本發(fā)明屬于熒光探針材料技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種用于檢測羧酸酯酶1(ces1)的增強型熒光探針及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù):
羧酸酯酶(carboxylesterase,ces)是一種多聚蛋白,具有催化水解多種酯類化合物的能力,水解后釋放出醇、羧酸和水分子?;隰人狨ッ改軌虼呋喾N酯類基底物的特性,羧酸酯酶在工業(yè)生產(chǎn)、有機合成、藥物活化劑等實際應(yīng)用方面有著廣泛應(yīng)用。羧酸酯酶主要分為兩個亞型:羧酸酯酶1(ces1)和羧酸酯酶2(ces2),兩者在催化性能上有明顯的差異:ces1會優(yōu)先選擇性地催化水解能得到小片段(不含苯環(huán)結(jié)構(gòu))的羧基及大片段的羥基的酯類底物,而ces2會優(yōu)先選擇性地催化水解能得到大片段(含苯環(huán)結(jié)構(gòu))的羧基和小片段的羥基化合物的酯類底物。因此ces1與ces2在工業(yè)生產(chǎn)、有機合成等方面的應(yīng)用范圍也有著顯著的差別。于是開發(fā)一種能夠選擇性檢測ces1或ces2的新方法成為目前工業(yè)生產(chǎn)、有機合成等領(lǐng)域的研究熱點。
目前已有多種用于檢測ces的分析方法,如化學(xué)發(fā)光法、高效液相色譜法(hplc)以及熒光檢測法等。
化學(xué)發(fā)光法主要有液相化學(xué)發(fā)光法和生物化學(xué)發(fā)光法兩種。液相化學(xué)發(fā)光法是指在生物酶的催化作用下,羧酸酯酶與氧氣生成過氧化氫的基質(zhì),再與堿性溶液發(fā)生反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)的n-甲基亞酮,產(chǎn)生最大發(fā)射波長470nm的光,從而間接測定酶含量;生物化學(xué)發(fā)光法將化學(xué)發(fā)光的高靈敏性與酶反應(yīng)結(jié)合,產(chǎn)生連續(xù)的冷光輻射,從而間接測定酶含量。然而化學(xué)發(fā)光法選擇性較差、發(fā)光體系相對較少。
hplc法用于檢測羧酸酯酶,首先選定緩沖溶液作溶劑,并設(shè)定流速和柱溫。淋洗后,改變線性梯度,再淋洗一段時間。隨后色譜柱用洗脫液沖洗,沖洗完畢后,繼續(xù)用開始條件淋洗。在柱內(nèi)各成分被分離后,進入檢測器進行檢測,從而實現(xiàn)對試樣的分析,然而hplc法對于羧酸酯酶的檢測過程十分繁瑣,且易受干擾。
近年來,作為新型的檢測手段的熒光檢測法備受各界關(guān)注,熒光檢測法使用的設(shè)備簡單,響應(yīng)快,具有優(yōu)異的靈敏度以及能夠?qū)崿F(xiàn)對物質(zhì)的實時檢測等特點。此外,用于熒光檢測的化合物的結(jié)構(gòu)大多比較簡單,易于設(shè)計與改進來滿足多種檢測樣品的需求。綜上所述,熒光檢測法十分適合于對羧酸酯酶的分析檢測。然而現(xiàn)階段對于檢測ces2的發(fā)明專利較多,如中國專利(申請?zhí)枺?01310587411.0,申請?zhí)朿n201410513296.7,申請?zhí)朿n201410836704.2,cn201510224354.9等)。檢測ces1的報道相對較少,文獻報道合成了一種基于蟲熒光素的檢測ces1的熒光探針dme(chem.commun.,2016,52,3183-3186),然而蟲熒光素的價格昂貴、合成復(fù)雜,且探針穩(wěn)定性較差,必須在零下20攝氏度的低溫下保存,因此不適合長時間的保存,不利于實際應(yīng)用。中國專利(申請?zhí)朿n201610119590.9)制備了一種(s)-4,5-二氫-2-(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸酯衍生物(簡稱dbt-r),將其作為ces1的檢測探針;探針與ces1反應(yīng)后水解成熒光素酶的底物(s)-4,5-二氫-2-(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸化合物(簡稱dbtc),利用dbtc與熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生生物發(fā)光進行檢測。然而此種探針的制備方法繁瑣,需通過2次反應(yīng)才能顯現(xiàn)出結(jié)果;熒光素酶容易失活,檢測結(jié)果易出現(xiàn)比較大的偏差;后續(xù)測試所用ph緩沖液值限定在6.5,沒有探究更廣的酸堿度范圍的結(jié)果,應(yīng)用受限;制備過程中使用了劇毒的氰化鈉,不利于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。綜上所述,目前本領(lǐng)域急需發(fā)展一種準(zhǔn)確度高、抗干擾性強、制備簡單且毒性低、應(yīng)用范圍廣的羧酸酯酶1的檢測方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
為了解決目前現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足之處,本發(fā)明的首要目的在于提供一種用于檢測羧酸酯酶1(ces1)的增強型熒光探針。該熒光探針以香豆素為母體,在ces1催化端酯基發(fā)生水解反應(yīng)的條件下,通過分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)(ict效應(yīng))來實現(xiàn)對ces1的熒光增強檢測。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述增強型熒光探針的一種簡易制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述增強型熒光探針的實際應(yīng)用。所述探針在羧酸酯酶1檢測中的應(yīng)用。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。
一種用于檢測羧酸酯酶1的增強型熒光探針,所述熒光探針為3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下:
制備以上所述的一種用于檢測羧酸酯酶1的增強型熒光探針的方法,包括如下步驟:
(1)將3-甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯,n-溴代琥珀酰亞胺(nbs)和偶氮二異丁腈(aibn)溶于四氯化碳中,得混合液;
(2)將混合液加熱至回流,反應(yīng)后冷卻至室溫,反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化,得到3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯。
優(yōu)選的,步驟(1)所述3-甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯與n-溴代琥珀酰亞胺的摩爾比為1:(0.9-1)。
優(yōu)選的,步驟(1)所述偶氮二異丁腈的用量為3-甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯的摩爾量的0.1%。
優(yōu)選的,步驟(2)所述反應(yīng)的溫度為80℃-85℃。
優(yōu)選的,步驟(2)所述反應(yīng)的時間為4-5小時。
優(yōu)選的,步驟(2)所述分離純化的步驟為:將反應(yīng)產(chǎn)物抽濾并收集有機相,再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑,所得固體經(jīng)硅膠層析柱純化。
以上所述的增強型熒光探針在檢測羧酸酯酶1中的應(yīng)用。
優(yōu)選的,所述增強型熒光探針對羧酸酯酶1進行定性和定量分析。
相對于現(xiàn)有技術(shù),本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
(1)本發(fā)明的熒光探針化合物,通過引入了溴原子,調(diào)節(jié)了3-位取代基的電子效應(yīng),因此探針化合物對羧酸酯酶1(ces1)的檢測具有優(yōu)異的抗干擾性,常見的離子、蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)無法與探針中的酯基發(fā)生水解反應(yīng),因此不會導(dǎo)致熒光的增強,從而不會干擾探針對于ces1的檢測,表明探針分子具有優(yōu)異的檢測特異性。
(2)本發(fā)明的熒光探針化合物在不同ph的緩沖溶液中依舊保持了良好的穩(wěn)定性,測試效果也不受ph的影響,擴大了探針在不同酸堿度環(huán)境下的應(yīng)用范圍。
(3)本發(fā)明中的探針化合物由作為識別基團的酯基及具有熒光性質(zhì)的熒光團香豆素所組成;在不存在ces1的條件下,探針化合物中香豆素的熒光被淬滅,熒光信號減弱,探針化合物只有在存在ces1的條件下才會快速地發(fā)生水解反應(yīng),3-取代基上溴原子的電子效應(yīng)有利于促進ces1和酯基的反應(yīng),反應(yīng)后分子結(jié)構(gòu)中吸電子的酯基轉(zhuǎn)變成供電子的羥基,得到7-羥基-3-溴甲基-2h-吡喃-2-酮,引發(fā)了分子內(nèi)部的不同基團間的電子轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)的發(fā)生(ict效應(yīng)),促使了香豆素母體的熒光信號恢復(fù)。因此本探針能實現(xiàn)對ces1的熒光檢測,并且伴隨著ces1濃度的增加,所產(chǎn)生的藍(lán)色熒光也逐漸增強。這種熒光增強型的檢測模式具有能夠有效直觀,易于觀測的優(yōu)點,并且本探針提高了現(xiàn)有探針的檢測的精度與準(zhǔn)確性。在一定的濃度范圍內(nèi),熒光強度與ces1濃度存在良好的線性關(guān)系,可用于定量的檢測。
(4)本發(fā)明所得的增強型熒光探針的檢測體系構(gòu)建了一種全新的準(zhǔn)確性高、靈敏度高的檢測ces1的方法,使用便捷,有利于其推廣應(yīng)用。
(5)本發(fā)明探針分子的合成制備工藝的產(chǎn)品產(chǎn)率高,制備方法簡單且成本低廉。
附圖說明
圖1為本發(fā)明增強型熒光探針的合成路線圖。
圖2為實施例1中增強型熒光探針3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯的核磁共振氫譜圖。
圖3為實施例1中增強型熒光探針3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯的質(zhì)譜圖。
圖4為本發(fā)明的熒光探針在ph為7.4的pbs緩沖溶液中在有無羧酸酯酶1存在時的熒光光譜圖。
圖5為本發(fā)明的熒光探針在ph為7.4的pbs緩沖溶液中與不同濃度羧酸酯酶1共存時的熒光光譜圖。
圖6為本發(fā)明的熒光探針在不同pbs值緩沖溶液中存在或不在羧酸酯酶1的熒光光譜圖。
圖7為本發(fā)明的熒光探針的特異性測試的熒光光譜圖。
圖8為本發(fā)明的熒光探針的抗干擾性檢測測試圖。
具體實施方式
為了更好地理解本發(fā)明,下面結(jié)合實施例與附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的闡述,但本發(fā)明的實施方式不限于此。
本發(fā)明的增強型熒光探針的合成路線圖如圖1所示。
實施例1:探針化合物3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯的制備工藝流程1
將1090mg3-甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯(5mmol),890mgn-溴代琥珀酰亞胺(5mmol)和0.82mg偶氮二異丁腈溶于30ml四氯化碳中,將混合液加熱至回流,控制反應(yīng)溫度為80℃進行反應(yīng),反應(yīng)4小時后停止反應(yīng),冷卻至室溫,對混合溶液進行抽濾,收集有機濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑,所得固體經(jīng)硅膠層析柱純化(淋洗劑為石油醚/乙酸乙酯,v/v=4:1),得到白色固體1115mg(產(chǎn)率為75.1%)。通過核磁共振氫譜對該產(chǎn)物進行表征,結(jié)果如圖2所示,表征數(shù)據(jù)如下:1hnmr(600mhz,cdcl3):δ7.85(s,1h),7.51(d,j=8.5hz,1h),7.14(d,j=2.1hz,1h),7.08(dd,j=8.5,2.1hz,1h),4.42(s,2h),2.35(s,3h).其中4.42ppm處的f對應(yīng)溴化反應(yīng)后,甲基上一個h被溴取代后剩余2個h的質(zhì)子峰。2.35ppm處的a對應(yīng)連接酯基的甲基上的3個h的質(zhì)子峰,7.85ppm處的e對應(yīng)雙鍵上的1個h的質(zhì)子峰,7.08-7.51ppm處的b,c,d為苯環(huán)上3個h的質(zhì)子峰。另外,通過高分辨的質(zhì)譜進行了輔助證明,結(jié)果如圖3所示,鑒定數(shù)據(jù)如下:hr-ms(esi):calcdforc12h9bro4([m+h]+)296.9757,found:296.9756。通過核磁和質(zhì)譜的分析可以確定所合成的產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯。
實施例2:探針化合物3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯的制備工藝流程2
將545mg3-甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯(2.5mmol),400mgn-溴代琥珀酰亞胺(2.25mmol)和0.41mg偶氮二異丁腈溶于15ml四氯化碳中,將混合液加熱至回流,控制反應(yīng)溫度為83℃進行反應(yīng),反應(yīng)4.5小時后停止反應(yīng),冷卻至室溫,對混合溶液進行抽濾,收集有機濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑,所得固體經(jīng)硅膠層析柱純化(淋洗劑為石油醚/乙酸乙酯,v/v=4:1),得到白色固體487mg(產(chǎn)率72.9%)。本實施例中探針3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯化合物表征與實施例1中的結(jié)果是相同的。
實施例3:探針化合物3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯的制備工藝流程3
將1635mg3-甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯(7.5mmol),1270mgn-溴代琥珀酰亞胺(7.125mmol)和1.23mg偶氮二異丁腈溶于50ml四氯化碳中,將混合液加熱至回流,控制反應(yīng)溫度為85℃進行反應(yīng),反應(yīng)5小時后停止反應(yīng),冷卻至室溫,對混合溶液進行抽濾,收集有機濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑,所得固體經(jīng)硅膠層析柱純化(淋洗劑為石油醚/乙酸乙酯,v/v=4:1),得到白色固體1508mg(產(chǎn)率71.3%)。本實施例中探針3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯化合物的表征與實施例1中的結(jié)果是相同的。
本發(fā)明所得探針化合物3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯的性能測試:
對實施例1制備的熒光探針3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯進行性能測試,測試結(jié)果如圖4-圖8所示
(1)探針化合物3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯的熒光性質(zhì):用pbs緩沖溶液(ph=7.4)配制空白對照樣與測試樣,空白樣中探針化合物濃度為5μm,不加入羧酸酯酶;測試樣中探針化合物濃度為5μm,ces1濃度為100u/l。在波長405nm的紫外激發(fā)光照射下,其熒光發(fā)射譜圖如圖4所示??瞻讟訜晒鈴姸冉咏诹?;然而測試樣中的探針分子在ces1存在的條件下,酯基基團發(fā)生水解反應(yīng),分子結(jié)構(gòu)中吸電子的酯基轉(zhuǎn)變成供電子的羥基,得到7-羥基-3-溴甲基-2h-吡喃-2-酮,引發(fā)了分子內(nèi)部的不同基團間的電子轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)的發(fā)生(ict效應(yīng)),促使了香豆素母體的熒光信號恢復(fù),故酯基水解成羥基后的探針分子在462nm左右發(fā)射出十分顯著的藍(lán)色熒光。由以上結(jié)果可見,本發(fā)明制備的探針化合物3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯可以用于環(huán)境樣品、生物樣品以及化學(xué)樣品中ces1進行定性檢測分析。
(2)探針化合物3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯pbs緩沖溶液(ph=7.4)中對不同濃度ces1的熒光響應(yīng)測試
配制ces1濃度分別為1,2,5,10,20,30,40,50,80,100,150,200u/l,探針化合物濃度均為5μm的一系列pbs緩沖溶液(ph=7.4)。分別測定每組測試樣在波長405nm的紫外激發(fā)光下的熒光發(fā)射譜圖,測試結(jié)果如圖5所示。隨著ces1濃度的增大,藍(lán)色熒光強度逐漸增強,故可實現(xiàn)對ces1的熒光增強型檢測,這種檢測模式直觀有效,能提高監(jiān)測的準(zhǔn)確性。由以上結(jié)果可見,本發(fā)明制備的探針化合物3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯可以用于環(huán)境樣品、生物樣品以及化學(xué)樣品中ces1進行定量檢測分析。
(3)探針化合物在不同ph緩沖液中的穩(wěn)定性測試
配制一系列ph值不同的測試樣,其中探針化合物濃度均為5μm,ph值分別為3,4,5,6,7,8,9的pbs緩沖溶液,測定各組在存在ces1(濃度5μm)或不存在ces1的情形下的熒光,繪制各組ph值(ph3-9)對應(yīng)的462nm處的熒光強度的點線圖,結(jié)果如圖6所示。測試結(jié)果表明,本發(fā)明中的探針對于ph有很好的穩(wěn)定性,測試效果也不會受到ph的干擾,這擴大了探針在不同酸堿度環(huán)境下的應(yīng)用范圍。
(4)探針化合物3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯的特異性檢測測試
分別配制濃度為50mm的hcy、gsh(谷胱甘肽)、cys(半胱氨酸)、lys、phe(苯丙氨酸)、arg(精氨酸)、dtt(二硫蘇糖醇)、gly(甘氨酸)測試樣pbs緩沖溶液(ph=7.4),濃度為100mm的na+、k+、ca2+、mg2+、gly、cys、dtt、h2o2、h3bo3測試樣pbs緩沖溶液(ph=7.4),濃度為100u/l的ces1和ces2的pbs緩沖溶液(ph=7.4)。探針化合物的濃度均為5μm,測定各組的熒光,繪制干擾物質(zhì)對應(yīng)的462nm處的熒光強度的柱狀圖,結(jié)果如圖7所示(1.na+,2.k+,3.ca2+,4.mg2+,5.gly,6.cys,7.dtt,8.h2o2,9.h3bo3,10.hcy,11.gsh,12.cys,13.lys,14.phe,15.arg,16.dtt,17.gly,18.ces2,19.ces1)。測試實驗表明,除了ces1存在的實驗組,其他干擾物質(zhì)實驗組的熒光都很微弱,說明了本發(fā)明的探針化合物對ces1的檢測具有特異性的優(yōu)點。
(5)探針化合物3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯的抗干擾性檢測測試
分別配制其他不同干擾物質(zhì)與ces1共存的測試樣pbs緩沖溶液(ph=7.4),其中na+、k+、ca2+、mg2+、gly、cys、dtt、h2o2、h3bo3的濃度為100mm,hcy、gsh、cys、lys、phe、arg、dtt、gly的濃度為50mm,ces2的濃度為100u/l。各組探針化合物的濃度均為5μm,ces1的濃度均為100u/l。對各組進行熒光測試,繪制不同干擾物與ces1共存的情況下對應(yīng)的462nm處熒光強度的柱狀圖,結(jié)果如圖8所示(1.na++ces1,2.k++ces1,3.ca2++ces1,4.mg2++ces1,5.gly+ces1,6.cys+ces1,7.dtt+ces1,8.h2o2+ces1,9.h3bo3+ces1,10.hcy+ces1,11.gsh+ces1,12.cys+ces1,13.lys+ces1,14.phe+ces1,15.arg+ces1,16.dtt+ces1,17.gly+ces1,18.ces2+ces1,19.ces1)。結(jié)果表明,其他物質(zhì)的存在不會干擾探針化合物對ces1的檢測,這說明了本發(fā)明的探針具有優(yōu)異的抗干擾性,對ces1的檢測能實現(xiàn)良好的準(zhǔn)確性與靈敏度。
本發(fā)明以增強型熒光探針分子3-溴甲基-2-氧代-2h-色烯-7-乙酸酯對羧酸酯酶1(ces1)進行檢測,該探針化合物以酯基作為ces1的識別基團,具有熒光性質(zhì)的溴化香豆素分子作為熒光信號基團。在不存在ces1的條件下,探針化合物沒有任何的熒光信號,探針化合物在存在ces1的條件下會快速的發(fā)生水解反應(yīng),分子結(jié)構(gòu)由吸電子的酯基轉(zhuǎn)變成供電子的羥基,得到7-羥基-3-溴甲基-2h-吡喃-2-酮,此過程引發(fā)了分子內(nèi)部的不同基團間的電子轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)的發(fā)生(ict效應(yīng)),促使了溴化香豆素母體的熒光信號增強。在波長405nm的紫外激發(fā)光的照射下,酯基水解后的探針分子在波長462nm發(fā)射出明顯的藍(lán)色熒光。因此可以實現(xiàn)對ces1的增強型熒光檢測,這種檢測模式具有能夠有效直觀、易于觀測的優(yōu)點,并且本探針提高現(xiàn)有探針的檢測的精度與準(zhǔn)確性。測試結(jié)果表明:該發(fā)明中的探針化合物在不同ph的條件下能保持很好的穩(wěn)定性,擴大了探針在不同酸堿度環(huán)境下的應(yīng)用范圍;探針化合物對ces1有很好特異性檢測效果,不會與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),即使在其他物質(zhì)存在的條件下,也不會干擾探針對于ces1的檢測,說明本發(fā)明的探針具有優(yōu)異的抗干擾性質(zhì)。同時本制備方法中所使用的材料毒性低,產(chǎn)率高,有利于生產(chǎn)與應(yīng)用。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式,但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制,其它的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。