本發(fā)明屬醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人羧酸酯酶1的生物發(fā)光檢測試劑盒及其使用方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人羧酸酯酶1(hce1)是人體內(nèi)分布的一種重要功能蛋白，其在人群的肝臟中含量很高，其蛋白表達量在肝臟分布蛋白中排前十位。hce1是一種膜結(jié)合蛋白，定位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中【cancerresearch1998；58:3627-32&drugmetab.pharmacokinet.2006；21:173-85】，同時也會分泌到細胞外進入血液循環(huán)系統(tǒng)【proteomics2009；9:3989–99】。hce1的基本代謝反應(yīng)是催化含較小醇基和較大酰胺基底物的水解。雖然，在多種組織的中都檢測到hce1的蛋白表達，但其在人肝臟組織含量遠高于其它組織。hce1參與多種外源性物質(zhì)的代謝清除，例如藥物奧司他韋、哌醋甲酯等。同時，hce1在維持人體正常生理功能功能發(fā)揮不可忽視的作用，參與人體內(nèi)膽固醇酯和游離脂肪酸的運輸和代謝過程，維持脂質(zhì)代謝平衡【chemistry&biology,vol.10,341–349,april,2003】。在正常健康人體中，hce1除了以較高的含量分布在肝組織的細胞中，也有少量hce1在血漿中被檢測到，更重要的是，肝細胞肝癌患者血漿中的hce1是健康人群的2-5倍，因此hce1被認為是肝細胞肝癌早期診斷的一種良好的潛在血清學(xué)標志物【proteomics2009,9,3989–3999】。此外，肝細胞破損相關(guān)的肝臟疾病患者也會有hce1釋放入血，引起血漿中hce1濃度發(fā)生變化，因此，血漿中hce1可作為肝臟急性損傷的標志物。hce1的分布存在很大的個體差異，hce1酶的表達和功能本身會受到人體遺傳、年齡、疾病、性別、環(huán)境和共服藥物等多種因素的影響。因此，hce1酶的活性檢測方法具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，可用于評價人體肝臟功能異常、藥物及毒物導(dǎo)致的肝毒性、肝細胞癌早期診斷、肝功能個體化評估、以及部分前體藥物的個性化使用等。此外，hce1作為維持人體脂質(zhì)代謝平衡的重要蛋白，其抑制劑可作為降血脂藥物使用，hce1也被fda批準為重要的藥物作用靶點。hce1活性的快速表征方法也可用于新藥研發(fā)早期發(fā)現(xiàn)及評估hce1新型高效抑制劑。因此，開發(fā)高效、超靈敏、高特異性的hce1活性檢測方法對于臨床樣本中hce1活性的檢測，以及新藥高內(nèi)涵高通量篩選至關(guān)重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種酶法檢測人羧酸酯酶1的生物發(fā)光檢測試劑盒及其使用方法和應(yīng)用。該試劑盒使用(s)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氫噻唑-4-甲酸甲酯作為人羧酸酯酶1探針底物，探針經(jīng)hce1水解后可生成螢火蟲熒光素酶的底物(圖1)。基于單位時間產(chǎn)物的生成量來表示酶的活性。該酶促反應(yīng)具有選擇性高、代謝產(chǎn)物易檢測、酶活及抑制活性評價快速高效等特點。

一種人羧酸酯酶1的生物發(fā)光檢測試劑盒，該試劑盒包括4種試劑：a液、b液、c液和質(zhì)控標準品；

所述a液為：為100mm磷酸鹽緩沖液，ph＝5.5～10，

所述b液為0.1～10mm的含有人羧酸酯酶1的特異性生物探針底物的溶液，溶劑為二甲基亞砜，

所述c液為熒光素酶檢測試劑，含0.5mm的atp，10mm的mg²⁺及50g/ml的熒光素酶,

所述質(zhì)控標準品為5mg/ml的hce1水溶液。

保存方式：保存在－20℃冰箱里，所述a液、所述b液、所述c液避免光照；有效保證6月。

一種人羧酸酯酶1的生物發(fā)光檢測試劑的使用方法，具體按下面步驟進行：

(1)預(yù)孵育：將待測樣品與a液混勻，20～60度下孵育3～5分鐘；混合液總體積為20μl，將待測樣品的濃度為：(0～0.5mg/ml)；

(2)起始反應(yīng)：加入b液后混勻，20～60度下孵育2～120分鐘；b液的體積為30μl，終濃度10μm；

(3)檢測：加入c液，混勻，37℃孵育20-30min，用酶標儀或化學(xué)發(fā)光分析儀測定樣品，所述c液加入量為50μl。

所述待測樣品重組表達的hce1、含有hce1的哺乳動物細胞/組織制備液、血漿或其他常見生物樣本。

一種人羧酸酯酶1的生物發(fā)光檢測試劑盒的應(yīng)用，該試劑盒可用于人羧酸酯酶1活性的快速定量檢測，以及該酶抑制劑的快速篩選與評估。

所述試劑盒用于人羧酸酯酶1活性的快速定量檢測的方法為：探針底物(s)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氫噻唑-4-甲酸甲酯可被人羧酸酯酶1特異性水解為螢火蟲熒光素酶的底物；按照試劑盒的使用方法，通過定量檢測單位時間內(nèi)樣品中的(s)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氫噻唑-4-甲酸與熒光素酶反應(yīng)所產(chǎn)生的生物發(fā)光強度來表征水解產(chǎn)物的生成量，進而測定不同樣本中人羧酸酯酶1的活性。

該試劑盒用于人羧酸酯酶1抑制劑的快速篩選與評估方法為：以人羧酸酯酶1的特異性生物探針底物的水解反應(yīng)作為hce1的特異性探針反應(yīng)，按照試劑盒的使用方法，通過定量比較抑制劑存在與缺失狀態(tài)下單位時間內(nèi)水解產(chǎn)物的生成量評估該生物體系中hce1的殘余活性，進而實現(xiàn)hce1抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價。

該試劑盒檢測原理是利用人羧酸酯酶1能催化水解酯鍵的特性，特異地識別與催化人羧酸酯酶1的特異性生物探針底物結(jié)構(gòu)中的甲酯，在生理ph條件下水解生成螢火蟲熒光素酶的底物。利用該探針反應(yīng)可對多種生物體系中hce1的分布和功能進行定量評價。

本發(fā)明所述特異性檢測人羧酸酯酶(hce1)的試劑盒的應(yīng)用領(lǐng)域，包括但不限于重組表達的hce1酶、含有hce1的細胞及組織制備物、血漿等生物樣品中hce1活性的定量測定。

本發(fā)明提供的檢測人羧酸酯酶1(hce1)的試劑盒的應(yīng)用，需注意所述底物消除率或水解產(chǎn)物的生成率應(yīng)介于0.1％～20％之間。

本發(fā)明所提供的檢測人羧酸酯酶1(hce1)的試劑盒，產(chǎn)物(s)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氫噻唑-4-甲酸是螢火蟲熒光素酶的底物，可采用化學(xué)發(fā)光檢測器實現(xiàn)產(chǎn)物的快速靈敏檢測。此外，該特異性探針底物及相應(yīng)hce1活性檢測過程不會受生物體系基質(zhì)及雜質(zhì)的干擾，可用于各種生物體系中hce1酶活的定量測定。

本發(fā)明中試劑盒可用于重組羧酸酯酶、細胞或組織制備液等多種生物體系中hce1酶活的定量測定，還可用于快速篩選hce1酶的抑制劑及抑制能力的定量評價。

選用本發(fā)明所述的人羧酸酯酶1檢測試劑盒及其使用方法具有以下突出優(yōu)勢：

(1)高特異性：(s)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氫噻唑-4-甲酸甲酯可被hce1高特異性地代謝成一個代謝產(chǎn)物，即甲酯鍵斷裂的水解產(chǎn)物；

(2)廉價易得：底物簡稱(s)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氫噻唑-4-甲酸甲酯及其水解產(chǎn)物均可經(jīng)化學(xué)合成獲得，合成工藝簡單易行；

(3)高靈敏度：水解產(chǎn)物為熒光素酶的底物，可用熒光素酶檢測試劑進行高靈敏度的檢測，最低定量下限為0.1nm。

(4)高通量檢測：利用該類熒光探針底物可實現(xiàn)96,384孔板的快速檢測，可實現(xiàn)每日2萬個樣品的高通量檢測，具有單個測試成本低廉(<0.5元)的優(yōu)勢。

附圖說明

圖1.人羧酸酯酶1的特異性生物發(fā)光探針底物檢測示意圖；

圖2.人重組單酶篩選試驗；

圖3.hce1水解特異性生物發(fā)光底物的線性反應(yīng)濃度；

圖4.hce1抑制劑的抑制能力表征；

圖5.不同個體來源肝微粒體中hce1的活性定量評估及相關(guān)性研究；

圖6.不同組織微粒體中hce1的活性定量評估；

圖7.不同腫瘤細胞系s9中hce1的活性定量評估。

具體實施方式

下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。hce1試劑盒的檢測原理如圖1所示。該試劑盒的具體應(yīng)用如下所示。

實施例1.體外測定人重組單酶中hce1的選擇性

(1)預(yù)先準備20μlhce1代謝反應(yīng)體系，包括a液、人重組各單酶(5μg/ml)，于37℃條件下震蕩預(yù)孵10分鐘；

(2)向反應(yīng)體系中加入30μl的b液(終濃度10μm)起始反應(yīng)；

(3)10分鐘后，加入50μl的c液，37℃孵育20min后，酶標儀檢測發(fā)光。

重組人hce1特異性參與其水解，其它酯酶均不參與其水解，證實該類化合物具有非常好的選擇性(圖2)。

實施例2.hce1水解(s)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氫噻唑-4-甲酸甲酯的線性反應(yīng)濃度

(1)預(yù)先準備20μlhce1代謝反應(yīng)體系，包括a液、人重組單酶hce1(系列濃度)，于37℃條件下震蕩預(yù)孵10分鐘；

(2)向反應(yīng)體系中加入30μl的b液(終濃度10μm)起始反應(yīng)；

(3)10分鐘后，加入50μl的c液，37℃孵育20min后，酶標儀檢測發(fā)光。

該試劑盒最低能檢測到0.02ug/ml的hce1(圖3)。

實施例3.hce1抑制劑的抑制能力表征

(1)準備hce1代謝反應(yīng)體系，包括a液、人肝微粒體、不同酯酶特異性抑制劑(100μm)于37℃條件下震蕩預(yù)孵10分鐘；

(2)向反應(yīng)體系中加入30μl的b液(終濃度10μm)起始反應(yīng)；

(3)10分鐘后，加入50μl的c液，37℃孵育20min后，酶標儀檢測發(fā)光。

(s)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氫噻唑-4-甲酸甲酯在人肝微粒體中的水解活性能夠被羧酸酯酶特異性抑制劑bnpp顯著抑制，而其它酯酶抑制劑對其水解沒有顯著的抑制活性，證實(s)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氫噻唑-4-甲酸甲酯能夠特異性檢測復(fù)雜生物樣本的hce1的活性(圖4)。

實施例4.不同個體來源肝微粒體中hce1的活性定量評估

(1)選取12例個體人肝微粒體(hlm)，準備hce1代謝反應(yīng)體系，包括a液、人肝微粒體、于37℃條件下震蕩預(yù)孵3分鐘；

(2)向反應(yīng)體系中加入30μl的b液(終濃度10μm)起始反應(yīng)；

(3)10分鐘后，加入50μl的c液，37℃孵育20min后，酶標儀檢測發(fā)光。

檢測到的發(fā)光信號強度代入標準曲線后得到12例人肝微粒體(hlm)對10μm的(s)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氫噻唑-4-甲酸甲酯的代謝速率(圖5a)，該測定結(jié)果與氯吡格雷測定的hce1活性呈良好的相關(guān)性(圖5b)。

實施例5.不同組織微粒體中hce1的活性定量評估

(1)選取不同組織微粒體，準備hce1代謝反應(yīng)體系，包括a液、細胞勻漿(2μl)、于37℃條件下震蕩預(yù)孵3分鐘；

(2)向反應(yīng)體系中加入30μl的b液(終濃度10μm)起始反應(yīng)；

(3)10分鐘后，加入50μl的c液，37℃孵育20min后，酶標儀檢測發(fā)光。

檢測到的發(fā)光信號強度代入標準曲線后得到4種組織微粒體對(s)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氫噻唑-4-甲酸甲酯的代謝速率，該測定結(jié)果與westernblot測定的hce1表達結(jié)果一致(圖6)。

實施例6.腫瘤細胞中hce1的活性定量評估

(1)選取7種腫瘤細胞系，準備hce1代謝反應(yīng)體系，包括a液、細胞勻漿(2μl)、于37℃條件下震蕩預(yù)孵3分鐘；

(2)向反應(yīng)體系中加入30μl的b液(終濃度10μm)起始反應(yīng)；

(3)10分鐘后，加入50μl的c液，37℃孵育20min后，酶標儀檢測發(fā)光。

檢測到的發(fā)光信號強度代入標準曲線后得到4種組織的微粒體對(s)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氫噻唑-4-甲酸甲酯的代謝速率，該測定結(jié)果與mrna和westernblot測定的hce1基因與蛋白表達結(jié)果一致(圖7)。