一種小麥胚特異表達啟動子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種小麥胚特異表達啟動子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5'端轉(zhuǎn)錄起始位點（transcription s1:a;rt site,TSS)上 游的一段可與RNA聚合酶II和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成一個轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體從而啟動其下游結(jié)構(gòu) 基因轉(zhuǎn)錄起始的DNA區(qū)段。它決定著轉(zhuǎn)錄的方向和效率，是結(jié)構(gòu)基因表達在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 中屯、。
[0003] 通常根據(jù)啟動子的作用方式和功能，可將植物基因啟動子分為組成型啟動子、組 織特異性啟動子和誘導型啟動子。組成型啟動子的基因表達不具組織和時間特異性，表達 水平相對穩(wěn)定，外界因素對組成型啟動子啟動的外源基因的表達也幾乎沒有影響。常用的 組成型啟動子有來自煙草花葉病毒基因啟動子化MV35S，水稻肌動蛋白基因（actinl)啟動 子和玉米泛素蛋白基因（ubiquitin-1)啟動子。誘導型啟動子驅(qū)動的下游結(jié)構(gòu)基因則在外 部環(huán)境信號、植物內(nèi)部生長代謝信號的誘導下才表達。植物對不利于其生長發(fā)育的外界環(huán) 境信號如寒、旱、堿和病蟲害等，都會誘導一些基因的表達來抵御運些逆境。誘導型啟動子 中具有與誘導表達相關(guān)的各種元件，包括應(yīng)答光信號、代謝調(diào)控信號、生物脅迫信號、環(huán)境 信號的元件等。組織特異性啟動子驅(qū)動下游結(jié)構(gòu)基因在植物不同發(fā)育階段特定的組織中表 達。組織特異性啟動子不僅能夠在一定器官或組織部位積累目的基因的表達產(chǎn)物，增加區(qū) 域表達量，同時也能避免植物營養(yǎng)的不必要浪費。
[0004] 啟動子在植物生物學和生物技術(shù)研究中有著至關(guān)重要的作用，它的應(yīng)用大體可W 分為Ξ類:1、驅(qū)動外源基因在植物體中的表達，從而獲得有利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的有利性狀，或者 用于轉(zhuǎn)基因研究；2、W植物體為生物反應(yīng)器，驅(qū)動外源基因在植物體整株表達或某組織器 官特異表達生產(chǎn)外源蛋白；3、利用植物代謝中的關(guān)鍵基因在同源或異源植物系統(tǒng)中表達， 從而修飾或調(diào)解植物生理狀況。在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中常需要篩選標記基因來賦予被轉(zhuǎn)化細 胞抗性，然后在一定篩選壓下篩選出陽性細胞，再進一步分化出轉(zhuǎn)基因植株，而運類篩選標 記基因則需要如化MV35S的組成型啟動子驅(qū)動，從而在轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育的各個階段各 個組織中均表達，有利于轉(zhuǎn)基因植物的篩選。另外，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中，還可W通過相關(guān)啟 動子來驅(qū)動各種抗性基因，從而使農(nóng)作物獲得抗旱、抗病、抗蟲和抗除草劑等性狀，W提高 其產(chǎn)量。植物啟動子也可W應(yīng)用于過表達一些代謝途徑關(guān)鍵節(jié)點的酶基因或者一些微量元 素轉(zhuǎn)運的轉(zhuǎn)運子來修飾代謝途徑，實現(xiàn)提高植物產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。
[0005] 啟動子除了應(yīng)用于修飾植物的性狀外，其更重要的應(yīng)用是W植物為生物反應(yīng)器生 產(chǎn)各種外源蛋白。例如，利用組成型啟動子CaMV35S和泛素蛋白基因啟動子已經(jīng)成功在植物 體中表達生產(chǎn)了抗原蛋白基因霍亂毒素 B亞基、不耐熱腸毒素 B亞基、乙肝表面抗原、保護性 抗原、狂犬病病毒糖蛋白G和SARS病毒糖蛋白S。利用組織特異性啟動子也廣泛應(yīng)用于外源 蛋白的表達生產(chǎn)，如馬鈴馨塊莖特異啟動子被應(yīng)用于生產(chǎn)霍亂毒素 B亞基、不耐熱腸毒素 B 亞基和乙肝表面抗原。另外，基于種子生物反應(yīng)器的優(yōu)勢，許多外源蛋白W種子為反應(yīng)器進 行生產(chǎn)，如利用水稻胚乳特異性啟動子Gtl3a在水稻胚乳中規(guī)?；a(chǎn)了具有生物活性的 人血清白蛋白，在玉米胚乳特異性啟動子LeglA的驅(qū)動下大規(guī)模的生產(chǎn)了飼料用酶植酸酶， 在大麥醇溶蛋白基因啟動子驅(qū)動下在小麥種子中生產(chǎn)熱穩(wěn)定性良好的植酸酶。
[0006] 鑒于啟動子在植物生物學和生物技術(shù)研究中的成功應(yīng)用，對新的啟動子特別是組 織特異性啟動子的克隆具有重要意義。小麥作為世界上重要的糧食作物之一，對小麥組織 特異啟動子，特別是小麥種子特異啟動子，進行克隆與研究尤為重要。目前報道的小麥種子 特異啟動子除膽藏蛋白相關(guān)基因啟動子外，鮮有其他種子特異啟動子報道，并且運些啟動 子主要在小麥種子胚乳中有活性。所W，對小麥展開種子組織特異性啟動子，特別是種子胚 啟動子的克隆尤為迫切且十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種小麥胚特異表達啟動子及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明提供的啟動子，命名為P-WZ，獲自于小麥品種中國春，為如下1)或2)或3):
[0009] 1)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0010] 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；
[0011] 3)與1)限定的DNA序列具有90 % W上同源性且具有啟動子功能的DNA分子。
[001^ 上述嚴格條件可為在0.1 XSS陽(或0.1 XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65°C條件下雜 交并洗膜。
[0013] 含有所述啟動子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保 護范圍。
[0014] 所述重組載體可為在植物表達載體的多克隆位點或重組位點插入所述啟動子得 到重組質(zhì)粒。所述植物表達載體具體可為載體地GWSF7.0。所述重組載體具體可為將所述啟 動子插入植物表達載體PBGWSF7.0的重組位點間得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為 將所述啟動子取代植物表達載體pBGWS巧.0的attRl位點和attRl位點之間的小片段，得到 的重組質(zhì)粒。
[0015] 擴增所述啟動子的全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述引 物對具體可由序列表的序列2所示的單鏈DNA分子和序列表的序列3所示的單鏈DNA分子組 成。
[0016] 本發(fā)明還保護所述啟動子在啟動目的基因表達中的應(yīng)用。所述啟動目的基因表達 可為啟動目的基因特異性表達。所述特異性表達具體可為種子胚特異性表達。所述啟動目 的基因表達具體可為啟動植物中的目的基因表達。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植 物。所述單子葉植物可為被子植物。所述被子植物可為禾本目植物。所述禾本目植物可為禾 本科植物。所述禾本科植物可為小麥屬植物。所述小麥屬植物具體可為小麥，例如小麥科農(nóng) 199。所述目的基因具體可為GUS基因。
[0017] 本發(fā)明還保護一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是在出發(fā)植物中用所述啟動子啟動目 的基因的表達，得到表達所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。所述"表達所述目的基因"可為"在種 子胚中特異性表達所述目的基因"。所述出發(fā)植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子 葉植物可為被子植物。所述被子植物可為禾本目植物。所述禾本目植物可為禾本科植物。所 述禾本科植物可為小麥屬植物。所述小麥屬植物具體可為小麥，例如小麥科農(nóng)199。所述目 的基因具體可為GUS基因。所述方法中，可將特異DM分子導入所述出發(fā)植物，從而在所述出 發(fā)植物中用所述啟動子啟動目的基因的表達;所述特異DNA分子自上游至下游依次包括所 述啟動子和所述目的基因。所述特異DNA分子具體可通過含有所述特異DNA分子的重組表達 載體導入所述出發(fā)植物。所述重組表達載體具體可為W上任一所述的重組載體。
[0018] 本發(fā)明還保護一種制備目的蛋白的方法，是在出發(fā)植物中用所述啟動子啟動所述 目的蛋白的編碼基因的表達，得到所述目的蛋白。所述目的蛋白特異性存在于植物種子胚 中。所述出發(fā)植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物可為被子植物。所述被子 植物可為禾本目植物。所述禾本目植物可為禾本科植物。所述禾本科植物可為小麥屬植物。 所述小麥屬植物具體可為小麥，例如小麥科農(nóng)199。所述目的蛋白具體可為GUS。所述目的蛋 白的編碼基因具體可為GUS基因。所述方法中，可將特異DNA分子導入所述出發(fā)植物，從而在 所述出發(fā)植物中用所述啟動子啟動所述目的蛋白的編碼基因的表達;所述特異DNA分子自 上游至下游依次包括所述啟動子和所述目的基因。所述特異DNA分子具體可通過含有所述 特異DNA分子的重組表達載體導入所述出發(fā)植物。所述重組表達載體可為W上任一所述的 重組載體。
[0019] 本研究發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一個在小麥種子胚中特異表達的啟動子，并通過轉(zhuǎn)基 因?qū)嶒炞C明了該啟動子在小麥種子胚中特異、高效表達。本發(fā)明可應(yīng)用于植物(例如小麥） 種子性狀的遺傳改良或植物(例如小麥)生物反應(yīng)器等，具有巨大的科研及商業(yè)應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0020] 圖1為載體pD0NR?221的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0021] 圖2為載體地GWSF7.0的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022] 圖3為PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖。
[0023] 圖4為部分T1代植株的PCR鑒定結(jié)果。
[0024] 圖5為GUS組織化學染色的結(jié)果;A:小麥科農(nóng)199的成熟種子;B:授粉后15天的純合 的轉(zhuǎn)基因株系的T2代植株上長的種子;C:授粉后25天的純合的轉(zhuǎn)基因株系的T2代植株上長 的種子;D:未進行任何處理的純合的轉(zhuǎn)基因株系的T2代植株上長的成熟種子;E:吸水12小 時后的純合的轉(zhuǎn)基因株系的T2代植株上長的成熟種子;F:吸水36小時后的純合的轉(zhuǎn)基因株 系的T2代植株上長的成熟種子;G:純合的轉(zhuǎn)基因株系的T3代植株Ξ葉期的葉片;H:純合的 轉(zhuǎn)基因株系的T3代植株Ξ葉期的根;I:純合的轉(zhuǎn)基因株系的T3代植株Ξ葉期的幼莖。
【具體實施方式】
[0025] W下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設(shè)置Ξ次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。
[0026] 載體pD0NR?221 (結(jié)構(gòu)示意圖見圖 1): Invitrogen，12536-017。
[0027] 載體 pBGWSF7.0(結(jié)構(gòu)示意圖見圖2):參考文獻：Karimi，M.，Inz 自，D.，Depicker， A.,Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.Trends Plant Sci.2002May;7(5):193-195。
[0028] 小麥"中國春"（簡稱小麥中國春）：參考文獻:彭遠英，彭正松，宋會興.小麥中國春 背景下長穗偃麥草光合作用相關(guān)基因的染色體定位[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2005,38(11): 2182-2188。
[0029] 小麥"科農(nóng)19滬（簡稱小麥科農(nóng)199):參考文獻:張諱，王靜，紀軍，王志國，安調(diào)過， 張相岐，張愛民，李俊明.冬小麥新品種"科農(nóng)199"選育和推廣[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報.2011 (05)。
[0030] 實施例1、啟動子的發(fā)現(xiàn)
[0031] 提取小麥品種中國春的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)過大量序列分析、表達量分析 與功能驗證，從cDNA中發(fā)現(xiàn)了 一個種子特異表達的miRNA，將其命名為miRNA-wz?；?