本發(fā)明涉及鴨抗原轉運相關蛋白tap2單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發(fā)明進一步涉及它們在免疫組化中的應用，屬于tap2單克隆抗體領域。

背景技術：

抗原處理相關轉運體(transporterassociatedwithantigenprocessing,tap)是一種異二聚體跨膜轉運蛋白，tap1/tap2跨越內(nèi)質網(wǎng)膜6次形成“匙孔”樣結構。腫瘤抗原和病毒編碼蛋白等內(nèi)源性抗原，被抗原遞呈細胞(apc)內(nèi)的蛋白酶復合物水解成8-10個氨基酸的短肽。肽首先與“匙孔”的胞漿區(qū)結合，atp結合在tap1/tap2的羧基端，水解導致異二聚體構型改變，開放跨膜通道，暴露膜內(nèi)區(qū)的結合位點，肽段被轉運于內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)。在tapasin、鈣連蛋白和鈣網(wǎng)蛋白等分子伴侶的協(xié)同作用下與內(nèi)質網(wǎng)中新合成組裝完整的mhciα/β2m分子上的肽結合槽結合，形成穩(wěn)定的mhci-抗原肽復合物。分泌至apc細胞表面，被cd8+t細胞識別并引起免疫應答。tap蛋白對mhci類分子在細胞膜上表達的密度和穩(wěn)定性起重要作用：tap分子缺陷或表達降低，可導致mhci類分子因沒有荷載抗原肽而無法在細胞表面穩(wěn)定表達。

不同種屬動物的tap基因均位于mhc核心區(qū)域，但大小和基因組位置各不相同。火雞的tap基因還沒有明確鑒定，但是已通過序列分析獲得了功能和序列類似的mdr/tap基因。雞tap2基因與優(yōu)勢表達的mhc經(jīng)典i類分子a鏈編碼基因bf2緊密相連。鵪鶉tap基因結構更為復雜，與經(jīng)典i類分子4個拷貝基因相鄰。鴨有tap1和tap2兩個反向轉錄的拷貝基因，其中tap2與mhci類分子5個拷貝基因中的優(yōu)勢表達基因uaa毗鄰。

在機體被致病性病毒侵襲或有應激的情況下，如果tap基因組序列發(fā)生突變或其調(diào)節(jié)機制出現(xiàn)缺陷，均可以導致tap蛋白的活性下降和表達下調(diào)，導致腫瘤抗原不能被有效地轉運，使腫瘤逃逸免疫監(jiān)視，最終引起病毒性感染或發(fā)生腫瘤。

tap基因的多態(tài)性與多種疫病的種族敏感性有關，相關度較高的有鼻咽癌(黃種人較白種人患病多)、原發(fā)性黑色素瘤、乳腺癌、漢族食管癌以及人乳頭瘤病毒導致的宮頸癌等，但免疫遺傳學分子機制尚未闡明。鴨的人工馴化時間較短，家鴨的遺傳資源豐富度遠大于家雞，是良好的免疫遺傳研究的模式動物。利用tap基因純合的無特定病原體實驗動物化鴨群感染鴨瘟或禽流感后，不同單倍型鴨的血清抗體效價或致病性不同，表明鴨tap基因有可能作為病毒病免疫遺傳機制研究的候選靶基因。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是提供一株穩(wěn)定分泌鴨抗原轉運相關蛋白tap2單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

本發(fā)明所要解決的第二個技術問題是將所述雜交瘤細胞株分泌的鴨抗原轉運相關蛋白tap2單克隆抗體應用于檢測在動物組織或細胞內(nèi)表達的tap2蛋白。

為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案是：

本發(fā)明首先構建表達tap2的原核表達質粒pet-a2tap2pbd；采用iptg誘導pet-a2tap2pbd原核表達質粒，菌體超聲破碎后，離心棄上清，沉淀用含尿素的結合緩沖液重懸，過鎳柱；用含有不同濃度的咪唑洗脫液洗脫目的蛋白，sds-page結果顯示主要在100mm咪唑濃度時，a2tap2pbd蛋白被洗脫下來。進一步利用表達純化的重組a2tap2pbd蛋白免疫balb/c雌小鼠，將免疫脾細胞與sp2/0骨髓瘤細胞融合，最初獲得6a、4f、3a、10d、9c、6f、10h、6h和7h共9孔陽性細胞孔。但經(jīng)過連續(xù)4次擴大培養(yǎng)并檢測，結果表明，只有6a和4f的衍生細胞仍保持陽性，其它7株逐漸失去分泌特異性抗體的能力，且6a始終表現(xiàn)為強陽性，4f的eilsaod450值較低；因此，本發(fā)明保留6a進一步作亞克隆化。經(jīng)過4次亞克隆，篩選獲得特異性抗體分泌最高的單克隆株，命名為1a6，進一步制備了腹水。

本發(fā)明進一步對16a進行亞類鑒定，鑒定結果為：其單抗重鏈類型為igm，輕鏈為kappa鏈。

通過截短表達的方式，確定了1a6針對的tap蛋白表位：先后設計并合成兩對引物，鑒定1a6的表位，確定1a6針對的段肽的氨基酸序列為narhqmlqqavldatagtgmvaqeai。blast分析表明，與ncbi登錄的鴨tap蛋白序列同源性為96％(aaq62605.1)-88％(aaz30019.1)。

本發(fā)明將穩(wěn)定分泌鴨抗原轉運相關蛋白tap2抗體的單克隆雜交瘤細胞株1a6提交專利認可的機構進行保藏，其微生物保藏編號為：cgmccno.12997；分類命名為：balb/c小鼠雜交瘤細胞。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2016年10月26日；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

為了確證本發(fā)明制備的單克隆抗體1a6是否具有特異性生物學功能，本發(fā)明將鴨瘟強毒株感染雛鴨的大腸、腎臟、盲腸扁桃體和法氏囊組織，-20度凍存后制備冰凍切片。將1a6用pbs稀釋10倍，hrp標記鼠igg為二抗，進行免疫組織化學檢測。免疫組織化學檢測結果表明，在腸粘膜、腎小球、法氏囊生發(fā)中心等部位，檢測到特異性很強的陽性信號，而在氣管、心臟和小腸組織，未檢測到特異性顯色，特異性顯色部位與鴨瘟主要引起消化道癥狀相符合，這是首次利用tap特異性單抗檢測到鴨瘟感染組織中tap蛋白的表達部位。

為了確證本發(fā)明制備的鴨tap蛋白特異性單抗是否能夠檢測到tap蛋白在亞細胞水平的表達，本發(fā)明采集3周齡商品化鴨瘟疫苗免疫后攻擊鴨腸炎病毒(dev)強毒株csc后的鴨大腸組織，2.5％戊二醛固定2h，用0.1mpbs漂洗3次，每次15min。再加入1％鋨酸4℃固定1-2h，用0.1mpbs漂洗3次，每次15min；用50％、70％、90％、100％丙酮逐級脫水。加入epon812樹脂，室溫浸透過夜。將樣品塊挑出放在包埋模具中80℃聚合48h，修塊、切片，切片、染色。冷凍電鏡檢測結果表明，在腸粘膜細胞的細胞核核膜上，可清晰看到特異性的標記(圖6)，這說明利用本發(fā)明制備鴨tap蛋白特異性單抗能夠檢測到tap蛋白在亞細胞水平的表達。

附圖說明

圖1為a2tap2pbd原核表達蛋白純化sds-page結果；m:蛋白質分子質量標準；1.過鎳柱前；2流穿(1)；3.流穿(2)；4.流穿(3)；5.洗脫液；6.100mm(1)；7.100mm(2)；8.250mm(1)；9.250mm(2)；10.250mm(3)；11.250mm(4)；12.500mm(1)；13.500mm(2)；14.500mm(3)；15.800mm(1)；16.800mm(2)；17.1m(1)；18.1m(2)。

圖2鼠抗a2tap2pbd蛋白多克隆抗體的westernblot檢測結果；m：蛋白質分子質量標準；1：誘導前菌體蛋白；2：誘導后菌體蛋白；a為sds-page結果，b的一抗為鼠多抗血清，c的一抗為陰性鼠血清。

圖34f的westernblot檢測結果；m:蛋白質分子質量標準；1:誘導前a2tap2pbd；2：誘導后a2tap2pbd。

圖41a6的westernblot檢測結果；m:蛋白質分子質量標準；1:誘導前a2tap2pbd；2：誘導后a2tap2pbd。

圖5為1a6與鴨瘟感染雛鴨組織的免疫組織化學反應性結果。

圖6為1a6與鴨腸粘膜細胞的冷凍電鏡檢測結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。

實施例1重組tap2蛋白的制備

1.鴨tap基因的擴增與原核表達

提取hbk-spf鴨a2單倍型鴨脾臟總rna，反轉錄成cdna，作為pcr反應模板，擴增鴨a2tap2pbd基因片段?？寺∪朐吮磉_載體pet-30a載體，構建成功pet-a2tap2pbd原核表達質粒。

2.目的蛋白純化條件的優(yōu)化

iptg誘導pet-30aa2tap2pbd原核表達質粒，菌體超聲破碎后，離心棄上清，沉淀用含尿素的結合緩沖液重懸，過鎳柱。用含有不同濃度的咪唑洗脫液洗脫目的蛋白，sds-page結果顯示主要在100mm咪唑濃度時，a2tap2pbd蛋白被洗脫下來，100mm(1)為第一次洗脫后洗脫液制樣，100mm(2)為第二次洗脫后洗脫制樣。在250mm(1)洗脫濃度時條帶也較明顯，但鑒于250mm(2)和250mm(3)隨著洗脫次數(shù)增大蛋白降低，所以250mm咪唑濃度不是最佳洗脫濃度。500、800和1000mm咪唑濃度時，只有少量蛋白被洗脫下來，因此，最終確定咪唑的最佳洗脫濃度為100mm。

實施例2鴨抗原轉運相關蛋白tap2單克隆抗體的制備及鑒定

1動物免疫及細胞融合

取7周齡的balb/c雌性小鼠，用純化的a2tap2pbd蛋白進行免疫，50μg/小鼠,腹腔注射。每隔2周免疫一次，第3次免疫后一周對免疫鼠斷尾采血，37℃放置1h，4℃離心10min分離血清。將血清倍比稀釋，用間接elisa檢測血清效價，選擇血清效價最高的小鼠于融合前3天加強免疫。

用純化后的a2tap2pbd蛋白免疫小鼠后獲得的陽性鼠多抗血清作為一抗，檢測純化前后的a2tap2pbd重組菌，在22kd位置出現(xiàn)目的條帶(圖2)。陰性鼠血清不能檢測出條帶。

2間接elisa方法的建立及陽性雜交瘤株的篩選

根據(jù)棋盤法，確定間接elisa的包被濃度為1.25ug/ml。a2tap2pbd蛋白用碳酸鹽緩沖液稀釋成10μg/ml，2倍倍比稀釋，6個稀釋度，每孔100μl分別包被酶標板中，設置2個重復。封口膜密封后4℃包被過夜。pbst洗板3次，每次浸泡5min，拍干。用pbs配制5％的脫脂乳封閉酶標板，250μl/孔，37℃作用3h封閉非結合位點，之后用pbst洗板3次，每次浸泡5min，拍干。從1：800的稀釋度開始，加入2×系列pbs稀釋后的血清，100μl/孔，同時設空白對照和陰性對照，封口膜封閉后37℃作用1h，之后用pbst洗板3次，每次浸泡5min，拍干。加入1：8000稀釋的hrp標記的山羊抗鼠igg，100μl/孔，封口膜封閉后37℃作用1h，之后用pbst洗板3次，每次浸泡5min，拍干。加入tmb基質顯色液，75μl/孔，37℃，避光反應3min，加入等體積的2m硫酸終止液，用酶標儀測定od450nm的吸光值。

用統(tǒng)計學的方法判定陽性標準：(樣品孔od450nm值－空白對照d450nm值)/(陰性對照孔od450nm值－空白對照d450nm值)>2.1。

最初獲得6a、4f、3a、10d、9c、6f、10h、6h和7h共9孔陽性細胞孔。但經(jīng)過連續(xù)4次擴大培養(yǎng)并檢測，結果表明，只有6a和4f的衍生細胞仍保持陽性，其它7株逐漸失去分泌特異性抗體的能力，且6a始終表現(xiàn)為強陽性，4f的eilsaod450值較低(表1)。

表16a和4f5次檢測的od值

分別利用6a和4f擴大孔對a2tap2pbd重組菌進行western-blot，結果表明，在相同稀釋倍數(shù)和反應條件下，4f反應較弱(圖3)，而6a能清晰檢測到與分子量符合的特異性條帶(圖4)。表明6a的結合力強于4f。保留6a，繼續(xù)做亞克隆化。經(jīng)過4次亞克隆，最終篩選獲得特異性抗體分泌最高的單克隆株，命名為1a6。進一步制備了腹水。

31a6的亞類

根據(jù)rapidelisamousemabisotypingkit說明書對6a進行亞類鑒定，結果為1a6單抗蛋白的重鏈亞類類型為igm，輕鏈為kappa鏈。

41a6表位鑒定

通過截短表達的方式，確定了1a6針對的tap蛋白表位。先后設計并合成兩對引物，鑒定1a6的表位，最終確定1a6針對的段肽的氨基酸序列為narhqmlqqavldatagtgmvaqeai。blast分析表明，與ncbi登錄的鴨tap蛋白序列同源性為96％(aaq62605.1)-88％(aaz30019.1)。

實驗例11a6與鴨瘟感染雛鴨組織的免疫組織化學反應性實驗

將鴨瘟強毒株感染雛鴨的大腸、腎臟、盲腸扁桃體和法氏囊組織，-20度凍存后制備冰凍切片。將實施例制備的1a6用pbs稀釋10倍，hrp標記鼠igg為二抗，進行免疫組織化學檢測。結果表明，在大腸的粘膜、腎小球、法氏囊的生發(fā)中心等部位，檢測到特異性很強的陽性信號，而在氣管、心臟和小腸組織，未檢測到特異性顯色(圖5)。特異性顯色部位與鴨瘟主要引起消化道癥狀相符合，表明1a6能特異地檢測鴨體內(nèi)表達的tap蛋白。

實驗例21a6與鴨腸粘膜細胞的冷凍電鏡檢測結果

采集3周齡商品化鴨瘟疫苗免疫后攻擊鴨腸炎病毒(dev)強毒株csc后的鴨大腸組織，2.5％戊二醛固定2h，用0.1mpbs漂洗3次，每次15min。再加入1％鋨酸4℃固定1-2h，用0.1mpbs漂洗3次，每次15min；用50％、70％、90％、100％丙酮逐級脫水。加入epon812樹脂，室溫浸透過夜。將樣品塊挑出放在包埋模具中80℃聚合48h，修塊、切片，切片、染色。結果表明，在腸粘膜細胞的細胞核核膜上，可清晰看到特異性的標記(圖6)。這是首次利用鴨tap蛋白特異性單抗檢測到tap蛋白在亞細胞水平的表達。