一種鏈霉菌重組表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鏈霉菌重組表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鏈霉菌屬革蘭氏陽性細菌，作為基因工程受體菌有其自身的優(yōu)越性：首先，利用鏈 霉菌進行工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)抗生素的歷史悠久，在工業(yè)規(guī)模發(fā)酵技術(shù)方面已積累了相當豐富 的經(jīng)驗，因而可利用現(xiàn)有的技術(shù)及設(shè)備生產(chǎn)鏈霉菌表達的外源基因產(chǎn)物：其次，鏈霉菌相比 于枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的胞外酶較少，可防止外源蛋白被降解。胞外分泌系統(tǒng)發(fā)達，可用于外 源基因的分泌表達，簡化外源基因產(chǎn)物的分離和純化；同時，對鏈霉菌的分子遺傳學研宄的 長足進展，特別是有關(guān)鏈霉菌質(zhì)粒的分子生物學、鏈霉菌啟動子、鏈霉菌蛋白質(zhì)分泌的信號 序列等方面研宄的綜合進展。給外源基因在鏈霉菌中的表達提供了理論基礎(chǔ)。在鏈霉菌中 表達的蛋白質(zhì)常常是可溶性的，因此就無需為了獲得具有生物活性的蛋白質(zhì)而使表達的蛋 白重新溶解并折疊成正確的構(gòu)型；最后，鏈霉菌作為基因表達的受體，其致病性小。鏈霉菌 成為繼大腸桿菌、枯草芽孢桿菌之后又一個有價值的基因表達的宿主菌。
[0003] 已有大量有關(guān)真核基因及一些非鏈霉菌來源的原核基因在鏈霉菌中表達的報道。 如人膜島素Glucagon(Qi.etal.，J.Microbiol.Biotechnol，2008, 1076 - 1080.)，曲霉木 聚糖酶Xylanase(Diazetal.，2〇04,Appl.Microbiol.Biotechnol.，401 - 4〇6.)，鏈球菌 溶檢酶streptokinase(Pimientaetal.，2007,Microb.CellFact. 6,20.) 〇
[0004] 雖然鏈霉菌的克隆體系已建立得較為完善，然而能與大腸桿菌操作中相比擬的用 于基因表達的啟動子和載體還很有限。因此，探索發(fā)現(xiàn)新型啟動子并構(gòu)建表達載體，對于拓 展鏈霉菌表達系統(tǒng)很有意義。
[0005] 本發(fā)明提供的鏈霉菌表達載體，方便外源基因的插入及防止轉(zhuǎn)錄通讀在載體上添 加多克隆位點和終止子，且能夠在三種鏈霉菌中大量分泌表達TGase。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明以載體pISG86(SEQIDNO. 3)為出發(fā)載體，在其上設(shè)計連接了序列如SEQ IDNO. 1所示的啟動子及信號肽、序列如SEQIDNO. 2所示的多克隆位點及終止子，構(gòu)建了 鏈霉菌高效分泌表達載體。
[0007] 本發(fā)明還提供一種構(gòu)建所述分泌表達載體的方法，主要包括以下步驟：
[0008] (1)擴增啟動子及信號肽序列后通過KpnI、BglII雙酶切處理，并連接至相同酶切 處理后的載體PISG86,得到pISG86-l;
[0009] (2)以序列如SEQIDNO. 6、7所示的引物，以pISG86-l為模板，通過重疊PCR將多 克隆位點序列及終止子序列連接至PISG86-1的信號肽下游，獲得序列正確的載體pSGOl; 以pSGOl為模板，分別以序列如SEQIDNO. 8、9所示的引物對，序列如SEQIDN010、ll所 示的引物對，進行PCR，對pSGOl經(jīng)密碼子優(yōu)化得到鏈霉菌高效分泌表達載體pSG02。
[0010] 本發(fā)明提供的表達載體，在表達外源蛋白TGase時，與鏈霉菌內(nèi)常用的強啟動子 紅霉素啟動子potE#相比，表達量更高，說明該啟動子可作為一種強啟動子在鏈霉菌內(nèi)表達 其他外源蛋白。此外，本發(fā)明構(gòu)建的載體可以在S.lividansTK24，S.lividans1326及 5. griseus內(nèi)成功表達TGase，說明該表達載體具有在這三種鏈霉菌中表達其他外源蛋白 的潛力。
【附圖說明】
[0011] 圖lpSG02-TGase在鏈霉菌S.lividans1326中表達的蛋白電泳圖譜，（a) pSG02-TGase在鏈霉菌S.lividans1326中表達的蛋白電泳圖譜，（b)pSG03-TGase在鏈霉 菌S.lividans1326中表達的蛋白電泳圖譜。
[0012] 圖2pSG02_TGase在三種鏈霉菌中的表達。
[0013] 圖3苯丙氨酸脫氨酶、氨肽酶通過pSG02在S.lividansTK24內(nèi)表達的蛋白電泳 圖譜；(a)氨肽酶，（b)苯丙氨酸脫氨酶。
【具體實施方式】
[0014] 以下實施例涉及的有關(guān)方法：
[0015] TGase酶活測定方法：比色法測定酶活。用a-N-CBZ-Gln-Gly為作用底物，L-谷 氨酸-Y-單羥胺酸做標準曲線。1個單位TGase酶活定義為：37°C每分鐘催化底物形成 1ymolL-谷氨酸-y-單輕胺酸的酶量（U/mL)。酶活測定條件：37°C條件下反應(yīng)lOmin。
[0016] 苯丙氨酸脫氨酶（PAL)酶活測定方法：取適量發(fā)酵上清與225yL的Tris-HCL buffer(25mM，pH8. 0)、250yL底物L-苯丙氨酸混合，反應(yīng)總體積為500yL。40度反應(yīng) 30min，加500yL甲醇終止反應(yīng)。酶活單位定義：40°C每分鐘生成ImM的反式肉桂酸需要的 酶量為一個酶活單位。
[0017] 氨肽酶（BSAP)酶活測定方法：取適量發(fā)酵上清與4mmol/L的底物 aminoacyl-p-nitroanilines混合，37°C反應(yīng)10min，405nm下測定吸光值，酶活單位定義： 37度每分鐘形成1ymol對硝基苯胺所需酶量即為一個酶活單位。
[0018]實施例 1 載體pSG02_TGase和pSG03_TGase的構(gòu)建
[0019] 設(shè)計引物（P1/P2)擴增啟動子信號肽序列后酶切（KpnI/Bglll)連接至載體 PISG86 ;在此基礎(chǔ)上通過全質(zhì)粒PCR的方法（P3/P4)將MCS和fd-ter插入到信號肽的下 游。之后利用定點突變（P5/P6)將信號肽序列中的第7位的亮氨酸稀有密碼子TTA突變 為CTG，第21位氨基酸絲氨酸的編碼基因AGC突變?yōu)镚CC(P7/P8)，獲得載體pSG02,大小為 6. 6kb。以S.hygroscopicusWSH03-13基因組為模板，設(shè)計引物獲得TGase基因片段，通過 酶切連接至PSG02,獲得TGase表達載體pSG02-TGase。以載體pISG86為模板，通過PCR方 法（P9/P10)獲得POTn^啟動子片段，通過全質(zhì)粒PCR的方法以P^啟動子替換pSG02的啟 動子，并連接TGase基因獲得載體pSG03_TGase。
[0020] P1 :5, -CGGGGTACCGCCAGGAGCAGGGGAACGC-3，
[0021] P2 :5, -GAAGATCTGGCATGGCTGACCGACGGC-3，
[0022] P3 ：
[0023] 5?-GGAGTCATGCCGTCGGTCAGCCATGCCATCGATTTTAAAGGATCCGTTAACAAGCTTCCCGGGTAA ACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGTCACGCGCCCAACGGCGGCG-3'
[0024]P4 ：
[0025] 5 '-GGGCCCACGCCGCCGTTGGGCGCGTGACTCCAAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCCTTTAATTGTA TCGGTTTACCCGGGAAGCTTGTTAACGGATCCTTTAAAATCGATGGCATGGCTGACCGACGGC-3'
[0026] P5 ：5, -GGAGTCATGCCGTCGGTCGCCCATGCCATCGATTTTAAAGGATCC-3 ,
[0027] P6 :5, -CCTTTAAAATCGATGGCATGGGCGACCGACGGCATGACTCCAGCGGTG-3'
[0028] P7 :5' -ATGTACAAGCGTCGGAGTCTGCTCGCCTTCGCCACTGTGAG-3'
[0029] P8 :5, -CAGTGGCGAAGGCGAGCAGACTCCGACGCTTGTACATGAAAATCG-3'
[0030] P9 :5' -CCACAACAAGGGAGTCACCGATTTTCGGTACCAGCCCGACCCGAGC-3'
[0031]P10:5 ' -CGAGTAAACTCCGACGCTTGTACATAGATCTGCAGCCAAGCTTGC-3 '
[0032] 實施例2TGase的表達
[0033]將pSG02-TGase和pSG03-TGase分別轉(zhuǎn)入S.lividans1326 內(nèi)，獲得重組菌 S.lividansl326/pSG02-TGase和S.lividans1326/pSG03-TGase。將重組菌在種子培養(yǎng)基 中37°C、200rpm培養(yǎng)2天，以2%的接種量轉(zhuǎn)至發(fā)酵培養(yǎng)基中37°C、200rpm培養(yǎng)6天，每隔 6h取樣，獲得最大酶活。另外將pSG02-TGase轉(zhuǎn)至S.lividansTK24及S.griseus中按相 同的條件培養(yǎng)。
[0034]重組菌S.lividans1326/pSG02_TGase在大約 24h開始表達酶原proTGase，隨著 培養(yǎng)時間的延長，proTGase逐漸被活化為TGase，在84h時獲得的TGase的量最大，對應(yīng)酶 活為9. 62U/ml(圖la);而S.lividans1326/pSG03-TGase在84h時獲得最大表達量，對應(yīng) 酶活為4. 6U/ml(圖lb)。通過比較兩種重組菌中TGase的表達量可知：本發(fā)明提供的啟動 子在表達TGase時優(yōu)于鏈霉菌中常用的紅霉素啟動子？6"@，可作為一種強啟動子用于以鏈 霉菌為宿主的重組表達。另外，為了評估表達載體PSG02的宿主通用性，將pSG02-TGase分 別轉(zhuǎn)入鏈霉菌宿主S.lividansTK24及S.griseus中，TGase在上述兩種宿主獲得表達，對 應(yīng)酶活為7. 6U/ml和6. 84U/ml。該結(jié)果說明了重組載體pSG02-TGase能夠應(yīng)用于不同的鏈 霉菌屬宿主菌（圖2)。
[0035] 實施例3PAL與AP的表達
[0036] 將來源于粘紅酵母的編碼苯丙氨酸脫氨酶的基因PAL、來源于枯草芽孢桿菌的編 碼氨肽酶的基因AP通過酶切連接的方式分別連接至載體pSG02,構(gòu)建得到載體pSG02-PAL， PSG02-BSAP，分別轉(zhuǎn)入S.lividansTK24內(nèi)表達。培養(yǎng)條件與重組菌S.Iividansl326/ pSG02-TGase-致。培養(yǎng)84h獲得2. 82U/mL氨肽酶和20. 6U/mL苯丙氨酸脫氨酶。
[0037] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種鏈霉菌重組分泌表達載體，其特征在于，以核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示的載 體PISG86為出發(fā)載體，在其上設(shè)計連接了序列如SEQIDNO. 1所示的啟動子及信號肽、序 列如SEQIDNO. 2所示的多克隆位點及終止子，構(gòu)建了鏈霉菌高效分泌表達載體。
2. -種構(gòu)建權(quán)利要求1所述重組分泌表達載體的方法，其特征在于，主要包括以下步 驟： (1) 擴增啟動子及信號肽序列后通過KpnI、BglII雙酶切處理，并連接至相同酶切處理 后的載體PISG86,得到pISG86-l; (2) 以pISG86-l為模板，以序列如SEQIDNO. 6、7所示的引物對，通過重疊PCR將多克 隆位點序列及終止子序列連接至PISG86-1的信號肽下游，獲得載體pSGOl;以pSGOl為模 板，分別以序列如SEQIDNO. 8、9所示的引物對，序列如SEQIDNOKKll所示的引物對，進 行PCR，對pSGOl進行密碼子優(yōu)化得到鏈霉菌高效分泌表達載體pSG02。
3. 權(quán)利要求1所述重組分泌表達載體在以鏈霉菌為宿主進行重組表達中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述鏈霉菌為StreptomycesIividans TK24,StreptomycesIividans1326 或Streptomycesgriseus。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，重組表達谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，重組表達苯丙氨酸脫氨酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，重組表達氨肽酶。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鏈霉菌重組表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供的鏈霉菌表達載體，方便外源基因的插入及防止轉(zhuǎn)錄通讀在載體上添加多克隆位點和終止子，且能夠在三種鏈霉菌中大量分泌表達TGase。
【IPC分類】C12N9-48, C12N9-88, C12N15-76, C12N9-10
【公開號】CN104818291
【申請?zhí)枴緾N201510234719
【發(fā)明人】周哲敏, 關(guān)成冉, 崔文璟, 周麗
【申請人】江南大學
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年5月8日