一種從Cohn組分Ⅳ沉淀中分離純化α2-巨球蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及血液制品分離純化技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種從Cohn組分IV沉淀中 分離純化a 2-巨球蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Cohn組分IV沉淀是血漿蛋白生產(chǎn)中的廢棄物，也可簡稱為Cohn IV沉淀。Cohn IV沉 淀中主要是蛋白，其中包括很多有潛在價(jià)值的蛋白質(zhì)，但現(xiàn)在通常作為廢棄物丟掉，這些蛋 白無論作為臨床使用還是作為生化診斷試劑都有著非常廣闊的前景。比如a 1-抗胰蛋白 酶：可以治療a 1-抗胰蛋白酶先天性缺乏伴肺氣腫患者，是美國FDA批準(zhǔn)的藥品；a 2-巨 球蛋白：用于放射損傷的治療以及眼角膜損傷和角膜炎的治療；補(bǔ)體1酯酶抑制劑：用于治 療遺傳性血管神經(jīng)性水腫；結(jié)合珠蛋白：靜脈輸注結(jié)合珠蛋白或用固相化結(jié)合珠蛋白體外 循環(huán)去除血液中的游離血紅蛋白，防止和治療溶血性腎衰竭；運(yùn)鐵蛋白：治療先天性無運(yùn) 鐵蛋白血癥，用脫鐵的運(yùn)鐵蛋白治療鐵血黃素沉著癥；銅監(jiān)蛋白：促進(jìn)紅細(xì)胞生成，治療貧 血。
[0003] 其中，a 2-巨球蛋白（a 2-M)是體內(nèi)重要的蛋白酶抑制劑，分子量為720kD(千 道爾頓）。它是由四個(gè)相同亞基組成的四聚體，每個(gè)亞基由1451個(gè)氨基酸組成，含糖量為 8-11%。a2_M主要由肝細(xì)胞合成，在正常人血漿中的含量為2_4g/L。在人體內(nèi)a2_M能 夠清除多余的內(nèi)源性及外源性蛋白酶而發(fā)揮蛋白酶抑制劑的作用。除此之外a 2-M還具有 抗輻射、抗腫瘤、抑制氧自由基、參與凝血平衡及與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子活性等作用。
[0004] a 2-M曾收錄在1990年版生物制品規(guī)程試行規(guī)程上，其臨床適應(yīng)癥主要是針對(duì)放 射性皮膚和粘膜局部潰瘍、損傷，放療部位手術(shù)創(chuàng)口崩裂、潰瘍、組織壞死以及角膜炎等。但 是目前國內(nèi)外尚無a 2-M相關(guān)產(chǎn)品上市。近年來隨著世界核安全形勢的緊張以及腫瘤患 者放療致皮膚黏膜損傷的普遍，研發(fā)a 2-M相關(guān)產(chǎn)品無論從國家及軍隊(duì)?wèi)?zhàn)略儲(chǔ)備角度考慮 還是從日常臨床需求考慮都顯得十分必要。要想得到a 2-M相關(guān)產(chǎn)品，首先要有純度高的 a 2_M〇
[0005] 最早1955年Schultze從人血清中首次分離出a 2-M，隨著對(duì)a 2-M生物學(xué)特性 研究的深入及其臨床應(yīng)用的開展，對(duì)a 2-M純化制備工藝的研究也越加廣泛。早在1975 年 SONG 等人（M.K. SONG, et al, Large Scale Purification of a 2-Macroglobulin from Human Plasma, Biochemical Medicine, 1975, 14:162-169)報(bào)道通過利凡諾分級(jí)沉淀結(jié)合 PEG沉淀、凝膠過濾的方法制備出了純度較高的a 2-M，該工藝的回收率達(dá)60%。國內(nèi)學(xué) 者劉文方等（劉文方等，利凡諾法分離人血漿a 2-M的研究，中華血液學(xué)雜志1984, 5(5): 323)同樣使用利凡諾分級(jí)沉淀的方法制備出純度80%以上的a2-M，但20世紀(jì)90年代中 國禁止使用利凡諾法生產(chǎn)人血液制品，因此該工藝被廢除。
[0006] 19 7 8 年 Virca 等(G. D. Virca, et al, Purification of human a 2-macrolobulin by chromatography on cibacron blue sepharose, Analytical Biochemistry, 1978,89:274-278)使用cibacron藍(lán)色染料親和層析的方法制備a 2_M，其 活性回收率高達(dá)75%，但該方法的局限性在于起始純化血漿中結(jié)合珠蛋白的類型需為1-1 型，而1-1型結(jié)合珠蛋白獻(xiàn)漿者只占總獻(xiàn)漿者的10%，這限制了 a 2-M純化制備時(shí)的原料來 源。
[0007] 1978 年 JOHN 等（JOHN E. McENTIRE，Purification of alpha_2Macroglobulin By Immunoadsorbent Chromatography, Journal of Immunological Methods, 1978,24:39-45) 將兔抗人a 2-M抗血清螯合在瓊脂糖介質(zhì)上，采用免疫親和層析的方法制備出高 純的 a2_M。1981 年 Barrett (Alan J. Barrett, a2-macrolobulin, Methods in Enzymology，1981，80:737-754)同樣使用免疫親和層析并結(jié)合PEG沉淀及凝膠過濾的方法 制備a 2-M。免疫親和層析雖然能夠制備出高純的a 2-M，但其純化效率很低，因此不適合 規(guī)?；a(chǎn)制備。1986年國內(nèi)學(xué)者彭啟明等（彭啟明等，人血漿a 2-巨球蛋白的分離純 化，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1986, 3:69-72)結(jié)合PEG沉淀法、cibacron藍(lán)色染料親和層 析以及兩步鋅離子親和層析的方法純化a 2-M，其純化倍數(shù)達(dá)72. 2倍，但活性回收率僅為 31. 1%。1990年版中國生物制品規(guī)程試行規(guī)程中介紹了低溫乙醇法分離組分IV，再結(jié)合硫 酸銨鹽析法制備a 2-M，但該方法制備的a 2-M純度在40 %左右。
[0008] 現(xiàn)有的純化制備工藝存在的上述問題均制約了 a 2-M純化工藝應(yīng)用于生產(chǎn)。適于 規(guī)?；苽涞睦仓Z法被禁止用于生產(chǎn)人血液制品；cibacron藍(lán)色染料親和層析對(duì)起始 血漿來源有限制；免疫親和層析效率較低，僅適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備；單純的硫酸銨沉淀 法制備出的a 2-M純度較低，無法滿足對(duì)血液制品的質(zhì)量要求；等等。同時(shí)，幾乎所有的純 化工藝均是以血漿為起始材料，但目前工業(yè)生產(chǎn)時(shí)血漿主要用于生產(chǎn)白蛋白、靜脈注射用 丙種球蛋白、凝血因子等制品，若以血漿為原料制備a 2-M則會(huì)影響到血漿的綜合利用，極 大降低經(jīng)濟(jì)效益。因此有必要建立一種適于規(guī)?；苽淝夷軌蚓C合利用血漿，從血漿蛋白 生產(chǎn)過程產(chǎn)生的廢棄物中分離純化a 2-M的工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，提供一種適合規(guī)?；a(chǎn)的從 Cohn組分IV沉淀中分離純化a 2-巨球蛋白的方法，將Cohn組分IV沉淀依次經(jīng)過硫酸銨鹽 析、鋅離子親和層析、凝膠過濾和超濾濃縮，最終得到a 2-巨球蛋白。
[0010] 所述硫酸銨鹽析中硫酸銨的飽和度為40-60%，優(yōu)選45% -55%。
[0011] 所述硫酸銨鹽析為單次鹽析，即加入硫酸銨后攪拌1小時(shí)，再離心15分鐘。
[0012] 所述鋅離子親和層析中純化介質(zhì)選用鋅離子螯合高流速瓊脂糖介質(zhì)（Zn-IDA QZT6FF)。
[0013] 所述鋅離子親和層析中洗脫液可選用pH為6. 5-7. 0的0. 1M Na2EDTA、pH為7. 4 的 20mM Tris+0. 1M NaCl+0. 1-0. 5M 咪唑、pH 為 4. 5-5. 0 的 0? 02M Tris+0. 5M NaCl 或 pH 為 7. 4 的 20mM Tris+0. 1M NaCl+0. 01-0. 05M 組氨酸中的一種。
[0014] 所述凝膠過濾中過濾介質(zhì)可選用聚丙烯酰胺葡聚糖凝 膠-200HR(S印hacryl-200HR)、聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠-300HR(S印hacryl-300HR)、瓊脂糖 凝膠（Superose prep grade 或 Superose 12)、或交聯(lián)葡聚糖（G_200Sephadex G_200)〇
[0015] 所述超濾濃縮中選用的超濾膜的截留量在30-500kD之間，優(yōu)選50-100kD孔徑的 超濾膜。
[0016] 具體包括以下步驟：
[0017] a).硫酸銨鹽析：將Cohn組分IV沉淀溶解于8-12倍體積的蒸餾水中，通過壓濾獲 得壓濾液，在壓濾液中添加硫酸銨，使其飽和度達(dá)到40% -60%，離心得到沉淀與上清，棄 上清；
[0018] b).鋅離子親和層析：將步驟a)得到的沉淀用平衡緩沖液溶解成沉淀溶解液后進(jìn) 行鋅離子親和層析，至蛋白峰降至基線時(shí)停止洗脫，收集親和層析的洗脫液；純化介質(zhì)選用 鋅離子螯合高流速瓊脂糖介質(zhì)（Zn-IDA QZT 6FF)，優(yōu)選用來溶解沉淀的平衡緩沖液的體積 為步驟a)中壓濾液體積的1/2 ;
[0019] c).凝膠過濾：將步驟b)得到的親和層析的洗脫液進(jìn)行凝膠過濾，收集第一蛋白 峰的凝膠過濾的洗脫液；
[0020] d).超濾濃縮：將步驟C)得到的凝膠過濾的洗脫液中蛋白濃度濃縮至4. 5-5. 5%， 再使用0. 22 y m濾器過濾除菌，即得到目標(biāo)蛋白；
[0021] 優(yōu)選的是，步驟b)中用來溶解沉淀的平衡緩沖液所使用的是pH6.0-7. 0的0. 02M Tris+0. 5M NaCl緩沖液；步驟b)中的洗脫液選用pH6.5-7. 0的0. 1M Na2EDTA。
[0022] 步驟b)的鋅離子親和層析主要包括以下幾個(gè)步驟：i )裝柱：將純化介質(zhì)填裝在 層析柱內(nèi)；ii )緩沖純化介質(zhì)：使用平衡緩沖液平衡緩沖純化介質(zhì)；iii)上樣：將沉淀溶解 液栗入層析柱內(nèi)；iv )淋洗：使用平衡緩沖液將未能與純化介質(zhì)結(jié)合的蛋白淋洗下來；v ) 洗脫：使用洗脫液將結(jié)合在純化介質(zhì)上的蛋白洗脫下來；
[0023] 步驟c)的凝膠過濾主要包括以下幾個(gè)步驟：i )裝柱：將過濾介質(zhì)填裝在層析柱 內(nèi)；ii )緩沖過濾介質(zhì)：使用平衡緩沖液平衡緩沖過濾介質(zhì)；iii)上樣：將步驟b)得到的親 和層析的洗脫液栗入層析柱內(nèi)；iv )淋洗：使用平衡緩沖液將目標(biāo)蛋白a 2-巨球蛋白淋洗 下來；
[0024] 優(yōu)選的，步驟b)中緩沖純化介質(zhì)、淋洗，及步驟c)中緩沖過濾介質(zhì)和淋洗所使用 的平衡緩沖液均是PH6. 0-7. 0的0. 02M Tris+0. 5M