家蠶BmP56基因啟動(dòng)子及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及家蠶BmP56基因啟動(dòng)子及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用，其中家蠶BmP56基因啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，將該啟動(dòng)子構(gòu)建重組表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子能夠在家蠶中腸特異表達(dá)目的基因；因此家蠶BmP56基因啟動(dòng)子及其含有家蠶BmP56基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體能夠特異標(biāo)記家蠶中腸細(xì)胞，該啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)為研究家蠶中腸特異表達(dá)基因，特別是免疫相關(guān)基因提供了有力的工具。
【專利說(shuō)明】
家蠶BmP56基因啟動(dòng)子及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及家蠶BmP56基因啟動(dòng)子，還涉及含有該啟動(dòng)子 的重組表達(dá)載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 家蠶是一種具有重要價(jià)值的經(jīng)濟(jì)昆蟲和鱗翅目模式昆蟲，在人類歷史文化及經(jīng)濟(jì) 生活中占據(jù)重要地位。中腸是家蠶的一個(gè)重要消化器官，同時(shí)也是一個(gè)重要免疫器官，幼蟲 期家蠶食桑，經(jīng)過(guò)腸道的消化吸收，為全身提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)也為外界病源物經(jīng)食桑進(jìn)入腸道 感染腸道上皮細(xì)胞提供可能，因此中腸也就成為家蠶抵御外界病源物感染的第一道屏障。 隨著家蠶基因組框架圖、精細(xì)圖及遺傳變異圖譜的相繼完成，有關(guān)家蠶中腸的研究也越來(lái) 越多，如何更大地提高家蠶中腸對(duì)外界病源物的免疫抵抗能力，也成為后基因組時(shí)代研究 人員追求的目標(biāo)，事關(guān)蠶業(yè)發(fā)展。雖然家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成熟，相關(guān)配套研究工具也越來(lái)越 多，也有家蠶中腸高量表達(dá)啟動(dòng)子的報(bào)道，但仍需探索和完備，畢竟不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基 因表達(dá)的能力與抵抗病源物的能力極相關(guān)，生產(chǎn)上需要高抗品種，啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)能力越強(qiáng)越 好，免疫抵抗能力越高越好。因此，鑒定新的家蠶中腸特異表達(dá)基因啟動(dòng)子成為一種試圖提 高家蠶中腸自身免疫能力的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供家蠶BmP56基因啟動(dòng)子;本發(fā)明的目的之二 在于提供含有家蠶BmP56基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體；本發(fā)明的目的之三在于提供家蠶 BmP56基因啟動(dòng)子在家蠶中腸特異啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之五在于提 供重組表達(dá)載體在家蠶中腸特異啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0005] 1、家蠶BmP56基因啟動(dòng)子，所述家蠶BmP56基因啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0006] 2、含有所述家蠶BmP56基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體。
[0007]優(yōu)選的，所述重組載體含有家蠶BmP56基因啟動(dòng)子和SV40終止信號(hào)的表達(dá)框。
[0008] 優(yōu)選的，所述重組載體由以下方法制備:將pBac[3 XP3-EGFP afm]載體經(jīng)AscI酶 切后然后去磷酸化，然后與含有家蠶BmP56基因啟動(dòng)子和SV40終止信號(hào)的表達(dá)框連接而得。
[0009] 更優(yōu)選的，所述含有家蠶BmP56基因啟動(dòng)子和SV40終止信號(hào)的表達(dá)框由以下方法 制得：以SEQ ID N0.1和SEQ ID勵(lì).2為引物，家蠶基因組0嫩為模板克隆所述家蠶&1^56基 因啟動(dòng)子，然后以SEQIDN0.4和SEQIDN0.5為引物，pBac[3XP3-DsRedaf]載體為模板 克隆含有紅色熒光蛋白基因及SV40終止信號(hào)的片段DsRedSV40,然后將家蠶BmP56基因啟動(dòng) 子與DsRedSV40混合后，以SEQIDN0.1和SEQIDN0.5為引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得含有家蠶 BmP56基因啟動(dòng)子和SV40終止信號(hào)的表達(dá)框。
[0010] 3、所述家蠶BmP56基因啟動(dòng)子在家蠶中腸特異啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
[0011] 優(yōu)選的，所述目的基因?yàn)闃?biāo)記基因或功能基因。所述標(biāo)記基因?yàn)榧t色熒光蛋白基 因（DsRed)。
[0012] 4、所述的重組表達(dá)載體在家蠶中腸特異啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
[0013]優(yōu)選的，所述目的基因?yàn)闃?biāo)記基因或功能基因。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明克隆獲得了家蠶BmP56基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠 在家蠶中腸特異表達(dá)幾丁質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)，因此可以利用該啟動(dòng)子使目標(biāo)基因在家蠶 中腸中特異表達(dá)目標(biāo)基因，為免疫抗性相關(guān)基因提供有力的工具;本發(fā)明還構(gòu)建了含有家 蠶BmP56基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體能夠用于轉(zhuǎn)基因家蠶的研究，具有良 好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0016] 圖1為轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體的熒光觀察照片(A:成蟲（白光下)B:成蟲(熒光下））。
[0017] 圖2為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體中DsRed基因的表達(dá)特征(]?，01^000?1118;1 :轉(zhuǎn)基因個(gè)體中 腸組織;2:轉(zhuǎn)基因個(gè)體除中腸外剩余所有組織;3:非轉(zhuǎn)基因個(gè)體中腸組織;4:非轉(zhuǎn)基因個(gè)體 除中腸外剩余所有組織）。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著） 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0019] 實(shí)施例1、克隆家蠶BmP56基因啟動(dòng)子
[0020] 提取家蠶大造基因組DNA，根據(jù)現(xiàn)有的家蠶全基因組芯片數(shù)據(jù)和家蠶基因組數(shù)據(jù) 庫(kù)(http://s i lkworm · swu · edu · cn/s i lkdb/)，設(shè)計(jì)家蠶BmP56基因啟動(dòng)子上、下游引物對(duì)：
[0023] 然后以家蠶基因組為模板，以SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò) 增條件為94 °C預(yù)變性4分鐘;94 °C變性30秒，52 °C退火30秒，72 °C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán);72 °C延伸10分鐘，4 °C保存，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收后經(jīng)測(cè)序獲得家蠶BmP56基因啟動(dòng) 子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0024] 實(shí)施例 2、構(gòu)建 T-P56DsRedSV40 載體
[0025] 根據(jù)pBac[3XP3_DsRed af]載體(公開號(hào)為102296071A的中國(guó)專利）中紅色熒光 蛋白基因 DsRed序列及終止信號(hào)SV40設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增含DsRed和SV40的片段(DsRedSV40)，
[0026] 上游引物DsRedSV40_F: 5 ' -gattccgaatatcgcgatggtgcgctcctccaagaacg-3 '（ SEQ ID NO.4)；
[0027] 下游引物DsRedSV4〇-R:5'-ctaggcgcgccgtacgcgtatcg_3'（SEQ ID N0.5);
[0028] 然后以pBac[3XP3-DsRedaf]載體為模板，以SEQIDN0.4和SEQIDN0.5為引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94 °C預(yù)變性3分鐘;94 °C變性30秒，53 °C退火30秒，72 °C延伸1分 鐘，共30個(gè)循環(huán);72°C延伸10分鐘，4°C保存，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得DsRedSV40片段。
[0029] 將克隆獲得的家蠶BmP56基因啟動(dòng)子和DsRedSV40片段等體積混合，以此混合物為 模板，并以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:5為上、下游引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，依擴(kuò)增條件為:94°C 預(yù)變性3分鐘;94°C變性30秒，50°C退火1分鐘，72°C延伸3分鐘，共35個(gè)循環(huán);最后72°C延伸 10分鐘，4 °C保存)進(jìn)行搭橋PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收獲得以家蠶BmP56基因啟動(dòng)子為啟動(dòng) 信號(hào)和SV40為終止信號(hào)的表達(dá)框，命名為P56DsRedSV40。
[0030] 將P56DsRedSV40表達(dá)框片段與T克隆載體pEASY-T simple連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感 受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，獲得含有家蠶BmP56基因啟動(dòng)子的載體，命名為T-P56DsRedSV40載 體。
[0031] 實(shí)施例3、構(gòu)建含家蠶BmP56基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體
[0032] 用限制性內(nèi)切酶As c I于37 °C分別酶切pBac [ 3 X P3-EGFP af m](公開號(hào)為 102296071A的中國(guó)專利）和T-P56DsRedSV40約4小時(shí)，回收pBac[3XP3-EGFP afm]載體骨架 和P56DsRedSV40片段。pBac[3XP3-EGFP afm]骨架經(jīng)堿性磷酸酶于50°C處理并純化，獲得 去磷酸化的pBac[3XP3-EGFP afm]骨架。將P56DsRedSV40片段與pBac[3XP3-EGFP afm]骨 架混合后在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)完成后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì) 胞，經(jīng)篩選獲得含家蠶&1^56基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體，命名為?8 &〇[?56081^(13￥40,3\ P3EGFP]重組表達(dá)載體。
[0033]實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因顯微注射和陽(yáng)性個(gè)體的篩選
[0034]將多化性家蠶正常桑葉飼養(yǎng)至化蛹化蛾后，將雌雄蠶蛾交配4小時(shí)，拆對(duì)后黑暗環(huán) 境中產(chǎn)卵。將此蠶卵在干凈的載玻片上整齊排列，用Eppendorf顯微注射系統(tǒng)將重組表達(dá)載 體pBac[P56DsRedSV40,3Xp3EGFP]和輔助質(zhì)料A3H-起注射進(jìn)300粒蠶卵中，催青10天左右 獲得155頭G0代蟻蠶，將成功飼養(yǎng)至化蛹化蛾的蠶，交配產(chǎn)卵，獲得55個(gè)蛾圈，經(jīng)熒光顯微鏡 篩選獲得7個(gè)陽(yáng)性蛾圈中有86頭陽(yáng)性個(gè)體。將陽(yáng)性個(gè)體飼養(yǎng)至化蛹化蛾，進(jìn)一步熒光顯微鏡 觀察，結(jié)果如附圖1所示。結(jié)果顯示獲得的轉(zhuǎn)基因個(gè)體眼睛有綠色熒光出現(xiàn)，確認(rèn)獲得轉(zhuǎn)基 因家香。
[0035]實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因家蠶的分子檢測(cè)
[0036]桑葉飼養(yǎng)轉(zhuǎn)基因家蠶至5齡中期，分別取轉(zhuǎn)基因家蠶和非轉(zhuǎn)基因家蠶的中腸組織 及除中腸外剩余所有組織樣品，各2個(gè)共4個(gè)樣品，提取4個(gè)樣品的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，根據(jù)DsRed序列設(shè)計(jì)下游弓丨物，具體為：5'_ ctacaggaacaggtggtggcg_3'SEQ ID N0:6)。然后以SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6為上、下游 引物對(duì)，獲得的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因家蠶的中腸組織樣品中檢測(cè)到DsRed的表達(dá)，而在非轉(zhuǎn)基因家蠶的中腸組 織、轉(zhuǎn)基因家蠶和非轉(zhuǎn)基因家蠶的除中腸外剩余所有組織樣品中都未檢測(cè)到DsRed的表達(dá)， 說(shuō)明P56啟動(dòng)子確實(shí)是家蠶中腸特異表達(dá)啟動(dòng)子，可驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在家蠶中腸中特異表達(dá)。 [0037]最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在 形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 家蠶BmP56基因啟動(dòng)子，其特征在于:所述家蠶BmP56基因啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示。2. 含有權(quán)利要求1所述家蠶BmP56基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體含有家蠶BmP56基因啟 動(dòng)子和SV40終止信號(hào)的表達(dá)框。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組載體由以下方法制備： 將pBac[3XP3-EGFP afm]載體經(jīng)AscI酶切后然后去磷酸化，然后與含有家蠶BmP56基因啟 動(dòng)子和SV40終止信號(hào)的表達(dá)框連接而得。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述含有家蠶BmP56基因啟動(dòng)子 和SV40終止信號(hào)的表達(dá)框由以下方法制得：以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2為引物，家蠶基 因組DNA為模板克隆所述家蠶BmP56基因啟動(dòng)子，然后以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5為引 物，pBac[3XP3-DSRed af]載體為模板克隆含有紅色熒光蛋白基因及SV40終止信號(hào)的片段 DsRedSV40,然后將家蠶BmP56基因啟動(dòng)子與DsRedSV40混合后，以SEQ ID N0.1和SEQ ID NO. 5為引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得含有家蠶BmP56基因啟動(dòng)子和SV40終止信號(hào)的表達(dá)框。6. 權(quán)利要求1所述家蠶BmP56基因啟動(dòng)子在家蠶中腸特異啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述目的基因?yàn)闃?biāo)記基因或功能基因。8. 權(quán)利要求2~5任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體在家蠶中腸特異啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的 應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述目的基因?yàn)闃?biāo)記基因或功能基因。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK105886511SQ201610484773
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】段建平, 孟悅, 李瑩, 孟現(xiàn)鑫, 姚倫廠, 劉宗才, 闞云超
【申請(qǐng)人】南陽(yáng)師范學(xué)院