本發(fā)明涉及應(yīng)用反向遺傳和基因替換技術(shù)，拯救一株克服雞新城疫母源抗體影響的嵌合新城疫病毒疫苗載體候選株ai4-t4fhn，用于研制新城疫載體疫苗。

背景技術(shù)：

反向遺傳操作技術(shù)(reversegeneticsmanipulationtechnique)是指將rna病毒基因組rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna，在dna分子水平上對(duì)其進(jìn)行各種體外人工操作，由病毒基因組cdna和各種輔助蛋白來(lái)組裝新的rna病毒的一項(xiàng)研究技術(shù)[neumanng,whittma,kawaokay.adecadeafterthegenerationofanegative-sensernavirusfromclonedcdna–whathavewelearned？journalofgeneralvirology,2002,83(11):2635-2662.]，也叫全長(zhǎng)感染性cdna克隆技術(shù)，又常被稱為“病毒拯救”。由于最終“拯救”出的rna病毒來(lái)源于cdna克隆，因此，可通過(guò)中間過(guò)程中人為加入的dna環(huán)節(jié)，在dna水平上對(duì)rna病毒基因組進(jìn)行各種體外人工操作，如進(jìn)行基因突變、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置換和基因互補(bǔ)(即構(gòu)建嵌合病毒)等改造，解決了對(duì)rna病毒基因組難以操作這一難題，為新型疫苗的研制和開發(fā)提供了新的思路[huangz,elankumarans,pandaa,etal.recombinantnewcastlediseasevirusasavaccinevector.poultryscience,2003,82:899-906.]。

新城疫(newcastledisease,nd)是由新城疫病毒(newcastlediseasevirus,ndv)引起的主要感染雞、鴿、鵪鶉、火雞等家禽和野生禽類的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病。ndv是單股、不分節(jié)段的負(fù)鏈rna病毒，屬于副粘病毒科、副粘病毒亞科、禽腮腺炎病毒屬成員。按照標(biāo)準(zhǔn)的致病性指標(biāo)可以將病毒分為速發(fā)型(強(qiáng)毒)、中發(fā)型(中等毒力)和緩發(fā)型(弱毒)?；蚪M長(zhǎng)度大約15kb，其結(jié)構(gòu)為3’-leader-np-p-m-f-hn-l-trailer-5’，依次編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白(nucleocapsidprotein,np)、磷蛋白(phosphoprotein,p)、基質(zhì)蛋白(matrixprotein,m)、融合蛋白(fusionprotein,f)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(heamagglutinin-neuraminidaseprotein，hn)和大分子蛋白(largeprotein,l)。其中f,hn蛋白是ndv的囊膜蛋白,可以刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，是ndv的主要保護(hù)性抗原。經(jīng)研究表明，成熟的hn蛋白是四聚體，其中位于膜內(nèi)的第1-26位氨基酸殘基為親水性膜內(nèi)區(qū),第27-48位氨基酸殘基為疏水性跨膜區(qū)，胞外區(qū)為hn蛋白的主要功能區(qū),包含蛋白的全部抗體識(shí)別位點(diǎn)，受體結(jié)合位點(diǎn)以及神經(jīng)氨酸酶(na)活性位點(diǎn)[susanc,,allenp,etc.crystalstructureofthemultifunctionalparamyxovirushemagglutinin-neuraminidase[j].naturestructuralbiology,2000,7(11):1068-1074]。f蛋白有三個(gè)強(qiáng)疏水區(qū)，第一個(gè)疏水區(qū)位于1～25氨基酸殘基處，為f蛋白n端信號(hào)肽區(qū)；第二個(gè)疏水區(qū)位于117～142氨基酸殘基處，為融合誘導(dǎo)區(qū)，該區(qū)域正好是f1n端，當(dāng)f0裂解產(chǎn)生f1和f2后，f1n端直接與靶細(xì)胞膜接觸，參與膜融合；第三個(gè)疏水區(qū)位于500～522氨基酸殘基處，與蛋白的胞質(zhì)區(qū)(523～553aa)相鄰，為蛋白跨膜區(qū)，具有終止蛋白轉(zhuǎn)移和膜錨定功能。[niikuram,matsuuray,hattorim,etal.characterizationofhnglycoproteinofndvexpressedbyarecombinantbaculovirus[j].virusres,1991,20:31-43]，

載體病毒最重要的一個(gè)特點(diǎn)是能被用來(lái)迅速研制出針對(duì)新發(fā)高致病性傳染病的基因工程疫苗。ndv除具備這一特點(diǎn)外，還具有遺傳穩(wěn)定性好、不存在與細(xì)胞基因組整合的可能、高繁殖性能、免疫刺激性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，可作為疫苗載體[bukreyeva,skiadopoulosmh,murphybr,etal.nonsegmentednegative-strandvirusesasvaccinevectors[j].journalofvirology,2006,80(21):10293-10306.]。在ndv基因組內(nèi)插入外源基因后的重組病毒，可在動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定持續(xù)地表達(dá)外源蛋白，用此重組病毒作為疫苗,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)新發(fā)傳染病和nd的雙重免疫保護(hù)力[veitsj,wiesnerd,fuchsw,etal.newcastlediseasevirusexpressingh5hemagglutiningeneprotectschickensagainstnewcastlediseaseandavianinfluenza[j].procnatlacadsciusa,2006,103(21):8197-8202.schroerd,veitsj,grundc,etal.vaccinationwithnewcastlediseasevirusvectoredvaccineprotectschickensagainsthighlypathogenich7avianinfluenzavirus[j].aviandis,2009,53(2):190-197.]。

疫苗接種是中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)預(yù)防控制nd的重要手段，接種過(guò)nd疫苗的母雞，其母源抗體能通過(guò)卵黃囊傳遞給雛雞，而使雛雞產(chǎn)生被動(dòng)免疫力，故雛雞體內(nèi)含有高滴度的nd抗體。有母源抗體的雛雞用弱毒疫苗免疫后，nd載體疫苗進(jìn)入雛雞體內(nèi)，很快被其中和。只有當(dāng)母源抗體降到較低水平(小于3log2,一般要15-20日齡后)時(shí)，對(duì)弱毒活疫苗免疫影響才非常小，方可產(chǎn)生較為可靠的免疫力。[sarfatimd,lozanodb,sotope,castropf,florescretal.(2010)protectivedoseofarecombinantnewcastlediseaselasota-avianinfluenzavirush5vaccineagainsth5n2highlypathogenicavianinfluenzavirusandvelogenicviscerotropicnewcastlediseasevirusinbroilerswithhighmaternalantibodylevels.[j].aviandis.54(1suppl):239-241.]。這極大限制了ndv載體疫苗在商品雞群的應(yīng)用。

禽副粘病毒2型(avianparamyxovirustype-2,apmv-2)屬于副粘病毒科(paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒屬(avulavirus),根據(jù)抗原性差異將該屬分為10個(gè)血清型，同屬的成員還包括禽副黏病毒1型(avianparamyxovirustype-1,apmv-1),該型的成員只有新城疫病毒(ndv)。apmv-2基因結(jié)構(gòu)與ndv十分相似,編碼包括囊膜蛋白在內(nèi)的六個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，可在9～10日齡雞胚尿囊腔中繁殖,但雞胚沒有典型病變。apmv-2單純感染雞時(shí)未能引起任何臨床癥狀，對(duì)雞不致病。病毒粒子能夠在雞上呼吸道有效復(fù)制，引起雞的固有和特異性免疫應(yīng)答。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，ndv與apmv-2、6、10的交叉保護(hù)率最低而其中apmv-2在雞上的復(fù)制效率最高[warke,a.stallknecht,d.williams,s.m.comparativestudyonthepathogenicityandimmunogenicityofwildbirdisolatesofavianparamyxovirus2,4,and6inchickens[j].avianpathol,2008,37(04):429-34.]，因此，apmv-2是應(yīng)用于高水平新城疫母源抗體雞群的理想疫苗載體候選毒株。其他血清型副黏病毒已經(jīng)被應(yīng)用于疫苗的研究：表達(dá)ndvf和hn蛋白的重組的禽副粘病毒3型疫苗可以用于保護(hù)雞群免于ndv強(qiáng)毒的感染[kumar,s.；nayak,b.；collins,p.l.；samal,s.k.evaluationofthenewcastlediseasevirusfandhnproteinsinprotectiveimmunitybyusingarecombinantavianparamyxovirustype3vectorinchickens[j].jvirol2011,85,6521-6534.]，但是因?yàn)槠淇乖阅芘cndv抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，所以依舊受到ndv母源抗體的影響。將hn蛋白和f蛋白替換為禽副粘病毒8型(apmv-8)相應(yīng)部分的嵌合lasota疫苗可以在ndv免疫雞群中表達(dá)外源蛋白[steglich,c.；grund,c.；ramp,k.；breithaupt,a.；hoper,d.；keil,g.；veits,j.；ziller,m.；granzow,h.；mettenleiter,t.c.,etal.chimericnewcastlediseasevirusprotectschickensagainstavianinfluenzainthepresenceofmaternallyderivedndvimmunity[j].plosone2013,8,e72530.]，而ndv與apmv-8的交叉反應(yīng)性最好，在母源抗體水平較高時(shí)該疫苗的免疫效果仍有可能被削弱。利用成熟的反向遺傳技術(shù)，人們就抗nd母源抗體疫苗的研究日益深入，但是能夠真正應(yīng)用于實(shí)際中，解決問(wèn)題的疫苗還待創(chuàng)造。

在ndv吸附和入侵細(xì)胞的過(guò)程中，f和hn蛋白發(fā)揮了關(guān)鍵作用。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，f和hn蛋白是ndv的主要毒力決定因子，由于兩者還是決定ndv抗原差異和宿主選擇差異的主要因素，并且在研究病毒變異和疫苗生產(chǎn)中起指導(dǎo)作用。m蛋白在病毒感染過(guò)程中通過(guò)與病毒rnp以及表面糖蛋白相互作用，促進(jìn)病毒的裝配和出芽。研究表明，m蛋白裝配出芽時(shí)通過(guò)f、hn蛋白的胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)募集表面糖蛋白，f蛋白的空間構(gòu)象又受到hn蛋白莖部的影響，這三個(gè)囊膜蛋白之間存在相互作用，共同影響了病毒的復(fù)制效率和毒力[assemblyofsendaivirus:mproteininteractswithfandhnproteinsandwiththecytoplasmictailandtransmembranedomainoffprotein[j].virology2000,276,289-303.]。僅將ndvf和hn蛋白的胞外區(qū)換作不同病毒的功能相似區(qū)域是否會(huì)降低病毒的復(fù)制效率和改變抗原性，國(guó)內(nèi)尚未研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服肉雞雛雞中普遍存在的nd母源抗體對(duì)ndv活載體疫苗的影響,本發(fā)明提供一種新型ndv疫苗載體病毒，該載體病毒的復(fù)制不受到nd母源抗體的干擾。

本發(fā)明的原理是：利用apmv-2毒株在雞上高效繁殖和與nd血清低反應(yīng)的能力，對(duì)ndv的兩個(gè)抗原基因的胞外區(qū)進(jìn)行替換修飾，拯救出與ndv血清抗體反應(yīng)能力弱，并且能夠在雞群中有效復(fù)制的疫苗載體。2011年胡增磊等對(duì)分離的viid亞型ndv毒株js5/05的f蛋白裂解位點(diǎn)突變后成功構(gòu)建了全長(zhǎng)克隆載體pndv/rai4，經(jīng)反向遺傳操作獲得了致弱病毒ai4，其尿囊液的ha效價(jià)為10log2[huz,hus,mengc,etal.generationofagenotypeviinewcastlediseasevirusvaccinecandidatewithhighyieldinembryonatedchickeneggs.aviandiseases2011,55(3):1759-1769]。因此，本發(fā)明在上述基礎(chǔ)上，以pndv/rai4為骨架，將apmv-2的囊膜蛋白f、hn胞外區(qū)替換到ai4的對(duì)應(yīng)位置，構(gòu)建克服雛雞nd母源抗體影響的嵌合ndv疫苗載體候選株ai4-t4fhn。

本發(fā)明提供的一株克服雞新城疫母源抗體影響的嵌合新城疫病毒疫苗載體候選株，是禽副黏病毒i型(avianparamyxovirustype-1)ai4-t4fhn，其保藏號(hào)cgmccno.12987。

本發(fā)明還公開了所述克服雞新城疫母源抗體影響的嵌合新城疫病毒疫苗載體候選株的構(gòu)建方法：是以禽副黏病毒2型的兩個(gè)囊膜糖蛋白f基因和hn基因胞外區(qū)片段對(duì)ndvai4株基因組的對(duì)應(yīng)部分進(jìn)行替換，得到重組病毒ai4-t4fhn。

本發(fā)明的方法具體包括以下步驟：

(1)全長(zhǎng)克隆rai4-t4fhn的構(gòu)建

1)新城疫病毒ai4株基因組的修飾：在ndv全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄載體pndv/rai43250nt處突變堿基引入paci酶切位點(diǎn)，構(gòu)建全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄載體pndv/rai4-paci；

2)ai4基因組f和hn胞外區(qū)的替換：將合成的序列seqidno.7和seqidno.8分別克隆進(jìn)質(zhì)粒puc17，獲得中間質(zhì)粒puc-t4f/paci和puc-t4hn/fspai，用paci和aflii酶切這兩個(gè)質(zhì)粒，將puc-t4f/paci合成的基因與puc-t4hn/fspai合成的基因相連，構(gòu)建中間質(zhì)粒puc-t4fhn；

利用酶切位點(diǎn)paci和fspa，將序列如seqidno.5和seqidno.6所示的嵌合的apmv-2f和hn基因從puc-t4fhn導(dǎo)入到全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄載體pndv/rai4-paci中，從而獲得新的轉(zhuǎn)錄載體pndv/rai4-t4fhn；

(2)重組病毒ai4-t4fhn株的拯救

將轉(zhuǎn)錄載體pndv/rai4-t4fhn與pci-np、pci-p和pci-l三個(gè)輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染bsr-t7/5細(xì)胞，60h后接種9～11日齡spf雞胚，37℃孵育，獲得重組病毒ai4-t4fhn。

其中步驟1)具體是：

在ndv全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄載體pndv/rai43250nt處突變堿基引入paci酶切位點(diǎn)，構(gòu)建全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄載體pndv/rai4-paci。根據(jù)ai4株的序列設(shè)計(jì)突變引物ageif/mr和mf/bstz17ir，以pndv/rai4質(zhì)粒為模板擴(kuò)增，使用overlappcr將兩個(gè)片段連接，克隆到pcr2.1載體，構(gòu)建中間質(zhì)粒pcr2.1-paci。利用全長(zhǎng)上的酶切位點(diǎn)agei和bstz17i將paci酶切位點(diǎn)替換進(jìn)全長(zhǎng)，構(gòu)建全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄載體pndv/rai4-paci。

ageif：5’-gggtgaaatgacgctcaataaactctca-3’(seqidno.1)

mr：5’-attaataatgctgctggattggttg-3’(seqidno.2)

mf：5’-accaatccagcagcattattaattaa-3’(seqidno.3)

bstz17ir：5’-accctgtctgagacgaggtgtat-3’(seqidno.4)。

本發(fā)明通過(guò)分析apmv-2經(jīng)典毒株rapmv-2-yuc(genbank:lc187305.1)的基因序列，使用基因合成的方法將表面囊膜蛋白f和hn的胞外區(qū)與ai4囊膜蛋白的胞內(nèi)區(qū)基因進(jìn)行嵌合，利用已建立的ndvai4株的反向遺傳操作平臺(tái)，將嵌合的f和hn基因替換ai4株的對(duì)應(yīng)部分，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pndv/rai4-t4fhn，該重組質(zhì)粒與三個(gè)輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染bsr-t7/5細(xì)胞后，獲得了具有較高繁殖性能嵌合疫苗載體株ai4-t4fhn，適合疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，另外，該嵌合病毒能夠在新城疫抗體存在的情況下在雞群中高效復(fù)制，作為疫苗載體在控制當(dāng)前多種疾病的突發(fā)和流行顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1重組質(zhì)粒pndv/rai4-t4fhn構(gòu)建模式圖。

圖2重組病毒ai4-t4fhn的rt-pcr鑒定電泳圖。

圖3疫苗載體毒株ai4-t4fhn(a)和lasota弱毒苗(b)免疫商品雞和spf雞的血清轉(zhuǎn)化水平圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明構(gòu)建的嵌合新城疫病毒疫苗載體毒株ai4-t4fhn于2016年9月5日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；分類命名為：禽副黏病毒i型，其保藏號(hào)cgmccno.12987。

實(shí)施例1：

重組質(zhì)粒pndv/rai4-t4fhn構(gòu)建模式圖如圖1。

構(gòu)建步驟一：新城疫病毒ai4株基因組的修飾

生物材料準(zhǔn)備：

ndvai4株的全長(zhǎng)表達(dá)載體pndv/rai4(huz,hus,mengc,etal.generationofagenotypeviinewcastlediseasevirusvaccinecandidatewithhighyieldinembryonatedchickeneggs.aviandiseases2011,55(3):1759-1769)由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。pcr2.1載體：購(gòu)自invitrogen公司；amv反轉(zhuǎn)錄酶、highfidelitydnapolymerase、t4dna連接酶、agarosegeldnaextractionkit購(gòu)自roche公司；轉(zhuǎn)染試劑superfect和質(zhì)粒抽提試劑盒(qiaprepspinminiprepkit)為qiagen公司產(chǎn)品；其余常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

設(shè)計(jì)突變引物ageif/mr和mf/bstz17ir，在ai4全長(zhǎng)質(zhì)粒3250nt處突變堿基，添加paci酶切位點(diǎn)，引物序列如下：

ageif：5’-gggtgaaatgacgctcaataaactctca-3’(seqidno.1)

mr：5’-attaataatgctgctggattggttg-3’(seqidno.2)

mf：5’-accaatccagcagcattattaattaa-3’(seqidno.3)

bstz17ir：5’-accctgtctgagacgaggtgtat-3’(seqidno.4)

突變堿基以斜體標(biāo)注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。

pcr反應(yīng)：以全長(zhǎng)表達(dá)載體pndv/ai4為模板配制如下pcr反應(yīng)體系：

pcr反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，94℃50s，60℃1min15s，72℃延伸，延伸時(shí)間為1min/kb，15個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min，4℃保存。

overlappcr反應(yīng)體系及條件：

pcr反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min；94℃50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，2個(gè)循環(huán)之后再94℃40s，64℃退火1min，72℃延伸2min，15個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min，4℃保存。

回收目的片段與pcr2.1載體相連，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pcr2.1-paci。利用酶切位點(diǎn)agei/bstz17i將酶切位點(diǎn)paci導(dǎo)入全長(zhǎng)表達(dá)載體pndv/ai4，獲得新的表達(dá)載體pndv/ai4-paci。

步驟二：以rapmv-2-yuc株的f和hn胞外區(qū)替換ai4基因組相應(yīng)部分

生物材料準(zhǔn)備：

pcr2.1載體：購(gòu)自invitrogen公司；amv反轉(zhuǎn)錄酶、highfidelitydnapolymerase、t4dna連接酶、agarosegeldnaextractionkit購(gòu)自roche公司；質(zhì)粒抽提試劑盒(qiaprepspinminiprepkit)為qiagen公司產(chǎn)品；其余常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1、表達(dá)嵌合囊膜蛋白基因的質(zhì)粒puc-t4f/paci和puc-t4hn/fspai的合成

根據(jù)genbank中發(fā)表的1株apmv-2毒株rapmv-2-yuc(genbank:lc187305.1)的全長(zhǎng)序列，利用胞外區(qū)在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://minnou.cchmc.org)預(yù)測(cè)rapmv-2-yuc的f和hn基因的胞外區(qū),。用snapgene基因編輯軟件將rapmv-2-yucf基因胞外區(qū)(1-1440nt)和ai4f基因胞內(nèi)區(qū)(1513-1662nt)基因序列拼接到一起，人為創(chuàng)建一個(gè)嵌合基因f，具體序列見seqidno.5(其中1-1440bp為rapmv-2-yucf基因胞外區(qū)；1441-1590bp為ai4f蛋白的胞內(nèi)區(qū))。用同樣的方法將rapmv-2-yuchn基因胞外區(qū)(145-1743nt)和ai4hn基因胞內(nèi)區(qū)(1-165nt)基因序列拼接，創(chuàng)建嵌合hn基因，具體序列見seqidno.6(其中1-165bp為ai4hn基因胞內(nèi)區(qū)；166-1764bp為rapmv-2-yuchn基因胞外區(qū))。

設(shè)計(jì)并合成seqidno.7和seqidno.8。

seqidno.7中，paci酶切位點(diǎn)為1-6bp和2967-2972bp；7-1304bp和2895-2966bp為酶切位點(diǎn)到f基因之間的ai4序列；1305-2894bp為seqidno.5。

seqidno.8中，1-6bp、3300-3305bp為酶切位點(diǎn)paci，16-21bp為酶切位點(diǎn)aflii；22-149bp和1914-3300bp為酶切位點(diǎn)到hn基因之間的ai4序列；150-1913bp為seqidno.6。

將合成的序列seqidno.7和seqidno.8分別克隆進(jìn)商品質(zhì)粒puc17，獲得中間質(zhì)粒puc-t4f/paci和puc-t4hn/fspai，其中puc-t4f/paci中合成的序列seqidno.7由ai4基因組中paci酶切位點(diǎn)到f基因之前的序列以及嵌合f基因組成；puc-t4hn/fspai中合成的序列由seqidno.8含有以及ai4基因組中hn基因之后到fspai酶切位點(diǎn)的序列和嵌合hn基因puc-t4hn/fspai合成的基因在5‘端添加了酶切位點(diǎn)paci，aflii為f和hn基因之間的酶切位點(diǎn)。用paci和aflii酶切這兩個(gè)質(zhì)粒，將puc-t4f/paci合成的基因與puc-t4hn/fspai合成的基因相連，構(gòu)建中間質(zhì)粒puc-t4fhn。

2、囊膜糖蛋白基因的替換：

puc-t4hn/fspai合成的基因在5‘端添加了酶切位點(diǎn)paci，aflii為f和hn基因之間的酶切位點(diǎn)。用paci和aflii酶切這兩個(gè)質(zhì)粒，將puc-t4f/paci合成的基因與puc-thn/fspai合成的基因相連，構(gòu)建中間質(zhì)粒puc-t4fhn。利用酶切位點(diǎn)paci和fspa，將嵌合的apmv-2f(seqidno.5)和hn(seqidno.6)基因從puc-t4fhn導(dǎo)入到全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄載體pndv/rai4-paci中，獲得新的轉(zhuǎn)錄載體pndv/rai4-t4fhn。

3、重組質(zhì)粒pndv/rai4-t4fhn的酶切鑒定：

由于分離株t4基因組中hn基因序列中不含有hindiii酶切位點(diǎn)，而pndv/ai4上hn基因序列上卻含此位點(diǎn)，但ndvai4株全長(zhǎng)cdna14056nt和轉(zhuǎn)錄載體的292nt處也存在此酶切位點(diǎn)，因此，hn基因被成功替換的陽(yáng)性質(zhì)粒，經(jīng)hindiii酶切后會(huì)出現(xiàn)10.8kb、6.0kb和1.4kb大小的3條目的片段。

步驟三：重組病毒ai4-t4fhn株的拯救

生物材料準(zhǔn)備:

可穩(wěn)定表達(dá)t7rna聚合酶的bsr-t7/5細(xì)胞：由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所步志高研究員惠贈(zèng)。

真核表達(dá)質(zhì)粒pci-np、pci-p、pci-l(胡順林，張艷梅，孫慶，劉玉良等.鵝源新城疫病毒拯救體系的建立[j].微生物學(xué)通報(bào).2007，34(3))：由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。其中，表達(dá)np和p基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pci-np、pci-p還公開于(劉玉良.(2005).從cdna克隆產(chǎn)生感染性zj1株鵝源新城疫)；表達(dá)l基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pci-l還公開于(胡順林.(2007).鵝源新城疫病毒反向遺傳技術(shù)平臺(tái)的建立及其應(yīng)用)。

spf種蛋購(gòu)自北京梅里亞公司，在揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室孵化。

1、重組病毒的拯救

轉(zhuǎn)染時(shí)所用質(zhì)粒(pndv/rai4-t4fhn、pci-np、pci-p和pci-l)均采用qiaprepspinminiprepkit抽提。將pci-np、pci-p和pci-l3個(gè)輔助質(zhì)粒與重組ndv基因組全長(zhǎng)cdna克隆pndv/rai4-t4fh共轉(zhuǎn)染bsr-t7/5細(xì)胞，18-24h后加入終濃度為10％spf胚尿囊液，60h后將轉(zhuǎn)染樣品凍融1次后，收獲并接種9～11日齡spf雞胚，收集雞胚尿囊液，按oie標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定血凝效價(jià)，所測(cè)ha效價(jià)為10log2，血凝特性能被針對(duì)apmv-2的多克隆抗體抑制。

2、rt-pcr驗(yàn)證獲救病毒ai4-t4fhn

紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(hemagglutination,ha)和紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn)(hemagglutinationinhibition,hi)檢測(cè)均為陽(yáng)性的尿囊液，在spf雞胚上傳4代后，收集尿囊液抽提病毒的總rna，用6nt隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cdna后用于rt-pcr反應(yīng)。

用引物2-f和2-r擴(kuò)增嵌合基因，長(zhǎng)度約為3200bp(見圖2)，回收目的片段進(jìn)行測(cè)序鑒定，擴(kuò)增片段的測(cè)序結(jié)果顯示rapmv-2-yuc株的囊膜蛋白插入成功。

2-f：5’-cattcaggacacagcatgatacccgtgttaattgccagc-3’(seqidno.9)

2-r：5’-tcaattggggagttccttccg-3’(seqidno.10)。

實(shí)施例2：重組病毒的生物學(xué)特性鑒定

1、mdt與icpi的測(cè)定

雞胚平均致死時(shí)間(meandeathtime,mdt)測(cè)定：用滅菌生理鹽水將重組病毒rai4-gb分別作10倍(10^-6、10^-7……10^-10)梯度稀釋，每個(gè)稀釋度接種5枚9～11日齡spf雞胚，每胚0.1ml，同時(shí)設(shè)置5枚接種生理鹽水的雞胚作為對(duì)照。37℃孵育，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，之后每隔12h觀察一次直至120h，按oie標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算病毒的mdt。結(jié)果：病毒5個(gè)稀釋度的接種雞胚在120h內(nèi)沒有死亡，該毒株的mdt值大于120h。

雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(intracerebralpathogenicityindex,icpi)測(cè)定：取ha滴度大于4log2的新鮮病毒尿囊液經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)后以不含抗生素滅菌的生理鹽水重做10倍稀釋，經(jīng)腦內(nèi)接種10只1日齡的spf雞，每只腦內(nèi)接種0.05ml，同時(shí)設(shè)置10只注射生理鹽水的spf雞作為對(duì)照。按oie標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)雞進(jìn)行打分，計(jì)算病毒的icpi。尿囊液經(jīng)腦內(nèi)接種1日齡spf雞后均未發(fā)病或死亡，icpi為0，表明獲救病毒的毒力完全符合弱毒的標(biāo)準(zhǔn)。

2、細(xì)胞感染試驗(yàn)

載體疫苗株ai4-t4fhn作10^-3稀釋后，接種雞胚成纖維細(xì)胞48h后，細(xì)胞沒有出現(xiàn)病變，說(shuō)明拯救后病毒對(duì)細(xì)胞沒有毒性。

實(shí)施例3：疫苗載體株的免疫效力試驗(yàn)

將1日齡商品雞和spf雞隨機(jī)分組，10只/組，進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼分別接種疫苗載體毒株ai4-t4fhn和lasota弱毒苗，10⁶eid50/只，同時(shí)設(shè)pbs接種組作為對(duì)照。每只試驗(yàn)雞免疫后2周采集靜脈血，檢測(cè)針對(duì)免疫毒株的血清轉(zhuǎn)化水平。結(jié)果如圖3，ai4-t4fhn和lasota免疫雞群未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，說(shuō)明ai4-t4fhn疫苗載體毒株對(duì)雞不致病，可以安全使用。lasota弱毒苗免疫1日齡商品雞受母源抗體影響較大，不能有效地刺激抗體產(chǎn)生，僅能維持血清效價(jià)；ai4-t4fhn疫苗載體毒株在spf和商品雞中都能夠良好地復(fù)制，并且有效地刺激產(chǎn)生抗體產(chǎn)生。

經(jīng)試驗(yàn)表明：ai4-t4fhn能夠在含有高水平nd母源抗體的商品雞群中復(fù)制并且有效地刺激免疫系統(tǒng)，顯示了廣闊的應(yīng)用前景。

sequencelisting

<110>揚(yáng)州大學(xué)

<120>克服雞新城疫母源抗體影響的嵌合新城疫病毒疫苗載體候選株及構(gòu)建方法

<130>

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<213>人工序列

<400>1

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<210>5

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<400>5

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<210>6

<211>1764

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<213>人工序列

<400>6

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