本發(fā)明屬于化工領(lǐng)域，涉及一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的水解方法，具體來(lái)說(shuō)是一種羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物及其水解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的方法。

背景技術(shù)：

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是人工合成的一類殺蟲劑，其廣譜性的殺蟲作用和對(duì)哺乳動(dòng)物較低的毒性，但一定的殘留劑量會(huì)導(dǎo)致接觸生物體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害。因此，新型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法的研究受到了廣泛關(guān)注。目前，針對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留速測(cè)通常依賴酯鍵水解，建立針對(duì)水解產(chǎn)物中的氰基或間苯氧基苯甲醛及其衍生物的檢測(cè)方法。但是，嚴(yán)苛的水解條件（強(qiáng)堿性試劑）和水解產(chǎn)物的不確定性，在一定程度上限制了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥速測(cè)的應(yīng)用。

有報(bào)道羧酸酯酶能夠?qū)Ｒ坏厮鈹M除蟲菊酯農(nóng)藥，并且水解條件溫和、操作簡(jiǎn)便，在酶法農(nóng)藥快檢領(lǐng)域顯示出巨大的潛力和優(yōu)越性。但是，通過(guò)濕法固定的羧酸酯酶表觀活性較低，水解產(chǎn)物得率偏低，限制了基于酶水解速測(cè)擬除蟲菊酯農(nóng)藥方法的靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物及其水解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的方法，所述的這種羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物及其水解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的方法條件苛刻，靈敏度不佳的技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明提供了一種羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物，按照如下方法制備：先配制濃度為5~50mm的磷酸緩沖溶液，ph值范圍為6.8~8.5，取羧酸酯酶凍干粉加入上述溶液中，使得羧酸酯酶的濃度為0.1~0.6mg/ml，在上述溶液中加入金屬離子，使其金屬離子的終濃度為0.25~1.5m，混合均勻后置于20~35℃恒溫箱中孵育12-36小時(shí)，將孵育后的溶液離心，將沉淀物進(jìn)行冷凍干燥即得羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物。

進(jìn)一步的，所述的金屬離子為鈣離子、鉀離子或者鎂離子中的任意一種。

本發(fā)明還提供了上述的一種羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物水解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的方法，包括如下步驟：

1)一個(gè)制備羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物的步驟，先配制濃度為5~50mm的磷酸緩沖溶液，ph值范圍為6.8~8.5，取羧酸酯酶凍干粉加入上述溶液中，使得羧酸酯酶的濃度為0.1~0.6mg/ml，在上述溶液中加入金屬離子，使其金屬離子的終濃度為0.25~1.5m，混合均勻后置于20~35℃恒溫箱中孵育12-36小時(shí)，將孵育后的溶液離心，將沉淀物進(jìn)行冷凍干燥即得羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物；

2)取步驟1）中制備的凍干粉溶解于水解緩沖液中，所述的水解緩沖液為含有質(zhì)量百分比濃度為5~25%的tween-20，質(zhì)量百分比濃度為10~35%甲醇的磷酸緩沖液，所述的緩沖液的ph為8.0，所述的凍干粉和水解緩沖液的物料比為1~5mg：1.25ml，在上述混合液中加入擬除蟲菊酯類農(nóng)藥樣品，所述的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥樣品和混合液的體積比為0.052：1，置于40~50℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)15~25分鐘，離心除去羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物，得到水解產(chǎn)物間苯氧基苯甲醛。

本發(fā)明將羧酸酯酶溶液和金屬離子恒溫孵育后，離心除去上清液得到沉淀的羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物，并將該復(fù)合物應(yīng)用于擬除蟲菊酯類的水解。結(jié)果表明，該復(fù)合物與羧酸酯酶溶液活力相當(dāng)；在優(yōu)化條件下水解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥得到單一水解產(chǎn)物間苯氧基苯甲醛，便于與速檢方法聯(lián)用。

本發(fā)明采用了一種簡(jiǎn)便的方法制備了羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物，該方法獲得復(fù)合物具備和液酶相當(dāng)?shù)幕盍?，可重?fù)性強(qiáng)。本發(fā)明制備的羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物能夠在溫和的水解條件下，針對(duì)ⅰ型和ⅱ型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥均獲得單一的水解產(chǎn)物間苯氧基苯甲醛，反應(yīng)條件溫和，所需試劑簡(jiǎn)單，易于與快檢方法聯(lián)用，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明制備的羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物能重復(fù)用于水解反應(yīng)，可重復(fù)利用率高。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明方法可廣泛應(yīng)用于糧食、蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境中ⅰ型和ⅱ型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的定性和定量檢測(cè)，該方法操作步驟簡(jiǎn)便、快捷、成本低，易于在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)設(shè)備中使用。

附圖說(shuō)明

圖1為羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物掃描電鏡圖片。

圖2為氰戊菊酯水解產(chǎn)物液相色譜圖。

圖3為針對(duì)不同擬除蟲菊酯類農(nóng)藥液酶和復(fù)合物的水解效果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

一、一種羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物水解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的方法，水解對(duì)象為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥（氰戊菊酯）。

1，羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物的制備，配制濃度為5~50mm的磷酸緩沖溶液，ph值范圍為6.8~8.5，取豬肝酯酶凍干粉加入上述溶液中，配制濃度為0.1~0.6mg/ml的酶液。在上述酶液中加入鈣離子，使其金屬離子的終濃度為0.25~1.5m，混合均勻后置于20~35℃恒溫箱中孵育12-36小時(shí)。將孵育后的溶液離心，將沉淀進(jìn)行冷凍干燥。

2，擬除蟲菊酯農(nóng)藥水解，取步驟1）中制備的凍干粉1~5mg溶解于1.25ml水解緩沖液中，水解緩沖液為含有質(zhì)量百分比濃度為5~25%的tween-20，質(zhì)量百分比濃度為10~35%甲醇的磷酸緩沖(ph8.0)，在上述混合液中加入65μl擬除蟲菊酯類農(nóng)藥樣品，置于40~50℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)15~25分鐘，離心除去羧酸酯酶-金屬離子復(fù)合物，得到水解產(chǎn)物間苯氧基苯甲醛；

3，水解產(chǎn)物檢測(cè)，在步驟2）得到的水解液中，加入160μl氯仿或四氯化碳萃取富集產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)氮吹復(fù)溶于乙腈溶液中，進(jìn)高效液相色譜檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)色譜條件為：色譜柱：型號(hào)為sepax的碳十八柱，規(guī)格為150mm×4.6mm×5μm；流動(dòng)相a：0.1%醋酸水溶液，流動(dòng)相b：100%乙腈；流速分別為：0.23ml/min，0.87ml/min；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為235nm，保留時(shí)間為5.556min。所述擬除蟲菊酯類農(nóng)藥檢測(cè)范圍為0.005~0.1mg/l，檢測(cè)限可達(dá)1μg/l。

二、上述所需豬肝酯酶制備方法，步驟包括：

（1）酶液的提取

本實(shí)施例中豬肝酯酶采用豬肝臟按1：3的比例加入ph中性的緩沖液，進(jìn)行組織破碎、離心分離得豬肝酯酶粗酶液；

（2）酶的部分純化

用30%和80%飽和度的硫酸銨溶液對(duì)豬肝酯酶粗酶液進(jìn)行分級(jí)沉淀，之后用超濾除去小分子鹽。

圖1為實(shí)施例1所制備的豬肝酯酶-鈣離子復(fù)合物掃描電鏡表征圖。在鈣離子和磷酸根離子的作用下，形成了大量有利于豬肝酯酶附著的片狀結(jié)構(gòu)。

圖2為采用實(shí)施例1中所制備的豬肝酯酶-鈣離子復(fù)合物水解氰戊菊酯產(chǎn)物的高效液相色譜圖。采用復(fù)合物對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥進(jìn)行水解可以得到單一的水解產(chǎn)物間苯氧基苯甲醛。

圖3為采用實(shí)施例1中所制備的豬肝酯酶-鈣離子復(fù)合物以及豬肝酯酶水解不同的擬除蟲菊酯農(nóng)藥的效果。由圖3可知，豬肝酯酶-鈣離子復(fù)合物水解不同的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的產(chǎn)物峰面積高于單一豬肝酯酶，表明復(fù)合物具備更好的酶活力。并且，除氟氯氰菊酯外，實(shí)施例1中所制備的復(fù)合物兩次水解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥產(chǎn)物峰面積無(wú)明顯差異，表明該復(fù)合物具備良好的可重復(fù)利用性。

本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其他不同形式的變化和變動(dòng)。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引申出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。