人腺病毒抗原表位嵌合蛋白及其制備、應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明人腺病毒抗原表位嵌合蛋白及其制備、應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析腺病毒3型、7型、11型、14型及55型六鄰體蛋白的氨基酸序列，分別篩選出含強(qiáng)抗原性的蛋白片段，片段之間用兩個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸進(jìn)行連接，形成一個(gè)多抗原片段串聯(lián)的嵌合蛋白，選擇原核偏愛(ài)的密碼子，將其翻譯成相應(yīng)的核酸序列，化學(xué)合成全長(zhǎng)基因?；蚬こ碳夹g(shù)表達(dá)純化得到該嵌合蛋白，嵌合蛋白全長(zhǎng)363個(gè)氨基酸。表達(dá)的嵌合蛋白可用于疫苗研究、HAdV抗體或抗原的檢測(cè)等，本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】
人腺病毒抗原表位嵌合蛋白及其制備、應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明人腺病毒抗原表位嵌合蛋白及其制備、應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診 斷試劑領(lǐng)域。本發(fā)明是將人腺病毒(HAdV) 3型、7型、11型、14型及55型特異性抗原表位蛋 白片段串聯(lián)，利用基因工程技術(shù)，制備含有五種型別腺病毒強(qiáng)抗原表位的嵌合蛋白。通過(guò)計(jì) 算機(jī)分析，從五種型別腺病毒六鄰體蛋白中篩選出含有強(qiáng)抗原表位的蛋白片段，蛋白片段 之間用兩個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸連接，串聯(lián)成一個(gè)多抗原表位嵌合蛋白。化學(xué)合成該嵌合 蛋白的基因序列，并利用基因工程技術(shù)表達(dá)該嵌合蛋白。表達(dá)的嵌合蛋白可用于HAdV抗體 或抗原的檢測(cè)，及疫苗的研制等。
【背景技術(shù)】
[0002] 人腺病毒，即HAdV(Human Adenovirus)，是一種在幼兒園、軍隊(duì)等高密度人群具有 高危害性的病毒。自2011年12月以來(lái)，我國(guó)不同地區(qū)先后發(fā)生多起經(jīng)呼吸道傳播的暴發(fā)傳 染病疫情，疫情波及面廣，傳染性強(qiáng)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)鑒定分別為B組55型、7型和14型腺 病毒。
[0003] 腺病毒主要引起呼吸道疾病，但也可感染消化道、泌尿道、眼部、心肌等部位而引 起疾病。通常認(rèn)為B1、C、E組腺病毒主要引起呼吸道疾病，而B2組主要引起泌尿系統(tǒng)感染。全 球多次報(bào)道由腺病毒引發(fā)的呼吸道疾病在新兵中暴發(fā)流行。
[0004] 腺病毒是一種無(wú)外殼的雙鏈DNA病毒，屬腺病毒科，基因組全長(zhǎng)34.7kb，衣殼呈規(guī) 則的20面體結(jié)構(gòu)，直徑80-100nm。核心由雙股DNA及蛋白質(zhì)組成，外有核殼，上有252個(gè)顆粒， 由240個(gè)六鄰體和12個(gè)五聯(lián)體組成。六鄰體上的表位是區(qū)別不同血清型的標(biāo)準(zhǔn)，是病毒對(duì)免 疫選擇壓力最敏感的部位。
[0005] 目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)腺病毒感染的方法一般有兩種。一是通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異 性檢測(cè)腺病毒核酸，該法較復(fù)雜，不易操作，且腺病毒分型較困難。二是利用酶聯(lián)免疫吸附 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清中的特異性IgM及IgG抗體。一般情況下，病毒感染時(shí)，人體免疫系統(tǒng)能夠激發(fā) 體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)并逐漸控制感染、清除病毒。感染早期出現(xiàn)病毒血癥時(shí)，從患者血 清和鼻、咽分泌物中可以檢測(cè)到病毒核酸。腺病毒感染后可誘發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異 性抗體。一般發(fā)病后1周，患者體內(nèi)的IgM開始產(chǎn)生，7-10天IgG開始產(chǎn)生，隨后逐漸升高。因 此可利用特異性抗原檢測(cè)血清中的特異性抗體。但目前一種抗原通常只能檢測(cè)一種型別的 腺病毒抗體，所以在檢測(cè)血清內(nèi)HAdV抗體時(shí)需要使用多種抗原來(lái)提高抗體檢測(cè)率，確診感 染類型，提高了檢測(cè)成本，并且仍存在一定的假陰性概率。研制多抗原表位基因重組抗原是 建立腺病毒特異抗體快速檢測(cè)試劑的發(fā)展方向，也是研制疫苗的發(fā)展方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是針對(duì)上述不足之處提供一種人腺病毒抗原表位嵌合蛋白，人腺病毒 (HAdV)外殼的六鄰體蛋白上具有多種表位，是病毒體對(duì)免疫選擇壓力最敏感的部位，誘導(dǎo) 機(jī)體產(chǎn)生多種特異性抗體，所以該蛋白是用作抗原研制人腺病毒(HAdV)抗體檢測(cè)試劑的理 想蛋白。
[0007] 通過(guò)計(jì)算機(jī)分析腺病毒六鄰體蛋白的氨基酸序列，分別篩選出五種型別腺病毒含 有強(qiáng)抗原表位的蛋白片段，蛋白片段之間用兩個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸連接，串聯(lián)成一個(gè)多 抗原表位嵌合蛋白?；瘜W(xué)合成該嵌合蛋白的基因序列，并利用基因工程技術(shù)表達(dá)該嵌合蛋 白。表達(dá)的嵌合蛋白可用于HAdV抗體或抗原的檢測(cè)，及疫苗的研制等。
[0008] 本發(fā)明是化學(xué)合成人腺病毒(HAdV)由腺病毒3型、7型、11型、14型及55型的抗原表 位嵌合蛋白的基因序列，利用基因工程技術(shù)，制備含有五種類型腺病毒抗原表位的嵌合蛋 白。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析人腺病毒3、7、11、14和55型六鄰體蛋白的氨基酸序列，分別篩選出含強(qiáng) 抗原表位的蛋白片段。腺病毒3型共篩選出四個(gè)蛋白片段，分別是第136~151位氨基酸，共 16個(gè)氨基酸;第164~187位氨基酸，共24個(gè)氨基酸;第265~284位氨基酸，共20個(gè)氨基酸;第 422~437位氨基酸，共16個(gè)氨基酸。腺病毒7型共篩選出四個(gè)蛋白片段，分別是第136~148 位氨基酸，共13個(gè)氨基酸;第161~181位氨基酸，共21個(gè)氨基酸;第258~276位氨基酸，共19 個(gè)氨基酸;第415~426位氨基酸，共12個(gè)氨基酸。腺病毒11型共兩個(gè)蛋白片段，分別是第136 ~160位氨基酸，共25個(gè)氨基酸;第174~186位氨基酸，共13個(gè)氨基酸。腺病毒14型共四個(gè)蛋 白片段，分別是第136~160位氨基酸，共25個(gè)氨基酸;第174~196位氨基酸，共23個(gè)氨基酸； 第268~286位氨基酸，共19個(gè)氨基酸；第415~450位氨基酸，共36個(gè)氨基酸。腺病毒55型共 兩個(gè)蛋白片段，分別是第136~158位氨基酸，共23個(gè)氨基酸;第172~184位氨基酸，共13個(gè) 氨基酸。蛋白片段之間用兩個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸連接，串聯(lián)成一個(gè)多抗原表位嵌合蛋白， 全長(zhǎng)363個(gè)氨基酸。選用原核生物偏愛(ài)的密碼子，將嵌合蛋白翻譯成相應(yīng)的核苷酸序列，化 學(xué)合成全長(zhǎng)基因序列。利用基因工程技術(shù)表達(dá)純化該嵌合蛋白。該嵌合蛋白可用于疫苗及 HAdV抗體或抗原的檢測(cè)，及用于免疫制備抗HAdV單抗和多抗等。
[0009] 人腺病毒(HAdV)嵌合蛋白及其制備、應(yīng)用是采取以下步驟實(shí)施的： 1.五種類型腺病毒抗原表位的篩選及嵌合蛋白基因片段的化學(xué)合成： 利用ANTHEWIN等軟件分析人腺病毒3型、7型、11型、14型和55型六鄰體蛋白的氨基酸序 列，分別篩選出各型別腺病毒六鄰體蛋白中具有強(qiáng)抗原性的蛋白片段。蛋白片段之間用兩 個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸連接，串聯(lián)成一個(gè)多抗原表位嵌合蛋白。選用原核生物偏愛(ài)的密碼 子，將嵌合蛋白翻譯成相應(yīng)的核苷酸序列。在嵌合蛋白基因片段的5'端增加了 Nde頂每切位 點(diǎn)（下畫線部分），在3'端增加了終止密碼子(TAA)和EcoRI酶切位點(diǎn)（下畫線部分）。使合成 的基因片段易于克隆至質(zhì)粒pET-28a( + )內(nèi)的Ndel和EcoRI酶切位點(diǎn)內(nèi)?；瘜W(xué)合成該嵌合蛋 白的全長(zhǎng)基因序列。
[0010] 篩選的腺病毒3型抗原表位氨基酸序列： 第136~151位aa: lie： thr Thr Mn Gly Asp Ala： ￥al thr Thr thr Thr Asn Thr 第164~187位aa: fls： lie Ilir Tbr Ite Ms, ：S ll:s:lila A：sp： Ljfs 第265~284位aa: Asp Gly Ar：g Ksp Ala ￥al Ala Gl^ Ala Leu Ala Pro Glti He ￥al Leu Tyr Thr Glu Asn 第422~437位aa: .lie Lys Val: Lys Asp Tlxr Asn Giy ；J Lys; :Asp Ala, :Asn 篩選的腺病毒7型抗原表位氨基酸序列： 第136~148位aa: lie ?al ffe Thr Gly G1b fep fen Ala Thr ffe Tyr ffe 第161~181位aa: Lys 5iu Lm Siu 11^ G-2：y Lys： He Xfe Ma &p； Am Ms tys 第258~276位aa: M3>： §X；f Ser Fro S：lu lie ￥al Lea Ijt' Tte 第415~426位aa: Thr Ala：：Trp^ Glu： Lys Asp Thr 篩選的腺病毒11型抗原表位氨基酸序列： 第136~160位aa: Ub m im Mu/mx- Tiir sir Siu 01^ His fd _T&r :T，爾爾.Tlir 第174~186位aa: Ly.s Glu Gly I-：e：u Pro ?al Gly t；e：u GIu ￥al Ser Asp GIu 篩選的腺病毒14型抗原表位氨基酸序列： 第136~160位aa: SIf S Slu GM, fcg §Ia Abcj S1f 1m km $Iu；：iys：: Ij-T liw 第174~196位aa: %ys Asp Gly Leu Pro lie Gly Leu Glu Val Pro Ala GIu Gly Asp Pro %ys Pro lie Tyr Ala. Asn： Lys 第268~286位aa: Asp Leu Arg Ser Gin Lys (31'ii Gly Leu Lys Pro Lys lie Val. Met T]^ Ala Glu Asn 第415~450位aa: He Gly ProAr.g Thr Asp Ser： Tyr Lys Glu lie： Gin： Leu；； Asn： Gly .Asp Lys Asp： Val ：As；n: Pro: Asn./Gly lie Ssr Glu Leu V Lys Gly Asn, Pro Phe. 篩選的腺病毒55型抗原表位氨基酸序列： 第136~158位aa: lie M；a 01^： Lys： fers. 61f Glu Sl^ tog. f hr t^r & 第172~184位aa: ?L^s： Glu ；Gly Leu： ：Pro I le：：.；Giy Leu 'L^s： Val Ser Asp .Glu； 腺病毒3型抗原表位氨基酸序列： lie Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Gin lie Gly Lys Asp lie Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro lie Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser lie Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn 腺病毒7型抗原表位氨基酸序列： lie Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Glu lie Gly Lys Asp lie Thr Ala Asp Asn Lys Pro lie Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser lie Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr 腺病毒11型抗原表位氨基酸序列： lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu 腺病毒14型抗原表位氨基酸序列： Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gin Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly Leu Pro lie Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro lie Tyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg Ser Gin Lys Gin Gly Leu Lys Pro Lys lie Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser lie Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu lie Gin Leu Asn Gly Asp Gin Ala Trp Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly lie Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe 腺病毒55型抗原表位氨基酸序列： lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro lie Gly Leu Lys Val Ser Asp Glu 嵌合蛋白氨基酸序列： lie Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Gin lie Gly Lys Asp lie Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro lie Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser lie Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn Gly Gly Ser lie Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Glu lie Gly Lys Asp lie Thr Ala Asp Asn Lys Pro lie Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser lie Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr Gly Gly Ser lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu Gly Gly Ser Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gin Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly Leu Pro lie Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro lie Tyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg Ser Gin Lys Gin Gly Leu Lys Pro Lys lie Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser lie Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu lie Gin Leu Asn Gly Asp Gin Ala Trp Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly lie Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe Gly Gly Ser lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro lie Gly Leu Lys Val Ser Asp Glu 化學(xué)合成的嵌合蛋白的DNA序列（1104bp)
2. 表達(dá)HAdV抗原表位嵌合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建： 提取質(zhì)粒pET_28a( + )(美國(guó)Novagen公司產(chǎn)品），用Ndel和EcoRI雙酶切，電泳后回收 酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)。用Ndel和EcoR I雙酶切化學(xué)合成的HAdV抗原表位嵌 合蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。取上述酶切后DNA片段，插入到載體pET-28a( + )內(nèi)的Ndel和EcoR I位點(diǎn)之間，表達(dá)含有五種類型腺病毒抗原表位的嵌合蛋白。 [0011] 3. 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定： 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(60yg/mL)LB平板，置37°C過(guò)夜。 次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和對(duì)照菌（質(zhì)粒pET-28a轉(zhuǎn)化菌），提取質(zhì)粒，用Ndel和EcoRI雙酶切 驗(yàn)證，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，切下1104bp的目的基因片段。同時(shí)，將含有該基因 片段的質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析，序列分析證實(shí)重組質(zhì)粒含有連接在一起的五種類型腺病毒 抗原表位基因片段，序列完全正確： ATT GTT ACG ACG AAC GGT GAT AAT GCT GTT ACG ACG ACG ACG AAT ACG GGC GGC TCC AAA GAA GGT CTG CAA ATC GGC AAA GAC ATC ACC ACG ACC GAA GGC GAA GAA AAA CCG ATC TAC GCA GAT AAA GGC GGT AGT GAT GGT CGC GAT GCA GTT GCT GGT GCC CTG GCA CCG GAA ATT GTC CTG TAT ACC GAA AAC GGC GGT AGC ATC AAA GTT AAA ACC GAT GAC ACG AAC GGC TGG GAA AAA GAT GCG AAT GGC GGT AGC ATC GTC ACG ACC GGT GAA GAC AAC GCC ACG ACC TAT ACC GGC GGT TCT AAA GAA GGC CTG GAA ATT GGT AAA GAT ATC ACC GCA GAC AAT AAA CCG ATT TAC GCT GAT AAA GGC GGT AGC GAC GGT CGT GAA GCG GCC GAT GCG TTT TCT CCG GAA ATT GTG CTG TAT ACC GAA AAT GGC GGT TCA ATC AAA CCG CGC GAT ACC GCA TGG GAA AAA GAC ACG GGC GGT TCG ATT GCT GAA GGC GTG AAA AAC ACG ACC GGT GAA GAA CAT GTT ACC GAA GAA GAA ACG AAT ACG ACC ACG TAC ACC GGC GGT TCT AAA GAA GGC TTA CCG GTG GGT CTG GAA GTT AGT GAT GAA GGC GGT TCC CTG GAC AAA GGC GTT GAA ACC ACG GAA GAA CGT CAG AAC GAA GAT GGT GAA AAT GAC GAA AAA GCC ACC TAT ACG GGC GGT AGC AAA GAT GGT CTG CCG ATT GGC CTG GAA GTG CCG GCC GAA GGC GAT CCG AAA CCG ATT TAT GCC AAC AAA GGC GGT AGC GAT CTG CGT TCT CAG AAA CAA GGT CTG AAA CCG AAA ATT GTT ATG TAT GCA GAA AAC GGC GGT TCA ATC GGC CCG CGC ACC GAT TCG TAC AAA GAA ATT CAG CTG AAT GGT GAT CAA GCT TGG AAA GAC GTC AAC CCG AAT GGC ATC AGT GAA CTG GTG AAA GGT AAC CCG TTC GGC GGT TCC ATT GCC GAA GGC GTC AAA AAT GGT GAA GAA CGC GTG ACC GAA GAA GAA AAC AAT ACG ACG ACG TAC ACG GGC GGT AGC AAA GAA GGT CTG CCG ATT GGT CTG AAA GTC TCC GAT GAA TAA 構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)含有五種類型腺病毒抗原表位的嵌合蛋白，全長(zhǎng)363個(gè)氨基酸，在 其N端為腺病毒3型抗原表位蛋白片段，依次串聯(lián)7型、11型、14型抗原表位蛋白片段，C端為 腺病毒55型抗原表位蛋白片段，各片段長(zhǎng)度依次為3型長(zhǎng)85個(gè)氨基酸，7型長(zhǎng)74個(gè)氨基酸，11 型長(zhǎng)41個(gè)氨基酸，14型長(zhǎng)112個(gè)氨基酸，55型長(zhǎng)39個(gè)氨基酸，片段之間由兩個(gè)甘氨酸和一個(gè) 絲氨酸連接，其氨基酸序列如下： lie Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Gin lie Gly Lys Asp lie Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro lie Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser lie Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn Gly Gly Ser lie Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Glu lie Gly Lys Asp lie Thr Ala Asp Asn Lys Pro lie Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser lie Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr Gly Gly Ser lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Ser Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu Gly Gly Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gin Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly Leu Pro lie Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro lie Tyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg Ser Gin Lys Gin Gly Leu Lys Pro Lys lie Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser lie Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu lie Gin Leu Asn Gly Asp Gin Ala Trp Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly lie Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe Gly Gly Ser lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro lie Gly Leu Lys Val Ser Asp Glu 4. 表達(dá)融合蛋白工程菌的篩選鑒定： 將含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接種至含3mL LB培養(yǎng)基(含卡那毒素60iig/mL)的試管 內(nèi)，37°C振蕩培養(yǎng)3h，加IPTG至終濃度0.5mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)6h，離心收集菌體進(jìn) 行SDS-PAGE檢測(cè)，重組子表達(dá)相對(duì)分子量為55 kD的HAdV嵌合蛋白，而對(duì)照菌BL21(DE3)無(wú) 此蛋白帶。
[0012] 5. 腺病毒抗原表位嵌合蛋白的純化： 1)腺病毒抗原表位嵌合蛋白工程菌的超聲裂解 將誘導(dǎo)表達(dá)嵌合蛋白的工程菌離心(8000 rpm、10 min、4°C)收菌，菌體重懸于原培養(yǎng) 液1/10體積的細(xì)菌裂解液(20 mmol/L PB pH7.4、5%甘油）內(nèi)，冰浴超聲破菌，離心收集上 清。
[0013] 2)腺病毒抗原表位嵌合蛋白的硫酸胺分級(jí)沉淀 精確量出上清體積，向上清內(nèi)加入適量飽和硫酸胺溶液，邊加邊攪拌，使硫酸胺的終濃 度為25%，置冰浴內(nèi)過(guò)夜。離心收集上清，加入適量固體硫酸胺粉末，邊加邊攪拌，使硫酸胺 的終濃度為50 %，置冰浴內(nèi)過(guò)夜。次日離心收集沉淀。用200mL平衡液（50mM Tris-HCl，pH 7.5)懸浮沉淀，裝入透析袋內(nèi)，對(duì)1 OOOrnL平衡液透析過(guò)夜，換液4次。離心收集上清，直接上 DEAE-Separose FF陰離子柱純化。
[0014] 3)DEAE_Separose FF陰離子柱純化 用平衡液(50Mm Tris-HCl，pH 7.5)沖洗平衡DEAE-S印arose FF陰離子柱，然后將上步 透析好的上清直接上柱，流速約100 mL/h。上樣結(jié)束后用平衡液充分洗柱，再依次用含100、 200、300、400、500、1000 mmol/L NaCl的平衡液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，用12% SDS - PAGE電泳檢測(cè)各峰蛋白，確定哪個(gè)洗脫峰含表達(dá)的腺病毒抗原表位嵌合蛋白。300 mmol/L NaCl洗脫蛋白峰即為腺病毒抗原表位嵌合蛋白。
[0015] 6. 將表達(dá)的腺病毒抗原表位嵌合蛋白，用于疫苗、HAdV抗體或抗原的檢測(cè)及用于免疫 制備抗HAdV單抗和多抗等。
[0016] 7. 將五種型別腺病毒六鄰體蛋白的強(qiáng)抗原性蛋白片段連接，以融合蛋白的形式進(jìn)行表 達(dá)、制備。
[0017] 8. 通過(guò)基因重組技術(shù)，利用酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物進(jìn)行重 組表達(dá)、制備腺病毒抗原表位嵌合蛋白。
[0018] 英文縮寫說(shuō)明：HAdV(Human adenovirus):人腺病毒；EDTA:四甲基乙二胺；IPTG:異 丙基硫代半乳糖苷；DTT:二硫蘇糖醇；SDS:十二烷基磺酸納;PAGE:聚丙烯酰胺凝膠電 泳；PB:磷酸鹽緩沖液；kD:千道爾頓。
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn) 我們表達(dá)的腺病毒抗原表位嵌合蛋白，有較多優(yōu)點(diǎn)： 1.將五種型別腺病毒抗原表位蛋白片段融合表達(dá)，比分別使用單獨(dú)的蛋白片段更方 便、經(jīng)濟(jì)。用嵌合蛋白作抗原檢測(cè)抗HAdV抗體時(shí)，不再需要分別制備這些蛋白片段，也不需 要調(diào)整這些抗原的使用比例，因此應(yīng)用方便且成本較低。
[0020] 2.目前所用的腺病毒疫苗主要是滅活疫苗及減毒活疫苗，但腺病毒對(duì)動(dòng)物有致癌 性，危險(xiǎn)大，因此開發(fā)新型不含DNA的核殼成分疫苗顯得迫在眉睫。我們利用基因工程技術(shù) 表達(dá)制備含有多種腺病毒六鄰體抗原表位的嵌合蛋白，為研制基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)?；?因工程疫苗具有安全、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
[0021 ] 3 .表達(dá)的含有五種類型腺病毒抗原表位的嵌合蛋白以可溶性形式存在，易于純 化，且不需要復(fù)性處理。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明： 圖1是分子生物學(xué)軟件對(duì)腺病毒3型六鄰體蛋白抗原表位進(jìn)行分析的結(jié)果。結(jié)果顯示， 在腺病毒3型六鄰體蛋白N端含有4個(gè)強(qiáng)的親水性抗原表位：136~151aa、164~187aa、265~ 284aa、422~437aa，即圖內(nèi)箭頭標(biāo)示的位置。
[0023] 圖2是分子生物學(xué)軟件對(duì)腺病毒7型六鄰體蛋白抗原表位進(jìn)行分析的結(jié)果。結(jié)果顯 示，在腺病毒7型六鄰體蛋白N端含有4個(gè)強(qiáng)的親水性抗原表位：136~148aa、161~181aa， 258~276aa、415~426aa，即圖內(nèi)箭頭標(biāo)示的位置。
[0024]圖3是分子生物學(xué)軟件對(duì)腺病毒11型六鄰體蛋白抗原表位進(jìn)行分析的結(jié)果。結(jié)果 顯示，在腺病毒11型六鄰體蛋白N端含有2個(gè)強(qiáng)的親水性抗原表位：136~160aa、174~ 186aa，即圖內(nèi)箭頭標(biāo)示的位置。
[0025] 圖4是分子生物學(xué)軟件對(duì)腺病毒14型六鄰體蛋白抗原表位進(jìn)行分析的結(jié)果。結(jié)果 顯示，在腺病毒14型六鄰體蛋白N端含有4個(gè)強(qiáng)的親水性抗原表位：136~160aa、174~ 196aa、268~286aa、415~450aa，即圖內(nèi)箭頭標(biāo)示的位置。
[0026] 圖5是分子生物學(xué)軟件對(duì)腺病毒55型六鄰體蛋白抗原表位進(jìn)行分析的結(jié)果。結(jié)果 顯示，在腺病毒3型六鄰體蛋白N端含有2個(gè)強(qiáng)的親水性抗原表位：136~158aa、172~184aa， 即圖內(nèi)箭頭標(biāo)示的位置。
[0027] 圖6是表達(dá)五種型別腺病毒抗原表位嵌合蛋白的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。
[0028]圖7是表達(dá)腺病毒抗原表位嵌合蛋白重組菌的SDS-PAGE分析結(jié)果。將構(gòu)建的重組 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，挑單菌落后篩選高產(chǎn)菌株的SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白marker;陰： 含pET-28a(+)質(zhì)粒的陰性對(duì)照菌；1-5:腺病毒抗原表位嵌合蛋白重組菌，五個(gè)重組子均表 達(dá)相對(duì)分子量為55kDa的嵌合蛋白，即圖中箭頭標(biāo)示的位置。
[0029]圖8是表達(dá)腺病毒抗原表位嵌合蛋白純化后的SDS-PAGE分析結(jié)果。M:蛋白Marker; 1:純化后的腺病毒抗原表位嵌合蛋白，濃度為0.5mg/mL，相對(duì)分子量55kDa ; 2 :濃度為 0.5mg/mL的 BSA。
[0030]
【具體實(shí)施方式】
[0031]本發(fā)明實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明： 腺病毒六鄰體蛋白抗原表位的分析、基因合成及表達(dá) 通過(guò)計(jì)算機(jī)分析腺病毒3型、7型、11型、14型及55型六鄰體蛋白的氨基酸序列，分別篩 選出其中具有強(qiáng)抗原性的蛋白片段。腺病毒3型共篩選出四個(gè)蛋白片段，腺病毒7型共篩選 出四個(gè)蛋白片段，腺病毒11型共兩個(gè)蛋白片段，腺病毒14型共四個(gè)蛋白片段，腺病毒55型共 兩個(gè)蛋白片段。蛋白片段之間用兩個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸連接，串聯(lián)成一個(gè)多抗原表位嵌 合蛋白。選用原核生物偏愛(ài)的密碼子，將嵌合蛋白翻譯成相應(yīng)的核苷酸序列?；瘜W(xué)合成該嵌 合蛋白的全長(zhǎng)基因序列，并將其克隆至質(zhì)粒pET-28a( + )內(nèi)的Ndel/EcoRI位點(diǎn)，表達(dá)腺病毒 抗原表位嵌合蛋白。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，篩選獲得了高效表達(dá)腺病毒抗原 表位嵌合蛋白的工程菌，表達(dá)的HAdV嵌合蛋白占菌體蛋白總量的60%。
[0032] 材料與方法 1.菌種與質(zhì)粒:宿主菌BL21 (DE3)及表達(dá)載體pET-28a (+)為美國(guó)Novagen公司產(chǎn)品。 [0033] 2.分子生物學(xué)試劑：限制性內(nèi)切酶NdeI、EcoRI、及T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn) 品。質(zhì)粒純化試劑盒及從瓊脂糖凝膠內(nèi)回收DNA片段的試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。DTT及 IPTG為TaKaRa公司產(chǎn)品。其它試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br>[0034] 3.基因片段的合成：由大連TaKaRa公司幫助合成。
[0035] 4.基因克隆方法:DNA的酶切、連接、電泳;質(zhì)粒的提取、轉(zhuǎn)化；蛋白的SDS-PAGE分 析等一般分子克隆方法按常規(guī)方法進(jìn)行。其它試劑盒按說(shuō)明書進(jìn)行操作。
[0036] 5. DNA序列分析:用TaKaRa公司質(zhì)粒純化試劑盒純化質(zhì)粒，用DNA全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè) 序。
[0037] 結(jié)果 l.HAdV六鄰體蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成： 利用ANTHEWIN等軟件，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析腺病毒3型、7型、11型、14型及55型六鄰體蛋白 的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)均有多個(gè)片段含有較強(qiáng)的抗原決定簇。腺病毒3型共篩選出四個(gè)蛋白片 段（圖1)，分別是第136~151位aa，共16個(gè)氨基酸;第164~187位氨基酸，共24個(gè)氨基酸;第 265~284位氨基酸，共20個(gè)氨基酸;第422~437位氨基酸，共16個(gè)氨基酸。腺病毒7型共篩選 出四個(gè)蛋白片段(圖2)，分別是第136~148位氨基酸，共13個(gè)氨基酸;第161~181位氨基酸， 共21個(gè)氨基酸;第258~276位氨基酸，共19個(gè)氨基酸;第415~426位氨基酸，共12個(gè)氨基酸。 腺病毒11型共兩個(gè)蛋白片段（圖3)，分別是第136~160位氨基酸，共25個(gè)氨基酸;第174~ 186位氨基酸，共13個(gè)氨基酸。腺病毒14型共四個(gè)蛋白片段(圖4)，分別是第136~160位氨基 酸，共25個(gè)氨基酸;第174~196位氨基酸，共23個(gè)氨基酸;第268~286位氨基酸，共19個(gè)氨基 酸;第415~450位氨基酸，共36個(gè)氨基酸。腺病毒55型共兩個(gè)蛋白片段（圖5)，分別是第136 ~158位氨基酸，共23個(gè)氨基酸;第172~184位氨基酸，共13個(gè)氨基酸。蛋白片段之間用兩個(gè) 甘氨酸和一個(gè)絲氨酸連接，串聯(lián)成一個(gè)多抗原表位嵌合蛋白。選用原核生物偏愛(ài)的密碼子， 將嵌合蛋白翻譯成相應(yīng)的核苷酸序列。在嵌合蛋白基因序列的5'端增加了 Nde頂每切位點(diǎn)， 在3'端增加了終止密碼子(TAA)和EcoR頂每切位點(diǎn)。化學(xué)合成該嵌合蛋白的全長(zhǎng)基因序列。
[0038] 篩選的腺病毒3型抗原表位氨基酸序列： 第136~151位aa: lie Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr 第164~187位aa: Lys Glu Gly Leu Gin lie Gly Lys Asp lie Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro lie Tyr Ala Asp Lys 第265~284位aa: Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn 第422~437位aa: lie Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn 篩選的腺病毒7型抗原表位氨基酸序列： 第136~148位aa: lie Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr 第161~181位aa: Lys Glu Gly Leu Glu lie Gly Lys Asp lie Thr Ala Asp Asn Lys Pro lie Tyr AlaAsp Lys 第258~276位aa: Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn 第415~426位aa: lie Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr 篩選的腺病毒11型抗原表位氨基酸序列： 第136~160位aa: lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr 第174~186位aa: Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu 篩選的腺病毒14型抗原表位氨基酸序列： 第136~160位aa: Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gin Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr 第174~196位aa: Lys Asp Gly Leu Pro lie Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro lie Tyr Ala Asn Lys 第268~286位aa: Asp Leu Arg Ser Gin Lys Gin Gly Leu Lys Pro Lys lie Val Met Tyr Ala Glu Asn 第415~450位aa: lie Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu lie Gin Leu Asn Gly Asp Gin Ala Trp Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly lie Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe 篩選的腺病毒55型抗原表位氨基酸序列： 第136~158位aa: lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr 第172~184位aa: Lys Glu Gly Leu Pro lie Gly Leu Lys Val Ser Asp Glu 腺病毒3型抗原表位氨基酸序列： lie Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Gin lie Gly Lys Asp lie Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro lie Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser lie Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn 腺病毒7型抗原表位氨基酸序列： lie Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Glu lie Gly Lys Asp lie Thr Ala Asp Asn Lys Pro lie Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser lie Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr 腺病毒11型抗原表位氨基酸序列： lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu 腺病毒14型抗原表位氨基酸序列： Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gin Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly Leu Pro lie Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro lie Tyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg Ser Gin Lys Gin Gly Leu Lys Pro Lys lie Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser lie Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu lie Gin Leu Asn Gly Asp Gin Ala Trp Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly lie Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe 腺病毒55型抗原表位氨基酸序列： lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro lie Gly Leu Lys Val Ser Asp Glu 嵌合蛋白氨基酸序列： lie Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Gly Gly Ser Pro Lys Glu Gly Leu Gin lie Gly Lys Asp lie Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys lie Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser lie Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn Gly Gly Ser lie Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Glu lie Gly Lys Asp lie Thr Ala Asp Asn Lys Pro lie Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser lie Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr Gly Gly Ser lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu Gly Gly Ser Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gin Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly Leu Pro lie Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro lie Tyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg Ser Gin Lys Gin Gly Leu Lys Pro Lys lie Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser lie Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu lie Gin Leu Asn Gly Asp Gin Ala Trp Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly lie Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe Gly Gly Ser lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro lie Gly Leu Lys Val Ser Asp Glu 化學(xué)合成的嵌合蛋白的DNA序列（1104bp)
2. HAdV抗原表位嵌合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建： 提取質(zhì)粒pET28a( + )(美國(guó)Novagen公司產(chǎn)品），用Ndel和EcoRI雙酶切，電泳后回收酶 切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)。用Ndel和EcoR I雙酶切化學(xué)合成的HAdV抗原表位嵌合 蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。取上述酶切后DNA片段，插入到載體pET28a (+ )內(nèi)的NdeI和EcoR I位點(diǎn)之間，表達(dá)含有五種型別腺病毒抗原表位的嵌合蛋白。構(gòu)建流 程見(jiàn)圖6。
[0039] 3. 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定： 將上步連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含卡那霉素(60yg/ mL)LB平板，置37°C過(guò)夜。次日隨機(jī)挑選5個(gè)轉(zhuǎn)化子菌落，分別接種到含4 mL液體LB培養(yǎng)基 (含卡那霉素60yg/mL)的試管內(nèi)，置37 °C振蕩培養(yǎng)6h，取菌液lmL，離心收菌。分別用50yL去 離子水懸浮菌體，沸水煮5min,離心(4°C，12000rpm )5min,取上清（內(nèi)有質(zhì)粒）lyL用作PCR 模板，用嵌合蛋白基因片段5'端的引物(5'_ CATATGAITGTTACGACGAACGGTGATAAT-3'）和3' 端的引物（5'_ GAAITCTTAIT CATCGGAGACTTT-3 '）組成引物對(duì)，PCR擴(kuò)增含嵌合蛋白基因片段的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，應(yīng)擴(kuò) 增出長(zhǎng)1104bp的基因片段。PCR反應(yīng)濃度為：質(zhì)粒模板1此、上下游引物各lyL、10x Buffer 5.0yL、2.5 mmol/L dNTP 4.0yL、Taq DNA 聚合酶0.5yL (2.5 U)、去離子水37.5yL,總體 積50yL。擴(kuò)增條件為：94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 60秒，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7分鐘。 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5yL，用1.2 %的Agarose凝膠檢測(cè)，結(jié)果，8個(gè)轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出1104bp的目的 基因片段。證實(shí)，均含有五種型別腺病毒抗原表位基因片段的串聯(lián)基因。
[0040] 提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒內(nèi)的五種型別腺病毒抗原表位基因片段的串聯(lián)基因 序列，DNA序列分析證實(shí)，重組質(zhì)粒含有五種型別腺病毒抗原表位基因片段，序列完全正確：
構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)含有五種型別腺病毒抗原表位的嵌合蛋白，全長(zhǎng)363個(gè)氨基酸，在 其N端為腺病毒3型抗原表位蛋白片段，依次串聯(lián)7型、11型、14型抗原表位蛋白片段，C端為 腺病毒55型抗原表位蛋白片段，各片段長(zhǎng)度依次為3型長(zhǎng)85個(gè)氨基酸，7型長(zhǎng)74個(gè)氨基酸，11 型長(zhǎng)41個(gè)氨基酸，14型長(zhǎng)112個(gè)氨基酸，55型長(zhǎng)39個(gè)氨基酸，片段之間由兩個(gè)甘氨酸和一個(gè) 絲氨酸連接，其氨基酸序列如下： lie Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Gin lie Gly Lys Asp lie Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro lie Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser lie Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn Gly Gly Ser lie Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Glu lie Gly Lys Asp lie Thr Ala Asp Asn Lys Pro lie Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu lie Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser lie Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr Gly Gly Ser lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu Gly Gly Ser Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gin Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly Leu Pro lie Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro lie Tyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg Ser Gin Lys Gin Gly Leu Lys Pro Lys lie Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser lie Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu lie Gin Leu Asn Gly Asp Gin Ala Trp Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly lie Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe Gly Gly Ser lie Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro lie Gly Leu Lys Val Ser Asp Glu 4.表達(dá)融合蛋白工程菌的篩選鑒定： 將上述轉(zhuǎn)化子接種至含3mL LB培養(yǎng)基(含卡那毒素60yg/mL)的試管內(nèi)，37°C振蕩培養(yǎng) 3h，加IPTG至終濃度0.5mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)6h，離心收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，5 個(gè)轉(zhuǎn)化子表達(dá)相對(duì)分子量為55 kD的腺病毒抗原表位嵌合蛋白（圖7)。
[0041] 腺病毒抗原表位嵌合蛋白的純化 根據(jù)腺病毒抗原表位嵌合蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，確定適當(dāng)?shù)募兓椒ā?經(jīng)計(jì)算機(jī)分析，腺病毒抗原表位嵌合蛋白的等電點(diǎn)為PH4.365，因此我們決定在pH為7.5的 50Mm Tris-HCl緩沖液內(nèi)，用DEAE-Separose FF陰離子柱純化。具體步驟如下： 材料和方法 1.主要試劑： DEAE-Separose FF陰離子凝膠為Pharmacia公司產(chǎn)品，IPTG、DTT為TaTaRa公司產(chǎn)品。其 它試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?br>[0042] 2.腺病毒抗原表位嵌合蛋白工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及超聲裂解 從接種有1號(hào)工程菌的LB平板上，用牙簽挑單菌落，接種到含200mL LB液體培養(yǎng)基的三 角燒瓶?jī)?nèi)，加卡那霉素至終濃度60yg/mL，置37°C搖床內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。次日，將菌液接種到4個(gè) 分別含200mL LB液體培養(yǎng)基的三角燒瓶，每瓶接種菌液50mL，置37°C搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)1小 時(shí)，然后加IPTG至終濃度0. lmmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)。
[0043] 將誘導(dǎo)表達(dá)嵌合蛋白的1000mL工程菌離心（8000 rpm、30 min、4°C)收菌，菌體重 懸于 100mL的細(xì)菌裂解液（20 mmol/L PB pH7.4、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘油） 內(nèi)，冰浴超聲破菌10 min，離心(8000 rpm、30 min、4°C)收集上清。
[0044] 3.腺病毒抗原表位嵌合蛋白的硫酸胺分級(jí)沉淀 精確量出上清體積，向上清內(nèi)加入適量飽和硫酸胺溶液，邊加邊攪拌，使硫酸胺的終濃 度為25 %，置冰浴內(nèi)過(guò)夜。次日離心（12000 rpm、20 min、4°C)收集上清，加入適量固體硫酸 胺粉末，邊加邊攪拌，使硫酸胺的終濃度為50 %，置冰浴內(nèi)過(guò)夜。次日離心（12000 rpm、20 min、4 °C)收集沉淀。用200mL平衡液(50mM Tri s-HCl，pH 7.5)懸浮沉淀，裝入透析袋內(nèi)，對(duì) 1 OOOrnL平衡液透析過(guò)夜，換液4次。離心（12000 rpm、20 min、4°C )收集上清，直接上DEAE-Separose FF陰離子柱純化。
[0045] 4.DEAE_Separose FF陰離子柱純化 用平衡液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)沖洗平衡DEAE-S印arose FF陰離子柱，然后將上步 透析好的上清直接上柱，上樣流速100 mL/h。上樣結(jié)束后用平衡液充分洗柱，再依次用含 100、200、300、400、500、1000 mmol/L NaCl的溶液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，用12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)各峰蛋白，確定哪個(gè)洗脫峰含表達(dá)的腺病毒抗原表位嵌合蛋白。
[0046] 結(jié)果 將不同濃度NaCl從DEAE-S印arose FF柱上洗脫的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，由電泳結(jié)果 可知，腺病毒抗原表位嵌合蛋白存在于300 mmol/L NaCl洗脫蛋白峰中。
[0047] 將300 mmol/L NaCl洗脫蛋白峰通過(guò)透析濃縮處理，SDS-PAGE測(cè)定嵌合蛋白濃度， 可知純化所得的嵌合蛋白濃度為0.5mg/mL(圖8)。
[0048] 腺病毒抗原表位嵌合蛋白的鑒定及應(yīng)用 將純化的腺病毒抗原表位嵌合蛋白用作免疫原，免疫BALB/c小鼠，制備抗血清。通過(guò)間 接ELISA實(shí)驗(yàn)方法，利用五種型別腺病毒抗原表位蛋白對(duì)嵌合蛋白抗血清進(jìn)行檢測(cè)，以鑒定 腺病毒抗原表位嵌合蛋白的免疫原性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該嵌合蛋白具有很好的免疫原性，可 用作腺病毒疫苗的研究。
[0049] 材料和方法 1.腺病毒3型、7型、11型、14型和55型的抗原表位蛋白：由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。
[0050] 2.酶聯(lián)反應(yīng)材料:酶聯(lián)板為深圳產(chǎn)96孔板，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG購(gòu)自Sigma公司。其它材料為酶聯(lián)反應(yīng)的常規(guī)材料。
[0051] 3.嵌合蛋白抗血清制備:將嵌合蛋白與弗氏完全佐劑等體積充分混合乳化后，腹 腔注射免疫小鼠。之后每隔兩周，將嵌合蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化后，進(jìn)行加 強(qiáng)免疫。共免疫4次。第4次免疫后兩周，眼眶取血，制備抗血清。
[0052] 4.嵌合蛋白免疫原性檢測(cè)：采用間接ELISA法對(duì)嵌合蛋白免疫原性進(jìn)行檢測(cè)?；?本步驟為：用CBS緩沖液(pH9.6)分別稀釋五種型別腺病毒抗原表位蛋白至終濃度為2yg/ mL，包被96孔酶標(biāo)板，每孔lOOyL，4°C孵育過(guò)夜;之后用1%。PBST充分洗板5次，10%的小牛血 清(FBS)作為封閉液，每孔加150yL，37°C封閉2h; 1 %。PBST充分洗板5次，嵌合蛋白抗血清 按如下比例梯度稀釋(稀釋液為10%的小牛血清）1:10000，1:20000，1:40000，1:80000，1: 160000，1:320000，1:640000，1:1280000，100yL/孔，37°C孵育2h，陰性血清按 1:10000稀釋 作為對(duì)照；1%。TOST充分洗板5次;加1:5000稀釋(稀釋液為10%的小牛血清）的羊抗鼠IgG， 100yL/孔，37°C孵育lh;l% Q PBST充分洗板5次，加入TMB顯色液，50yL /孔，37°C，避光反應(yīng) lOmin;加入lmol/L的HC1，50yL/孔，終止反應(yīng);酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A45Q值，若P/N>2.1，即可判 定結(jié)果陽(yáng)性。
[0053] 結(jié)果 1.間接ELISA法檢測(cè)腺病毒抗原表位嵌合蛋白免疫原性 將純化的腺病毒3型、7型、11型、14型和55型抗原表位蛋白用CBS緩沖液稀釋包被酶標(biāo) 板，檢測(cè)用腺病毒抗原表位嵌合蛋白免疫小鼠得到的抗血清。結(jié)果顯示，腺病毒3型蛋白檢 測(cè)嵌合蛋白血清抗體效價(jià)為1: 320000;腺病毒7型蛋白檢測(cè)嵌合蛋白血清抗體效價(jià)為1: 640000;腺病毒11型蛋白檢測(cè)嵌合蛋白血清抗體效價(jià)為1:640000;腺病毒14型蛋白檢測(cè)嵌 合蛋白血清抗體效價(jià)為1:1280000 ;腺病毒55型蛋白檢測(cè)嵌合蛋白血清抗體效價(jià)為1: 640000。說(shuō)明腺病毒抗原表位嵌合蛋白免疫機(jī)體后，能夠有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)各型別 腺病毒抗原表位的抗體，具有較好的免疫原性，為進(jìn)一步研制腺病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。
[0054] 人腺病毒(HAdV)抗原表位嵌合蛋白序列表見(jiàn)附件文檔:核苷酸或氨基酸序列表計(jì)算機(jī) 可讀載體。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種人腺病毒抗原表位嵌合蛋白，由腺病毒3型、7型、11型、14型及55型抗原表位蛋 白片段連接而成，蛋白片段之間用甘氨酸和絲氨酸連接，嵌合蛋白全長(zhǎng)363個(gè)氨基酸，氨基 酸序列如下：3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白，其特征在于：來(lái)源于腺病毒3型 的抗原表位蛋白片段共4個(gè)，具體為第136位氨基酸至第151位氨基酸、第164位氨基酸至第 187位氨基酸、第265位氨基酸至第284位氨基酸、第422位氨基酸至第437位氨基酸，各蛋白 片段氨基酸序列如下： 第136~151位aa:4個(gè)蛋白片段之間用甘氨酸和絲氨酸連接，連接成新的重組蛋白片段，氨基酸序列如 下：4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白，其特征在于：來(lái)源于腺病毒7型 的抗原表位蛋白片段共4個(gè)，具體為第136位氨基酸至第148位氨基酸、第161位氨基酸至第 181位氨基酸、第258位氨基酸至第276位氨基酸、第415位氨基酸至第426位氨基酸，各蛋白 片段氨基酸序列如下：4個(gè)蛋白片段之間用甘氨酸和絲氨酸連接，連接成新的重組蛋白片段，氨基酸序列如 下：5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白，來(lái)源于腺病毒11型的抗原表位 蛋白片段共2段，具體為第136位氨基酸至第160位氨基酸、第174位氨基酸至第186位氨基 酸，各蛋白片段氨基酸序列如下：2個(gè)蛋白片段之間用甘氨酸和絲氨酸連接，連接成新的重組蛋白片段，氨基酸序列如 下：6. 權(quán)利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白，其特征在于:來(lái)源于腺病毒14型的抗 原表位蛋白片段共4個(gè)，具體為第136位氨基酸至第160位氨基酸、第174位氨基酸至第196位 氨基酸、第268位氨基酸至第286位氨基酸、第415位氨基酸至第450位氨基酸，各蛋白片段氨 基酸序列如下：4個(gè)蛋白片段之間用甘氨酸和絲氨酸連接，連接成新的重組蛋白片段，氨基酸序列如 下：7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白，其特征在于:來(lái)源于腺病毒55型 的抗原表位蛋白片段共2個(gè)，具體為第136位氨基酸至第158位氨基酸、第172位氨基酸至第 184位氨基酸，各蛋白片段氨基酸序列如下：2個(gè)蛋白片段之間用甘氨酸和絲氨酸連接，連接成新的重組蛋白片段，氨基酸序列如 下：8.權(quán)利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白，利用基因工程技術(shù)表達(dá)、制備該蛋 白，具體方法如下： 腺病毒抗原表位蛋白片段的篩選： 利用ANTHEWIN等軟件，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析腺病毒3型、7型、11型、14型及55型六鄰體蛋白 的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)均有多個(gè)片段含有較強(qiáng)的抗原決定簇，腺病毒3型共篩選出四個(gè)蛋白片 段，分別是第136位氨基酸至第151位氨基酸，共16個(gè)氨基酸;第164位氨基酸至第187位氨基 酸，共24個(gè)氨基酸；第265位氨基酸至第284位氨基酸，共20個(gè)氨基酸；第422位氨基酸至第 437位氨基酸，共16個(gè)氨基酸，腺病毒7型共篩選出四個(gè)蛋白片段，分別是第136位氨基酸至 第148位氨基酸，共13個(gè)氨基酸;第161位氨基酸至第181位氨基酸，共21個(gè)氨基酸;第258位 氨基酸至第276位氨基酸，共19個(gè)氨基酸;第415位氨基酸至第426位氨基酸，共12個(gè)氨基酸， 腺病毒11型共兩個(gè)蛋白片段，分別是第136位氨基酸至第160位氨基酸，共25個(gè)氨基酸;第 174位氨基酸至第186位氨基酸，共13個(gè)氨基酸，腺病毒14型共四個(gè)蛋白片段，分別是第136 位氨基酸至第160位氨基酸，共25個(gè)氨基酸;第174位氨基酸至第196位氨基酸，共23個(gè)氨基 酸;第268位氨基酸至第286位氨基酸，共19個(gè)氨基酸;第415位氨基酸至第450位氨基酸，共 36個(gè)氨基酸，腺病毒55型共兩個(gè)蛋白片段，分別是第136位氨基酸至第158位氨基酸，共23個(gè) 氨基酸;第172位氨基酸至第184位氨基酸，共13個(gè)氨基酸，蛋白片段之間用兩個(gè)甘氨酸和一 個(gè)絲氨酸連接，串聯(lián)成一個(gè)多抗原表位嵌合蛋白，選用原核生物偏愛(ài)的密碼子，將嵌合蛋白 翻譯成相應(yīng)的核苷酸序列，在嵌合蛋白基因序列的5'端增加了Nde頂每切位點(diǎn)，在3'端增加 了終止密碼子(TAA)和EcoR頂每切位點(diǎn)，化學(xué)合成該嵌合蛋白的全長(zhǎng)基因序列； 篩選的腺病毒3型抗原表位氨基酸序列：HAdV抗原表位嵌合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建： 提取質(zhì)粒pET_28a( + )(美國(guó)Novagen公司產(chǎn)品），用Ndel和EcoRI雙酶切，電泳后回收 酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)，用Ndel和EcoRI雙酶切化學(xué)合成的HAdV抗原表位嵌合 蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)，取上述酶切后DNA片段，插入到載體pET28a (+ )內(nèi)的Ndel和EcoRI位點(diǎn)之間，表達(dá)含有五種型別腺病毒抗原表位的嵌合蛋白； 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定： 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(60yg/mL)LB平板，置37°C過(guò)夜； 次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和對(duì)照菌(質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)化菌），提取質(zhì)粒，用Ndel和EcoRI雙酶切驗(yàn) 證，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，切下1104bp的目的基因片段；同時(shí)，將含有該基因片 段的質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析，序列分析證實(shí)重組質(zhì)粒含有連接在一起的五種型別腺病毒抗 原表位基因片段，序列完全正確：構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)含有五種型別腺病毒抗原表位的嵌合蛋白，全長(zhǎng)363個(gè)氨基酸，在 其N端為腺病毒3型抗原表位蛋白片段，依次串聯(lián)7型、11型、14型抗原表位蛋白片段，C端為 腺病毒55型抗原表位蛋白片段，各片段長(zhǎng)度依次為3型長(zhǎng)85個(gè)氨基酸，7型長(zhǎng)74個(gè)氨基酸，11 型長(zhǎng)41個(gè)氨基酸，14型長(zhǎng)112個(gè)氨基酸，55型長(zhǎng)39個(gè)氨基酸，蛋白片段之間由兩個(gè)甘氨酸和 一個(gè)絲氨酸連接，其氨基酸序列如下：表達(dá)嵌合蛋白工程菌的篩選鑒定： 將含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接種至含3mL LB培養(yǎng)基（含卡那毒素60yg/mL)的試管 內(nèi)，37 °C振蕩培養(yǎng)3h，加 IPTG至終濃度0.5mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)6h，離心收集菌體進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)，重組子表達(dá)相對(duì)分子量為55 kD的 HAdV嵌合蛋白，而對(duì)照菌BL21(DE3)無(wú)此蛋白帶； 人腺病毒抗原表位嵌合蛋白的純化： 1) 表達(dá)腺病毒抗原表位嵌合蛋白工程菌的超聲裂解 將誘導(dǎo)表達(dá)嵌合蛋白的工程菌離心(8000 rpm、10 min、4°C)收菌，菌體重懸于原培養(yǎng) 液1/10體積的細(xì)菌裂解液(20 mmol/L PB pH7.4、5%甘油）內(nèi)，冰浴超聲破菌，離心收集上 清； 2) 表達(dá)腺病毒抗原表位嵌合蛋白的硫酸胺分級(jí)沉淀 精確量出上清體積，向上清內(nèi)加入適量飽和硫酸胺溶液，邊加邊攪拌，使硫酸胺的終濃 度為25 %，置冰浴內(nèi)過(guò)夜； 離心收集上清，加入適量固體硫酸胺粉末，邊加邊攪拌，使硫酸胺的終濃度為50 %，置 冰浴內(nèi)過(guò)夜;次日離心收集沉淀；用200mL平衡液(50mM Tris-HCl，pH 7 · 5)懸浮沉淀，裝入 透析袋內(nèi)，對(duì)l〇〇〇mL平衡液透析過(guò)夜，換液4次;離心收集上清，直接上DEAE-Separose FF陰 離子柱純化； 3. DEAE_Separose FF陰離子柱純化 用平衡液(50mMTris-HCl，pH7.5)沖洗平衡DEAE-SeparoseFF陰離子柱，然后將上步 透析好的上清直接上柱，流速為100 mL/h;上樣結(jié)束后用平衡液充分洗柱，再依次用含100、 200、300、400、500、1000 mmol/L NaCl的溶液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，用12% SDS - PAGE電泳檢測(cè)各峰蛋白，確定哪個(gè)洗脫峰含表達(dá)的腺病毒抗原表位嵌合蛋白；300 mmol/L NaCl洗脫蛋白峰即為腺病毒抗原表位嵌合蛋白。9. 權(quán)利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白用于研制腺病毒疫苗、抗體或抗原檢 測(cè)試劑，及用于免疫制備抗腺病毒單抗和多抗。10. 權(quán)利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白，也可利用酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳 動(dòng)物細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物進(jìn)行重組表達(dá)、制備。11.權(quán)利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白，嵌合蛋白中各型別腺病毒抗原表位 蛋白片段任意連接，以嵌合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)、制備。
【文檔編號(hào)】A61K39/295GK105820257SQ201610269189
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年4月27日
【發(fā)明人】李越希, 王新國(guó), 李佳萌, 李素芹, 陳紅霞, 陳晨, 李素梅, 齊勇, 潘英, 徐亦非
【申請(qǐng)人】李越希