一種蘋果酸脫氫酶基因rgmdh1及其重組表達(dá)載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從粘紅酵母YM25079中分離的編碼蘋果酸脫氫酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，通過構(gòu)建重組載體并在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有蘋果酸脫氫酶功能，能催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸。
【專利說明】
一種蘋果酸脫氫酶基因RGMDH1及其重組表達(dá)載體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種蘋果酸脫氫酶基因RGMDHl及其重組表達(dá)載體，具體涉及以粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)YM25079總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴增得到編碼蘋果酸脫氫酶(MDH)的基因，將其克隆到大腸桿菌表達(dá)載體后誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析法純化后得到純酶，并對該酶進行了酶活測定及酶學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蘋果酸脫氫酶(MDH)廣泛分布于生物體內(nèi)，是一種活性非常強的酶，它催化草酰乙酸鹽和蘋果酸鹽的相互轉(zhuǎn)化反應(yīng)，與二核苷酸輔酶的氧化還原相關(guān)。草酰乙酸鹽在許多代謝途徑中都有重要作用，包括三羧酸循環(huán)、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原異生等，并維持氧化還原平衡，還能促進胞質(zhì)和亞細(xì)胞器代謝物的交換。依生物體的功能不同、組織差異、細(xì)胞內(nèi)定位的不同其表達(dá)種類不同，MDH具有多種同工酶形式。胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶(cMDH)存在于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，擔(dān)負(fù)著將NADH轉(zhuǎn)入線粒體的重任，并且還對調(diào)控三羧酸循環(huán)有作用，同時cMDH還是核酸通路(NACh)復(fù)合體的一個組成部分。
[0003]蘋果酸脫氫酶(MDH)廣泛分布在動物組織、微生物和植物中。它是一種活性最強的酶，根據(jù)亞細(xì)胞定位，蘋果酸脫氫酶可分為5種類型，存在于乙醛酸體、線粒體、過氧化物體、葉綠體、細(xì)胞漿以及錐蟲甘油體內(nèi)。MDH為多聚體酶，是由相同或相似亞基組成的二聚體或四聚體，亞基的分子量為30-35kDa，MDH在醫(yī)學(xué)方面也引起越來越多的關(guān)注如利用基因工程疫苗預(yù)防人體帶絳蟲病已是備受關(guān)注的研究方向，通過牛帶絳蟲亞洲亞種MDH基因的生物信息學(xué)分析，預(yù)測到胞漿型MDH是一個潛在的診斷抗原，這為帶絳蟲在診斷、藥物及疫苗研究中的應(yīng)用前景提供了重要的線索，在臨床診斷中用于多酶分析及疾病的早期診斷，例如用于診斷DIC(彌散性血管內(nèi)凝血)，心肌梗塞，急慢性肝炎等。在食品領(lǐng)域，蘋果酸脫氫酶用于有機酸含量的測定，如L-蘋杲酸、醋酸、檸檬酸等物質(zhì)的測定，應(yīng)用前景廣泛。利用MDH底物專一性，還可將其用于拆分D，L-蘋果酸酶?？傊琈DHs作為生物體中樞代謝途徑的關(guān)鍵酶，國內(nèi)外對其己進行了較為廣泛的研究，MDHs同工酶正應(yīng)用于生物分類、物種分化、遺傳變異、物種雜交和個體發(fā)育等研究。因此深入了解MDHs的生理生化特性、結(jié)構(gòu)及功能、催化機制，對于酶重組蛋白的表達(dá)、純化及免疫特性分析，探討生物體中MDHs的代謝作用以及一些疾病的分子致病機制有著重要的意義。同時MDH的應(yīng)用研究也將會推動MDHs轉(zhuǎn)基因植物及手性藥物的進一步發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種從粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)YM25079中分離的蘋果酸脫氫酶基因RGMDHl，該基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或該核苷酸序列的片段，或與SEQ ID NO:1互補的核苷酸序列，該基因序列長為978bp(堿基)，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽或其片段。
[0005]本發(fā)明另一目的是提供一種含有所分離的蘋果酸脫氫酶基因RGMDHl的重組表達(dá)載體，是將SEQ ID NO:1所示基因直接與不同表達(dá)載體(質(zhì)粒、病毒或運載體)連接所構(gòu)建的重組載體。
[0006]本發(fā)明另一目的是提供一種含有該蘋果酸脫氫酶基因RGMDHl的重組表達(dá)載體或上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞大腸桿菌(Escherichia coli)菌株BL21。
[0007]用本發(fā)明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，用CaCl2、電穿孔等方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用DNA轉(zhuǎn)染法、顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等方法。
[0008]本發(fā)明提供的核苷酸序列是一種高效、特異性的蘋果酸脫氫酶基因，可以將其與載體連接后轉(zhuǎn)化至微生物細(xì)胞體內(nèi)生產(chǎn)蘋果酸脫氫酶，具有產(chǎn)物特異性高、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)不受場地、氣候、季節(jié)的影響及利用不同的菌種和培養(yǎng)基適合開發(fā)商業(yè)化蘋果酸脫氫酶等優(yōu)點;本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建特異性生產(chǎn)蘋果酸脫氫酶的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)蘋果酸脫氫酶，具有操作簡單、成本低、可行性高等優(yōu)點，為蘋果酸脫氫酶基因工程化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0009]圖1為利用本發(fā)明的粘紅酵母YM25079蘋果酸脫氫酶基因RGMDHl構(gòu)建的大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pET32aRGMDHl質(zhì)粒圖譜；
圖2為本發(fā)明的蘋果酸脫氫酶基因RGMDHl誘導(dǎo)表達(dá)并純化后的SDS-PAGE分析圖，其中:I為蛋白電泳Marker;2為轉(zhuǎn)化了pET32a( + )并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21總蛋白；3為轉(zhuǎn)化了pET32aRGMDHl并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21總蛋白；4為純化的目的蛋白條帶。
【具體實施方式】
[0010]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內(nèi)容，實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規(guī)試劑和使用常規(guī)方法。[0011 ]實施例1:粘紅酵母蘋果酸脫氫酶基因RGMDHl的克隆
米用OMEGA試劑盒E.Z.N.A Fungal RNA Kit從粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)YM25079中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Thermo Scientific Maxima H Minus FirstStrand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，取Ιμ?為模板進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。設(shè)計引物(引物I和引物2)進行PCR擴增，反應(yīng)所用引物、組分和擴增條件如下:
引物P1:RGMDHF1: 5'-ATGGGCCTCAAGACTGCTGTTCTC-3' (SEQ ID NO:3)
引物P2:RGMDHR1: 5'-TTACTGCTTCATGAAGTTCTGAC-3' (SEQ ID NO:4)
PCR擴增體系(50 yL)組成如下:
5 X Trans PFU Buffer1yL
dNTP(2.5ymol/L)5yL
cDNAIyL
RGMDHFl(10ymol/L)2yL
RGMDHRl(10ymol/L)2yL
Fast Pfu DNA polymerase(5U/yL)2yL
無菌ddifeO補足至50yL; 擴增條件:94°C變性4min，再用94°C 45s,56°C 45s,72°C 90s進行30個循環(huán)，最后72°ClOmin，反應(yīng)完后取產(chǎn)物lyL，然后在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中，進行電泳分析。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像確認(rèn)片段大小正確后，用百泰克生物技術(shù)有限公司多動能DNA純化回收試劑盒回收目的片段，然后將PCR擴增得到的目的基因連接到PMD18-T上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用含有氨芐青霉素(Amp+)的LB固體平板進行篩選，挑取平板上的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR篩選陽性克隆，然后送去上海生工測序。測序結(jié)果結(jié)果顯示，獲得一段978bp長的序列，命名為RGMDHl，序列組成如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0012]實施例2:重組表達(dá)質(zhì)粒pET32aRGMDHl的構(gòu)建
采用實施例1中的cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)所用引物組合、反應(yīng)組分和擴增條件如下:
引物P3:RGMDHF2: 5'-TACGGATCCATGGGCCTCAAGACTGCT -3' (SEQ ID NO:5)
引物P4:RGMDHR2: 5'-CGTCTCGAGCTGCTTCATGAAGTTCTG-3' (SEQ ID NO:6)
PCR擴增體系(50 yL)組成如下:
5X Fast Pfu Buffer1yL
dNTP(2.5 ymol/L)5yL
cDNAIyL
RGMDHF2C10 ymol/L)IyL
RGMDHR2C10 ymol/L)IyL
Fast Pfu DNA polymerase(5U/pL) IyL無菌ddifeO補足至50yL;
擴增條件:94°C變性4min，再用94°C 45s,59°C 45s,72°C 2min進行30個循環(huán)，最后72°C 1min;取純化的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-32a分別用BamH I和Xho I酶切過夜，50μ1 PCR產(chǎn)物反應(yīng)體系:PCR產(chǎn)物25yL，10XTango Buffer 10yl,BamH I 2μ1 和Xho I 1.5yL，用滅菌的雙蒸水補齊，37°C酶切過夜。50μ1質(zhì)粒pET-32a反應(yīng)體系:質(zhì)粒pET-32a 15μ1，10 X TangoBuffer IΟμI,BamH I 2μ1和Xho Il.5yL，用滅菌的雙蒸水補齊，37°C酶切過夜。電泳檢驗酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進行純化和回收。連接體系(1yL):純化的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-32a按7:1加樣，140嫩連接酶0.541^，14 Buffer lyL，16°C連接過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中。37°C振蕩培養(yǎng)1.5h后，培養(yǎng)液涂布含氨芐的LB培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，挑取平板上的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR，篩選陽性克隆，構(gòu)建獲得重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET32aRGMDHl，該質(zhì)粒圖譜如圖1所示。
[0013]實施例3:蘋果酸脫氫酶基因RGMDHl在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達(dá) 1、蘋果酸脫氫酶蛋白RGMDHl的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
為了驗證該基因編碼蛋白的活性，將Iyg重組質(zhì)粒pET32aRGMDHl加入50yL大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，，將整個體系冰浴30min之后于42°C熱擊90s，再次冰浴2min，然后將連接體系吸取并加入至9 5 OyL LB液體培養(yǎng)基中，3 7 °C、1 Or pm振蕩孵育I h。孵育結(jié)束后于5000rpm離心10 min，留下約80yL上清液懸浮沉淀后涂布于含有氨節(jié)青霉素(Amp+)的LB固體平板，37°C倒置培養(yǎng)10h。
[0014]挑取陽性轉(zhuǎn)化子于100 mL LB(含100yg/mL氨芐霉素)培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜，將富集的菌液按1%比例接種到IL LB液體培養(yǎng)基中，于37°C，160rpm培養(yǎng)至0D600值約為0.8。取5ml菌液作為空白對照，其余加入IPTG至終濃度為Immo 1/L，于15 °C恒溫?fù)u床80rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)8小時，12000 rpm離心15min收集菌體。SDS-PAGE分析顯示，pET32aRGMDHl轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達(dá)出一條分子量約為50kD的蛋白(見圖2泳道3)，但在空載體pET32a( + )轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中沒有(見圖2泳道2 )。
[0015]進一步用該菌體懸浮于適量(使菌懸液的OD6qq?20)30 mM的咪唑緩沖液中，冰上超聲破碎細(xì)胞，4°C、14000 rpm離心15 min。將離心后的上清液用0.2μπι的微型濾膜過濾，濾液上樣于已用30mM咪唑緩沖液平衡好的His Trap HP柱(I ml, GE Healthcare)，用200mM咪唑緩沖液進行洗脫，洗脫液用離心管按順序收集，洗脫樣品用SDS-PAGE電泳檢測，獲得一純蛋白條帶(見圖2泳道4)。
[0016]2、蘋果酸脫氫酶RGMDHl的酶活測定
蘋果酸脫氫酶是調(diào)控蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶，可以催化蘋果酸進行脫氫氧化，伴隨著產(chǎn)生草酰乙酸和NADH。由于MDH的酶活在一定的反應(yīng)時間內(nèi)與反應(yīng)產(chǎn)物NADH的濃度變化呈線性關(guān)系，所以MDH的活性可通過檢測NADH的濃度變化來測定。以蘋果酸和NAD(+)為底物加入蘋果酸脫氫酶進行反應(yīng)，用紫外分光光度計在340nm處測定酶活。MDH酶活的的計算:
單位定義:一個酶活力單位是指25°C時每分鐘生成IymolNADH所需的酶量。
[0017]蘋果酸脫氫酶酶活計算公式:
E=[( Ae/At) XVtXdf]/(eXDXVsXC)
= [(0.315-0.236) X 1.9X95]/(6.42X1X0.02X0.3482)
=318.93U/mg
Vt-----反應(yīng)溶液總體積(ml)
ε-----340nm處測定的NADH的吸光度為6.42
D-----光路長(I cm)(比色皿直徑)
Vs-----酶液體積(ml)
C-----蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)
A e/ Δ t----1min內(nèi)340nm處吸光度的變化
df稀釋因子
結(jié)果顯示，所純化的蘋果酸脫氫酶RGMDHl的酶活為318.93 U/mg，表明基因重組載體在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)出來的蘋果酸脫氫酶RGMDHl具有蘋果酸脫氫酶的活性。
【主權(quán)項】
1.一種蘋果酸脫氫酶基因RGMDHl，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.—種含有權(quán)利要求1所述蘋果酸脫氫酶基因RGMDHl的重組表達(dá)載體。
【文檔編號】C12N15/53GK105838724SQ201610258934
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月25日
【發(fā)明人】張琦, 王俊, 季秀玲, 魏云林, 林連兵
【申請人】昆明理工大學(xué)