抗hpv l1蛋白的廣譜單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段及它們的用圖
【專利說明】抗HPVL1蛋白的廣譜單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段及它 們的用途
[0001] 本申請是申請日為2012年6月8日、發(fā)明名稱為"抗HPV L1蛋白的廣譜單克隆抗 體或其抗原結(jié)合片段及它們的用途"、申請?zhí)枮?01210190399. 5的申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及分子病毒學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及可廣譜結(jié)合人乳頭 瘤病毒（HPV)Ll蛋白的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段，以及編碼它們的序列，產(chǎn)生它們的 細(xì)胞株，和應(yīng)用它們進(jìn)行診斷、預(yù)防或治療的方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 人乳頭瘤病毒（HPV)是一種無包膜病毒，它由病毒衣殼以及包裹在衣殼內(nèi)的約 8kb DNA構(gòu)成。HPV的病毒衣殼是由主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2組成的直徑為 50-55nm的正二十面體顆粒。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 100多種型別的HPV，其中，根據(jù)其與腫瘤發(fā) 生的關(guān)系可以分為兩類：低危型HPV -一包括HPV6和HPV11，其致癌風(fēng)險(xiǎn)低，主要引起尖銳 濕疣；高危型冊￥-一包括冊￥16、18、31、33、35、39、45、52、58、59等，其是導(dǎo)致包括女性宮 頸癌在內(nèi)的多種腫瘤疾病的主要原因（Clifford GM，Smith JS，Plummer M，et al.Br J Cancer，2003,88 (1) :63-73)?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，可以通過預(yù)防HPV感染來預(yù)防宮頸癌 等疾病的發(fā)生。
[0004] HPV的疫苗研究發(fā)現(xiàn)，體外表達(dá)的HPV L1蛋白能自組裝成病毒樣顆粒（VLP)， 其結(jié)構(gòu)與天然HPV高度相似，保留了天然病毒的絕大多數(shù)中和表位，可誘導(dǎo)高滴度的中 和抗體。因此，現(xiàn)有的以及正在研發(fā)的HPV疫苗多以病毒樣顆粒為主要疫苗成分。然 而，研究發(fā)現(xiàn)，HPV VLP主要誘導(dǎo)針對同型HPV的中和抗體，產(chǎn)生針對同型HPV的保護(hù) 性免疫，而僅在一些同源性高的型別之間存在交叉保護(hù)（Giroglou T，Sapp M，F(xiàn)ligge C, et al.Vaccine. 2001 ； 19(13-14):1783-93 ；0rozco JJ,Carter JJ,Koutsky LA. J Virol[J]. 2005 ；79 (15):9503-14 ；Fleury MJ, Touze A, Maurel MC, et al. Protein Sci. 2009. 18(7) : 1425-1438)。
[0005] 在疫苗研究中，單克隆抗體是疫苗抗原質(zhì)控的重要工具，抗體水平是評價(jià)疫苗效 果的標(biāo)準(zhǔn)，而且，抗體及其表位（尤其是中和抗體對應(yīng)的中和表位）以及相應(yīng)的中和機(jī)制也 是疫苗研發(fā)的重要指針。進(jìn)一步，在應(yīng)用研究中，中和抗體，特別是廣譜中和抗體，在HPV的 診斷，預(yù)防和治療上也將具有特別的優(yōu)勢。然而，現(xiàn)有研究表明，HPV L1蛋白所誘導(dǎo)的抗體 大多為型別特異性中和抗體，極少有跨型別的廣譜中和抗體的報(bào)道。目前，已發(fā)現(xiàn)的跨型別 的抗體僅有HPV16J4、HPV16I23和HPV33E12這3株交叉中和單抗，它們能對幾個型別的HPV 具有一定程度的交叉中和作用。但是，這三株單抗的中和滴度較低，比特異性的中和單抗 (如：中和抗體 V5,參見 Wang 等，Journal of General irology，78 :2209 - 2215(1997)) 小100倍以上，這大大限制了這些單抗的應(yīng)用。
[0006] 因此，本領(lǐng)域仍然需要更多、更有效的廣譜抗體，尤其是廣譜中和抗體，以能夠?qū)?生產(chǎn)的疫苗及疫苗的保護(hù)效果進(jìn)行更好的評價(jià)，并應(yīng)用于HPV的診斷、預(yù)防和治療中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了可廣譜結(jié)合HPV L1蛋白的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段，以及編碼 它們的序列，產(chǎn)生它們的細(xì)胞株，和應(yīng)用它們進(jìn)行診斷、預(yù)防或治療的方法和用途。
[0008] 在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù) 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供 相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。
[0009] 如本文中所使用的，術(shù)語"HPV L1蛋白"是指，人乳頭瘤病毒（HPV)的L1蛋白，其 是本領(lǐng)域公知的（參見，例如NCBI GENBANK數(shù)據(jù)庫序列號：DQ469930. 1)。在本申請中，當(dāng)提 及HPV的L1蛋白或VLP時，其主要涉及選自以下11種型別的HPV的L1蛋白或VLP :HPV6、 HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58 和 HPV59。然而，本領(lǐng)域技 術(shù)人員理解，術(shù)語"HPV L1蛋白"還可以包括其他型別的HPV的L1蛋白。
[0010] 在本申請中，為了方便起見，當(dāng)描述HPV L1蛋白的氨基酸序列時，除非上下文特 別指出，否則，參照HPV16L1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行描述。例如，表述"HPV L1蛋白的第 303-308位氨基酸殘基"是指，HPV16L1蛋白的第303-308位氨基酸殘基。然而，如本文中所 使用的，術(shù)語"HPV L1蛋白"意欲包括所有型別的HPV(特別是上述11種型別）的L1蛋白。 因此，表述"HPV L1蛋白的第303-308位氨基酸殘基"不僅包括HPV16L1蛋白的第303-308 位氨基酸殘基，而且包括其他型別的HPV L1蛋白中的相應(yīng)序列片段。
[0011] 如本文中所使用的，當(dāng)提及HPV16L1蛋白的氨基酸序列時，參照SEQIDN0:59的 氨基酸序列來進(jìn)行描述。例如，表述"HPV16L1蛋白的第303-308位氨基酸殘基"是指，SEQ IDN0:59所示氨基酸序列的第303-308位氨基酸殘基。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在 HPV16L1蛋白的氨基酸序列中，可天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異（包括但不限于，置換， 缺失和/或添加），而不影響其生物學(xué)功能。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語"HPV16L1蛋白"應(yīng)包括 所有此類序列，包括例如SEQIDN0:59所示的序列以及其天然或人工的變體。并且，當(dāng)描述 HPV16L1蛋白的序列片段時，其不僅包括SEQIDN0:59的序列片段，還包括SEQIDN0:59 的天然或人工變體中的相應(yīng)序列片段。例如，表述"HPV 16L1蛋白的第303-308位氨基酸 殘基"包括，SEQIDN0:59的第303-308位氨基酸殘基，以及其變體（天然或人工）中的相 應(yīng)片段。根據(jù)本發(fā)明，表述"相應(yīng)序列片段"或"相應(yīng)片段"是指，當(dāng)對序列進(jìn)行最優(yōu)比對時， 即當(dāng)序列進(jìn)行比對以獲得最高百分?jǐn)?shù)同一性時，進(jìn)行比較的序列中位于等同位置的片段。
[0012] 如本文中所使用的，術(shù)語"抗體"是指，是指通常由兩對多肽鏈（每對具有一條 "輕"(L)鏈和一條"重"(H)鏈）組成的免疫球蛋白分子。抗體輕鏈可分類為k和A輕鏈。 重鏈可分類為y、s、y、a或e，并且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和 IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12或更多個氨基酸的"J"區(qū)連接，重鏈還 包含大約3個或更多個氨基酸的"D"區(qū)。各重鏈由重鏈可變區(qū)（VH)和重鏈恒定區(qū)（CH)組成。 重鏈恒定區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域（41、(^2和(^3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)（\)和輕鏈恒定區(qū) (CJ組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域Q組成?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織 或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞（例如，效應(yīng)細(xì)胞）和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分（Clq)的 結(jié)合。VH和八區(qū)還可被細(xì)分為具有高變性的區(qū)域（稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR))，其間散布有較 保守的稱為構(gòu)架區(qū)（FR)的區(qū)域。各由按下列順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4從氨基末端至羧基末端排列的3個⑶R和4個FR組成。各重鏈/輕鏈對的可變區(qū)（V H 和分別形成抗體結(jié)合部位。氨基酸至各區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987and 1991))，或 Chothia&Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 ;Chothia 等人（1989) Nature 342:878-883的定義。術(shù)語"抗體"不受任何特定的產(chǎn)生抗體的方法限制。例如，其 包括，特別地，重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體。抗體可以是不同同種型的抗體，例如， IgG (例如，IgGl，IgG2, IgG3 或 IgG4 亞型），IgAl，IgA2, IgD，IgE 或 IgM 抗體。
[0013] 如本文中所使用的，術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合片段"是指包含全長抗體的片 段的多肽，其保持特異性結(jié)合全長抗體所結(jié)合的相同抗原的能力，和/或與全長抗 體競爭對抗原的特異性結(jié)合，其也被稱為"抗原結(jié)合部分"。通常參見，F(xiàn)undamental 1臟11]1〇1〇區(qū)7,〇1.7(?&111，？.，6(1.，第2版，1^￥611?代88，11￥.(1989)，其以其全文通過引用 合并入本文，用于所有目的。可通過重組DNA技術(shù)或通過完整抗體的酶促或化學(xué)斷裂產(chǎn)生 抗體的抗原結(jié)合片段。在一些情況下，抗原結(jié)合片段包括Fab、Fab'、F(ab'） 2、Fd、Fv、dAb和 互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)片段、單鏈抗體（例如，scFv)、嵌合抗體、雙抗體（diabody)和這樣的多 肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結(jié)合能力的抗體的至少一部分。
[0014] 如本文中所使用的，術(shù)語"Fd片段"意指由％和CH1結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語 "Fv片段"意指由抗體的單臂的\和V H結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語"dAb片段"意指由V H 結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段（Ward等人，Nature 341:544-546 (1989));術(shù)語"Fab片段"意指由 \、VH、C# CH1結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語"F(ab'）2片段"意指包含通過鉸鏈區(qū)上的二硫 橋連接的兩個Fab片段的抗體片段。
[0015] 在一些情況下，抗體的抗原結(jié)合片段是單鏈抗體（例如，scFv)，其中^和 VH結(jié)構(gòu)域通過使其能夠產(chǎn)生為單個多肽鏈的連接體配對形成單價(jià)分子（參見，例 如，Bird 等人，Science 242:423-426 (1988)和 Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988))。此類 scFv 分子可具有一般結(jié)構(gòu)：NH2-\-接頭-Vh-C00H 或 NH2-Vh-接 頭-\-C00H。合適的現(xiàn)有技術(shù)接頭由重復(fù)的GGGGS氨基酸序列或其變體組成。例如，可 使用具有氨基酸序列（GGGGS) 4的接頭，但也可使用其變體（Holliger等人（1993)，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90:6444-6448)?？捎糜诒景l(fā)明的其他接頭由 Alfthan 等人（1995)， Protein Eng. 8:725-731，Choi 等人（2001)，Eur.J. Immunol. 31:94-106, Hu 等人（1996)， Cancer Res. 56:3055-3061，Kipriyanov 等人（1999)，J. Mol. Biol. 293:41-56 和 Roovers 等人（2001)，Cancer Immunol.描述。
[0016] 在一些情況下，抗體的抗原結(jié)合片段是雙抗體，即，雙價(jià)抗體，其中％和Vj吉構(gòu) 域在單個多肽鏈上表達(dá)，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個結(jié)構(gòu)域之間配 對，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對并且產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合部位（參見，例 如，Holliger P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)，和 Pol jak R.J?等 人，Structure 2:1121-1123(1994))。
[0017] 可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)（例如，重組DNA技術(shù)或酶促或化學(xué)斷裂 法）從給定的抗體（例如本發(fā)明提供的單克隆抗體4B3、13A10、12B9或4H4)獲得抗體的抗 原結(jié)合片段（例如，上述抗體片段），并且以與用于完整抗體的方式相同的方式就特異性篩 選抗體的抗原結(jié)合片段。
[0018] 在本文中，除非上下文明確指出，否則當(dāng)提及術(shù)語"抗體"時，其不僅包括完整抗 體，而且包括抗體的抗原結(jié)合片段。
[0019] 如本文中所使用的，術(shù)語"單抗"和"單克隆抗體"是指，來自一群高度同源的 抗體分子中的一個抗體或抗體的一個片斷，也即除可能自發(fā)出現(xiàn)的自然突變外，一群完 全相同的抗體分子。單抗對抗原上的單一表位具有高特異性。多克隆抗體是相對于單 克隆抗體而言的，其通常包含至少2種或更多種的不同抗體，這些不同的抗體通常識 別抗原上的不同表位。單克隆抗體通常可采用Kohler等首次報(bào)道的雜交瘤技術(shù)獲得 (Nature，256:495, 1975)，但也可采用重組DNA技術(shù)獲得（如參見U.S.P 4,816,567)。
[0020] 如本文中所使用的，以編號提及的單克隆抗體與從相同編號的雜交瘤獲得的單 克隆抗體相同。例如，單克隆抗體4B3(或13A10、12B9或4H4)分別是與從雜交瘤細(xì)胞株 4B3(或13A10、12B9或4H4)或其亞克隆或后代細(xì)胞獲得的抗體相同的抗體。
[0021] 如本文中所使用的，術(shù)語"嵌合抗體"是指這樣的抗體，其輕鏈或/和重鏈的一 部分源自一個抗體（其可以源自某一特定物種或?qū)儆谀骋惶囟贵w類或亞類），且輕鏈 或/和重鏈的另一部分源自另一個抗體（其可以源自相同或不同的物種或?qū)儆谙嗤虿?同的抗體類或亞類），但無論如何，其仍保留對目標(biāo)抗原的結(jié)合活性（U.S.P 4,816,567t〇 Cabilly et al. ；Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:68516855(1984)) 〇
[0022] 如本文中所使用的，術(shù)語"人源化抗體"是指，人源免疫球蛋白（受體抗體）的全 部或部分CDR區(qū)被一非人源抗體（供體抗體）的CDR區(qū)替換后得到的抗體或抗體片段，其 中的供體抗體可以是具有預(yù)期特異性、親和性或反應(yīng)性的非人源（例如，小鼠、大鼠或兔） 抗體。此外，受體抗體的構(gòu)架區(qū)（FR)的一些氨基酸殘基也可被相應(yīng)的非人源抗體的氨基酸 殘基替換，或被其他抗體的氨基酸殘基替換，以進(jìn)一步完善或優(yōu)化抗體的性能。關(guān)于人源化 抗體的更多詳細(xì)內(nèi)容，可參見例如，Jones et al.，Nature, 321:522 525(1986) ;Reichmann et al. , Nature, 332:323 329(1988) ；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. , 2:593 596(1992)； 和 Clark, Immunol. Today 21:397 402 (2000)。
[0023] 如本文中所使用的，"中和抗體"是指，能清除或顯著降低目標(biāo)病毒的毒力（例如， 感染細(xì)胞的能力）的抗體或抗體片段。
[0024] 如本文中所使用的，術(shù)語"表位"是指，抗原上被免疫球蛋白或抗體特異性結(jié)合的 部位。"表位"在本領(lǐng)域內(nèi)也稱為"抗原決定簇"。表位或抗原決定簇通常由分子的化學(xué)活 性表面基團(tuán)例如氨基酸或碳水化合物或糖側(cè)鏈組成并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以 及特定的電荷特征。例如，表位通常以獨(dú)特的空間構(gòu)象包括至少3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12， 13,14或15個連續(xù)或非連續(xù)的氨基酸，其可以是"線性的"或"構(gòu)象的"。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G. E. Morris，Ed. (1996)〇 在線性表位中，蛋白質(zhì)與相互作用分子（例如抗體）之間的所有相互作用的點(diǎn)沿著蛋白質(zhì) 的一級氨基酸序列線性存在。在構(gòu)象表位中，相互作用的點(diǎn)跨越彼此分開的蛋白質(zhì)氨基酸 殘基而存在。
[0025] 如本文中所使用的，術(shù)語"表位肽"是指，抗原上能夠用作表位的肽段。在一些 情況下，單獨(dú)的表位肽即能夠被針對所述表位的抗體特異性識別/結(jié)合。在另一些情況 下，可能需要將表位肽與載體蛋白融合，以便表位肽能夠被特異性抗體識別。如本文中所 使用的，術(shù)語"載體蛋白"是指這樣的蛋白，其可以充當(dāng)表位肽的載體，即，其可以在特定 位置處插入表位肽，以便該表位肽能夠呈現(xiàn)出來，從而該表位肽能夠被抗體或免疫系統(tǒng) 識別。此類載體蛋白是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括例如，HPV L1蛋白（可以將表位肽 插入在所述蛋白的第127-128位氨基酸之間，或在第423-424位氨基酸之間，參見例如， Varsani A, Chimeric human papillomavirus type 16(HPV-16)Llparticles presenting the common neutralizing epitope for the L2minor capsid protein of HPV_6and HPV-16. J Virol. 2003Aug ;77 (15) : 8386-93)，HBV核心抗原（可以用表位肽替換所述 蛋白的第 79-81 位氨基酸，參見 Schodel，F(xiàn). The position of heterologous epitopes inserted in hepatitis B virus core particles determines their immunogenicity. J Virol，1992, 66:106-114)，和CRM197蛋白（可以將表位肽連接至該蛋白或其片段的N末端 或C末端）。
[0026] 在本發(fā)明中，CRM197(Cross-Reacting Materials 197)是指，白喉毒素（DT) 的一種無毒突變體（Uchida，T.，A. M, Pappenheimer，Jr.，R. Gregory，et al.，J. Biol. Chem. 1973. 248:3838-3844)，其與編碼DT的野生型基因相比存在單個核苷酸突變，導(dǎo)致 第 52 位的氨基酸殘基由 Gly 變?yōu)?Glu(G.Giannini，R.Rappuoli，G.Rattiet al.，Nucleic Acids Research. 1984. 12 ：4063-4070)〇
[0027] 可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，就與相同表位的結(jié)合競爭性篩選抗體。 例如，可進(jìn)行克爭和交叉克爭研究，以獲得彼此克爭或交叉克爭與抗原（例如，HPV L1蛋 白）的結(jié)合的抗體?；谒鼈兊慕徊娓偁巵慝@得結(jié)合相同表位的抗體的高通量方法描述于 國際專利申請W0 03/48731中。因此，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，獲得與本發(fā) 明的單克隆抗體（例如，單克隆抗體4B3、13A10、12B9或4H4)競爭結(jié)合L1蛋白上的相同表 位的抗體及其抗原結(jié)合片段（即，抗原結(jié)合部分）。
[0028] 如本文中所使用的，術(shù)語"分離的"或"被分離的"指的是，從天然狀態(tài)下經(jīng)人工手 段獲得的。如果自然界中出現(xiàn)某一種"分離"的物質(zhì)或成分，那么可能是其所處的天然環(huán) 境發(fā)生了改變，或從天然環(huán)境下分離出該物質(zhì)，或二者情況均有發(fā)生。例如，某一活體動物 體內(nèi)天然存在某種未被分離的多聚核苷酸或多肽，而從這種天然狀態(tài)下分離出來的高純度 的相同的多聚核苷酸或多肽即稱之為分離的。術(shù)語"分離的"或"被分離的"不排除混有人 工或合成的物質(zhì)，也不排除存在不影響物質(zhì)活性的其它不純物質(zhì)。
[0029] 如本文中所使用的，術(shù)語"大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)"是指由大腸桿菌（菌株）與載體組 成的表達(dá)系統(tǒng)，其中大腸桿菌（菌株）來源于市場上可得到的菌株，例如但不限于：GI698， ER2566, BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
[0030] 如本文中所使用的，術(shù)語"載體（vector) "是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種 核酸運(yùn)載工具。當(dāng)載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達(dá)時，載體稱為表達(dá)載體。載 體可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲 得表達(dá)。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于：質(zhì)粒；噬菌粒；柯斯質(zhì)粒；人工染色 體，例如酵母人工染色體（YAC)、細(xì)菌人工染色體（BAC)或P1來源的人工染色體（PAC);噬 菌體如A噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等?？捎米鬏d體的動物病毒包括但不限于，逆轉(zhuǎn) 錄酶病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒（如單純皰疹病毒）、痘病毒、桿狀 病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒（如SV40)。一種載體可以含有多種控制表達(dá)的元件， 包括但不限于，啟動子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報(bào)告基因。另外，載體 還可含有復(fù)制起始位點(diǎn)。
[0031] 如本文中所使用的，術(shù)語"宿主細(xì)胞"是指，可用于導(dǎo)入載體的細(xì)胞，其包括但不限 于，如大腸桿菌或枯草菌等的原核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或曲霉菌等的真菌細(xì)胞，如S2果蠅細(xì) 胞或Sf9等的昆蟲細(xì)胞，或者如纖維原細(xì)胞，CH0細(xì)胞，C0S細(xì)胞，NS0細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，BHK 細(xì)胞，HEK 293細(xì)胞或人細(xì)胞等的動物細(xì)胞。
[0032] 如本文中所使用的，術(shù)語"同一性"用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的 匹配情況。當(dāng)兩個進(jìn)行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù) 時（例如，兩個DNA分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個多肽的每一個中 的某個位置都被賴氨酸占據(jù)），那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的"百分?jǐn)?shù) 同一性"是由這兩個序列共有的匹配位置數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置數(shù)目X100的函數(shù)。例 如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如， DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性（總共6個位置中有3個位置匹配）。通常， 在將兩個序列比對以產(chǎn)生最大同一性時進(jìn)行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過 計(jì)算機(jī)程序例如Align程序（DNAstar, Inc.)方便地進(jìn)行的Needleman等人（1970) J. Mol. Biol. 48:443-453的方法來實(shí)現(xiàn)。還可使用已整合入ALIGN程序（版本2.0)的E. M