4 :ModCrylAi_loop 3。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。
[0031]1.材料與試劑
[0032] 1· 1菌株與質粒
[0033] 實驗所用菌株與質粒詳見表1，可以對公眾發(fā)放。
[0034] 表1菌株與質粒
[0035]
[0036] 1.2引物及多肽序列
[0037] 連續(xù)多點突變突變體構建的引物如表2所示，多肽序列如表3所示，均由生工生物 工程（上海）股份有限公司合成。
[0038] 表2構建連續(xù)多點突變的引物序列
[0039]
[0040] 表3多肽序列
[0041]
[0042] 1.3供試昆蟲
[0043] 棉鈴蟲室內敏感種群標準試蟲，由中國農科院植保所棉花害蟲組提供。
[0044] 亞洲玉米螟室內敏感種群標準試蟲，由中國農科院植保所玉米害蟲組提供
[0045] 水稻二化螟室內敏感種群標準試蟲，由中國農科院植保所水稻害蟲組提供
[0046] 1. 4酶與生化試劑
[0047] Primer star高保真擴增酶、限制性內切酶、連接試劑盒BKL試劑盒購自TaKaRa公 司；PCR純化試劑盒、DNA膠回收試劑以及質粒提取試劑盒購自Axygen公司；Taq Mix聚合 酶購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；蛋白Marker購自Bio-Rad公司；DNA marker TaKaRa 公司；抗生素購自鼎國生物工程公司；
[0048] 其它試劑均為市售國產或者進口分析純或電泳級純化學試劑。
[0049]蛋白高分子量標準：Protein Standard (High range) (kDa) :200、116、97、66、45
[0050] DL5000DNA Marker (bps) :5000、3000、2000、1500、1000、750、500、200、100
[0051] DL15000DNA Marker(bps) : 15000、10000、7500、5000、2500、1000、250
[0052] 1. 5培養(yǎng)基與抗生素
[0053]液體LB培養(yǎng)基：trytone 1 %，yeast extract 0· 5%，NaCl 1%，pH 7· 0， 121°C /20mim滅菌。
[0054] 固體LB培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入1. 3%瓊脂，121 °C /20mim滅菌。
[0055]液體 1/2LB培養(yǎng)基：trytone0· 5 %，yeastextract0· 25 %，NaCl0· 5 %，pH 7. 0,121°C/20mim滅菌。
[0056] 抗生素：氨芐青霉素水溶液lOOmg/mL用時稀釋1000倍；紅霉素乙醇溶液6mg/mL， 使用時稀釋1000倍；氯霉素乙醇溶液34mg/mL，使用時稀釋1000倍，-20°c保存
[0057] 1. 6其它試劑
[0058] (1) 4.Omol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液
[0059]無水NaAc 65. 61g
[0060] 少量超純水溶解NaAc，用HAc將pH調至4· 5,再定容至200mL
[0061] (2) 50mM Na2C03
[0062]無水Na2C03 5. 30g
[0063] 超純水定容至1000mL，121°C /20mim滅菌后，pH調至9·5
[0064] (3) 1. 0mol/L NaCl
[0065] NaCl 58. 44g
[0066] 超純水定容至1000mL，121°C /20mim滅菌
[0067] (4) 30%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺
[0068] 丙烯酰胺29. 2g
[0069] 甲叉雙丙烯酰胺0.8g
[0070] 超純水配制100mL，4°C保存
[0071] (5) SDS-PAGE 3X上樣緩沖液
[0072] S.DS. 6.0 g 甘袖 30.0niL Tris 3.63 g β-疏基乙廊.. 15^0mL 溴酉分藍 0 30g
[0073] 超純水定容至100mL
[0074] (6)電泳緩沖液
[0075] SDS 1. 00g
[0076]甘氨酸14. 4g
[0077] Tris 3. 03g
[0078] 超純水定容至1000mL，4°C保存
[0079] (7)分離膠緩沖液
[0080]