NaCl緩沖液。
[0025] 在進(jìn)行步驟b)之前將步驟a)得到的沉淀溶解于透析液中進(jìn)行超濾脫鹽，所述透 析液為PH6. 0-7. 0的0. 02M Tris+0. 5M NaCl緩沖液；優(yōu)選的，所述超濾脫鹽中選用的超濾 膜的截留量在30-500kD之間，優(yōu)選50-100kD孔徑的超濾膜。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0027] 本發(fā)明所選的用于分離純化a 2-M的起始原料為Cohn組分IV沉淀，是工業(yè)上利用 低溫乙醇分離法制備白蛋白過程中產(chǎn)生的，目前Cohn組分IV沉淀多作為工業(yè)廢棄物處理， 因此原料價格低廉。本發(fā)明采用廢棄物制備出具有治療價值的a 2-M，降低了生產(chǎn)成本，提 高了血漿綜合利用率及經(jīng)濟(jì)效益。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明的分離純化過程中綜合運用了鹽析、 親和層析、分子篩的方法制備出高純的a 2-M，其中硫酸銨鹽析這一步是對Cohn組分IV沉 淀的粗分離，該步驟去除近一半的雜蛋白，鋅離子親和層析能夠相對特異性地富集a 2-M， 最后一步凝膠過濾是利用分子篩，將a 2-M與小分子雜蛋白分離。親和層析中采用金屬螯 合高流速瓊脂糖（Zn-IDA QZT 6FF)作基質(zhì)，該基質(zhì)耐堿能力較好，線性流速較高，適于工業(yè) 化生產(chǎn)。用本發(fā)明方法分離純化得到的a 2-M純度能夠達(dá)到90%以上，純度滿足血液制品 的質(zhì)量要求，且操作簡單；該方法對a 2-M的活性回收率基本超過50%，適合規(guī)?；a(chǎn)。
【附圖說明】
[0028] 圖1為鋅離子親和層析分離純化a 2-M的色譜圖；
[0029] 圖2為凝膠過濾分離純化a 2-M的色譜圖；
[0030] 圖3為SDS-PAGE鑒定a 2-M非還原性電泳圖譜；
[0031] 圖4為對圖3條帶4中蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0032] 本發(fā)明提供的從Cohn組分IV沉淀中分離純化a 2-巨球蛋白的方法，是將Cohn組 分IV沉淀依次經(jīng)過硫酸銨鹽析、鋅離子親和層析、凝膠過濾和超濾濃縮，最終得到a 2-巨 球蛋白的過程。
[0033] 具體包括以下步驟：
[0034] a).硫酸銨鹽析：將Cohn組分IV沉淀溶解于蒸餾水中（Cohn組分IV沉淀與蒸餾 水的質(zhì)量體積比（g:mL)為1 :(8_12))，通過壓濾獲得壓濾液，在壓濾液中緩慢添加硫酸銨 (添加過程大約持續(xù)1小時），使其飽和度達(dá)到40 % -60 %，優(yōu)選45 % -55 %，8000g/分鐘離 心15min得到沉淀與上清，棄上清。
[0035] b).鋅離子親和層析：將步驟a)得到的沉淀用平衡緩沖液（pH6. 0-7. 0的0. 02M Tris+0.5M NaCl)溶解得到沉淀溶解液（沉淀加入平衡緩沖液攪拌得到），所用平衡緩沖液 的體積為步驟a)得到的壓濾液體積的1/2 ;再進(jìn)行鋅離子親和層析，至蛋白峰降至基線時 停止洗脫，收集親和層析的洗脫液。
[0036] 鋅離子親和層析是用GE公司的蛋白純化儀AKTA purifier進(jìn)行的，主要包括以 下幾個步驟：i )裝柱：將純化介質(zhì)填裝在層析柱內(nèi)，整個純化介質(zhì)的體積為1個柱體積 (1CV)，并將該層析柱與蛋白純化儀連接；ii )緩沖純化介質(zhì)：使用約5CV的平衡緩沖液平 衡緩沖純化介質(zhì)；iii)上樣：將沉淀溶解液栗入層析柱內(nèi)，使目標(biāo)蛋白a 2-M能夠與純化介 質(zhì)充分結(jié)合；iv )淋洗：使用平衡緩沖液將未能與純化介質(zhì)結(jié)合的蛋白淋洗下來，淋洗至基 線時純化介質(zhì)中只剩下與純化介質(zhì)結(jié)合的蛋白，一般淋洗需要約8-10CV ;v )洗脫：此時使 用洗脫液將結(jié)合在純化介質(zhì)上的蛋白洗脫下來，一般需要1CV洗脫液。
[0037] 純化介質(zhì)選用鋅離子螯合高流速瓊脂糖介質(zhì)（Zn-IDA QZT 6FF)，純化介質(zhì)與沉淀 溶解液的加入比是根據(jù)沉淀溶解液中蛋白濃度的大小而定的，本發(fā)明中純化介質(zhì)與沉淀溶 解液體積比約為1 :5。該過程中緩沖純化介質(zhì)和淋洗過程均使用平衡緩沖液（pH6. 0-7. 0的 0? 02M Tris+0. 5M NaCl)，洗脫液選用 pH6. 5-7. 0 的 0? 1M Na2EDTA。
[0038] c).凝膠過濾：將步驟b)得到的親和層析的洗脫液進(jìn)行凝膠過濾。凝膠過濾是利 用分子量不同的蛋白質(zhì)在過濾介質(zhì)中滯留時間不同的原理實現(xiàn)蛋白的分離提純，蛋白分子 越大滯留時間越短，越早被淋洗下來。由于a 2-M分子量最大，因此只需要收集第一個蛋白 峰即可。該過程與鋅離子親和層析相似，包括裝柱、緩沖過濾介質(zhì)、上樣和淋洗這幾個步驟， 用GE公司的蛋白純化儀AKTA purifier進(jìn)行，該儀器可以檢測淋洗液中的蛋白濃度，并根 據(jù)濃度高低自動繪制蛋白峰圖，操作中，目標(biāo)蛋白a 2-M會最先被淋洗下來，因此根據(jù)儀器 中蛋白出峰情況收集第一蛋白峰的淋洗液，當(dāng)?shù)诙宄霈F(xiàn)時即停止收集。
[0039]其中，過濾介質(zhì)選用Sephacryl_200HR (聚丙稀酰胺葡聚糖凝膠-200HR)、 Sephacryl_300HR (聚丙稀酰胺葡聚糖凝膠-300HR)、Superose 12 (瓊脂糖凝膠）、Superose prep grade (瓊脂糖凝膠）或Sephadex G-200 (交聯(lián)葡聚糖G-200)中一種，親和層析 的洗脫液的體積一般是過濾介質(zhì)體積的1-3%，緩沖過濾介質(zhì)和淋洗均使用平衡緩沖液 (pH6. 0-7. 0 的 0? 02M Tris+O. 5M NaCl)。
[0040] d).超濾濃縮：將步驟c)得到的凝膠過濾的淋洗液進(jìn)行超濾濃縮，濃縮至蛋白濃 度為4. 5-5. 5% ;再使用0. 22 ym濾器過濾除菌，即可得到目標(biāo)蛋白a 2-M產(chǎn)品，產(chǎn)品為液 體。
[0041] 選用的超濾膜的截留量在30-500kD之間，優(yōu)選50-100kD孔徑的超濾膜。
[0042] 以上方法中，進(jìn)一步地，在進(jìn)行步驟b)之前最好用超濾的方法對步驟a)得到的沉 淀進(jìn)行脫鹽，即將沉淀加入透析液中超濾脫鹽，選用的超濾膜的截留量在30-500kD之間， 所用的透析液為pH6. 0-7. 0的0. 02M Tris+0. 5M NaCl緩沖液。
[0043] 實施例
[0044] 按上述方法對Cohn組分IV沉淀中的a 2-M進(jìn)行分離純化，并對方法中的一些參數(shù) 做了調(diào)整（見表1)，然后用質(zhì)譜驗證所得產(chǎn)品（見圖4)并翻譯圖4得到表2,進(jìn)而檢測所 得a 2-M的純度和活性回收率，結(jié)果見表3。
[0045] 表1用不同參數(shù)的方法分離純化Cohn組分IV沉淀中的a 2-M的結(jié)果
[0046]
[0047]
[0048] 以例1為例，圖1-圖4為按照例1方法分離純化a 2-M得到的色譜圖和質(zhì)譜鑒定 結(jié)果，其中圖3為SDS-PAGE鑒定a 2-M非還原性圖譜，M為分子量Marker，條帶1-3分別為 步驟a)中的壓濾液、步驟b)中的沉淀溶解液、步驟b)得到的親和層析的洗脫液，條帶4為 步驟c)得到的淋洗液，即Sephacryl_200HR第一峰。
[0049] 質(zhì)譜的目的是對制備的蛋白進(jìn)行鑒定，鑒定其是否為目標(biāo)蛋白。圖4為質(zhì)譜鑒定 結(jié)果，即通過對圖3中條帶4中的蛋白進(jìn)行分析，與數(shù)據(jù)庫中肽段進(jìn)行比對，并根據(jù)匹配度 的高低進(jìn)行排序，匹配度越高證明純化得到的蛋白是與其匹配蛋白的可能性就越大。左側(cè) 的數(shù)字是右側(cè)相應(yīng)肽段的gi號，在pubmed上可搜索該gi號查詢相應(yīng)肽段的具體信息。對 圖4的翻譯如表1，從圖4可以看出，匹配度最高的三個肽段均是人源a 2-巨球蛋白（第2 和第3個gi號通過pubmed查詢獲得相關(guān)信息），第7和第8個gi號鑒定的角蛋白為操作 時手指皮膚上粘上去的蛋白，為實驗誤差，并非實驗制備的蛋白。而其余鑒定的蛋白也基本 為其他屬性的a 2-巨球蛋白，因此通過該實驗可基本確定，通過上述方法純化得到的蛋白 就是a 2-巨球蛋白。
[0050] 表2對圖4中g(shù)i號的翻譯結(jié)果
[0051]
[0052] 圖4的質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明條帶4即為通過本發(fā)明方法純化出的a 2-M〇按照例 2-例5方法分離純化a 2-M得到的色譜圖和質(zhì)譜鑒定結(jié)果與圖1-圖4無異，不再贅述。
[0053] 對比例1
[0054] 對比例1即為例6,具體操作為：將1000g Cohn組分IV沉淀溶解于10000ml蒸餾 水中，攪拌1小時后壓濾，得到濾液9500ml。在濾液中添加等體積100%飽和度的硫酸銨溶 液，攪拌1小時后4°C放置過夜。離心分離沉淀A與上清A，用5000ml 50%飽和度的硫酸銨 溶液溶解沉淀A，攪拌一小時離心，獲得沉淀B、上清B。將沉淀B溶解于4000ml 50%飽和 度的硫酸銨溶液中，離心得到沉淀C、上清C，將沉淀C溶解于3000ml蒸餾水中，按照243g/ L添加固體硫酸銨，使其飽和度達(dá)到40%，離心分離沉淀D、上清D。在上清D中按照97g/L 添加固體硫酸銨，使硫酸銨飽和度達(dá)到55%，溶液攪拌1小時后離心，將獲得的沉淀E溶解 于1000ml緩沖液中（0. 02M Tris、0. 15M NaCl、pH6. 0)，使用500kDa超濾膜進(jìn)行超濾以脫 鹽，將600ml截留液進(jìn)行鋅離子親和層析，上樣完成后繼續(xù)用緩沖液淋洗，淋洗至蛋白峰趨 于基線時換洗脫液（0. 1M Na2EDTA、pH6.8)洗脫，洗脫至蛋白峰降至基線時停止洗脫。收集 富含a 2-M的洗脫液約150ml。
[0055] 對比例2
[0056] 對比例2是參照彭啟明等人方法（人血漿a2_巨球蛋白的分離純化，生物化學(xué)與 生物物理進(jìn)展，1986, 3:69-72)，以人血漿為原料，先通過4% -12%聚乙二醇沉淀的方法處 理血漿，再依次采用鋅離子親和層析、藍(lán)色瓊脂糖親和層析、第二次鋅離子親和層析的方法 純化制備a 2-巨球蛋白。<