一株重組大腸桿菌及其在制備具有人血型b抗原活性的n?糖蛋白中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株重組大腸桿菌，命名為重組大腸桿菌CEBO86，是將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pACT3?PglB和pBAD24?malEM共轉(zhuǎn)化已缺失waal基因的大腸桿菌CLM24中獲得，該重組大腸桿菌的基因型為CLM24/p?pglB+p?malEM，有能同時表達(dá)PglB和malEM基因的功能。利用本發(fā)明所述重組大腸桿菌能夠發(fā)酵制備具有人血型B抗原活性的N?糖蛋白，且生產(chǎn)步驟簡單，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低，可實(shí)現(xiàn)N?糖蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)；制備獲得的N?糖蛋白具有良好的B抗原活性，可高效吸附人血漿中的抗B抗體，為通用血產(chǎn)品的制備提供新的選擇方案，同時，可用于血型不兼容的器官移植，具有良好的工業(yè)開發(fā)和應(yīng)用前景。
【專利說明】
一株重組大腸桿菌及其在制備具有人血型B抗原活性的N-糖 蛋白中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一株重組大腸桿菌及其應(yīng)用，尤其涉及一株重組大腸桿菌CEB086及其 在制備具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的應(yīng)用；屬于生物技術(shù)、基因工程和微生物發(fā)酵 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] ΑΒ0血型系統(tǒng)是人類血型系統(tǒng)中最重要的一類。根據(jù)紅細(xì)胞所含的特殊的抗原不 同，該系統(tǒng)分為A、B、AB和0四種血型。該血型系統(tǒng)是由A、B兩種抗原決定，它們是一種多糖抗 原，在血小板以及內(nèi)皮細(xì)胞上有分布。血型不相容是因為人體內(nèi)產(chǎn)生有相應(yīng)的抗體來對抗A 或B抗原。這些抗體就像血凝素，它們能夠引起血細(xì)胞凝集而消融，在大量輸血或者進(jìn)行器 官移植過程甚至?xí)斐伤劳?。移除血漿里的抗A或B抗體可克服因為不同血型之間進(jìn)行的器 官移植而引起的超敏排斥，因此，適時移除血漿里的抗A或B抗體是一種有效并切實(shí)可行的 抗凝集和排異方法。目前，已有多種方法可去除血漿中抗A或抗B抗體，其主要根據(jù)這些抗體 與相應(yīng)抗原的特異性結(jié)合，利用免疫吸附的方式除去相應(yīng)的抗體或者是抗體生成細(xì)胞，可 用于ΑΒ0血型不合型的器官移植。常用的免疫吸附是將A或B血型抗原通過配糖類物質(zhì)連接 到瓊脂糖基質(zhì)上。值得一提的是，A或B血型抗原不僅僅很難獲取，而且很難固定化，使得整 個方法造價相當(dāng)昂貴以致不能在資源匱乏、收入低下的國家得到很好地應(yīng)用。因此亟需找 到一種費(fèi)用低、效率高的具有人血型抗原活性的糖抗原的生產(chǎn)方法。
[0003] 目前，A、B血型抗原多數(shù)都是通過化學(xué)方法和生物酶法合成。其血型抗原糖鏈的化 學(xué)合成不僅需要復(fù)雜的保護(hù)和去保護(hù)的操作，步驟繁雜，立體專一性不易控制，而且產(chǎn)率 低。同時酶法合成中所用的相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶較難大批量獲取，并且，酶促反應(yīng)中活化的糖供 體價格昂貴，這為血型糖抗原的酶法合成增加了困難。經(jīng)檢索，利用重組大腸桿菌制備具有 人血型B抗原活性的N-糖蛋白（大腸桿菌086: H7N-糖蛋白）以及利用N-糖蛋白在去除血漿B 抗體中的應(yīng)用的文獻(xiàn)還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有方法的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一株重組大腸桿菌及其在制備 具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的應(yīng)用。
[0005] 研究證明，大腸桿菌086:B7的0抗原與人B血型抗原結(jié)構(gòu)相似，具有人B血型抗原活 性（圖1)。本發(fā)明的技術(shù)方案基于空腸彎曲菌N-連接糖基化途徑同大腸桿菌脂多糖合成途 徑相似的特點(diǎn)，采用在大腸桿菌086 :H7中過量表達(dá)來源于大腸桿菌中的malE基因（來源NEB 公司的質(zhì)粒pMAL_p5X)突變體和來源于空腸彎曲菌的pglB基因 （PglB NCBI-GenelD : 905417)，構(gòu)建獲得基因型為086 Δ waal/p-malEM+p-PglB的重組大腸桿菌，并且在改良LB培 養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白。
[0006] 本發(fā)明所述的重組大腸桿菌菌株命名為重組大腸桿菌CEB086,其特征在于:所述 重組大腸桿菌由如下方法制得：
[0007] 構(gòu)建含有PglB基因的pACT3-PglB的重組質(zhì)粒和含有malEM基因的pBAD24-malE%9 重組質(zhì)粒，然后將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒pACT3-PglB和pBAD24-malE M共轉(zhuǎn)化已缺失waal基因 的大腸桿菌CLM24中，得到能同時表達(dá)PglB和malEM基因的重組大腸桿菌，其基因型為 CLM24/p-pglB+p_malEM，該菌株即為重組大腸桿菌CEB086;
[0008] 其中，所述malEMS因來源于質(zhì)粒PMAL-P5X，所述PglB基因來源于空腸彎曲桿菌 NCTC 11168；
[0009] 上述malEM基因為malE基因突變體，是通過在malE基因的3'末端插入一段核苷酸 序列如SEQ ID No. 1所示的表達(dá)糖基化序列的基因所得；
[0010] 上述大腸桿菌CLM24是通過敲除出發(fā)菌株大腸桿菌086的waaL基因而構(gòu)建的大腸 桿菌工程菌，其基因型為086 Δ waal。
[0011] 進(jìn)一步的，上述重組大腸桿菌CEB086的構(gòu)建方法概述：
[0012] l.waaL基因的敲除
[0013] 基本方法是通過Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌E.coli 086中敲除基因 waaL(寡糖基轉(zhuǎn) 移酶）。制得的缺失waaL基因的大腸桿菌E.coli 086AWaal，命名為CLM24。
[0014] 上述Red重組系統(tǒng)，是通過質(zhì)粒pKD46表達(dá)菌體重組酶Gam、Bet和Exo,通過設(shè)計 帶有waaL基因同源臂的引物擴(kuò)增帶有篩選標(biāo)記卡那霉素抗性基因的重組片段。然后通過電 穿孔儀電擊，將重組片段轉(zhuǎn)入表達(dá)λ噬菌體重組酶Gam、Bet和Exo的大腸桿菌中，重組片段在 重組酶的作用下與基因組上的目的基因發(fā)生重組，從而將原有的基因置換下來，而抗性基 因通過表達(dá)FLP內(nèi)切酶，從基因組上切除掉。
[0015] 2.malEM基因和PglB基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0016]基本方法是以空腸彎曲菌基因組為模板，克隆pglB基因，將所克隆獲得的pglB基 因插入質(zhì)粒PACT3中，從而獲得重組表達(dá)載體p-pglB;以質(zhì)粒pMAL-p5X為模板，克隆malEMS 因，將所克隆獲得的malEM基因插入質(zhì)粒pBAD24中，從而獲得重組表達(dá)載體p-malEM。
[0017] 3. N-糖蛋白發(fā)酵重組菌株的構(gòu)建
[0018]基本方法是將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒p-pglB和p-malEM*轉(zhuǎn)化大腸桿菌CLM24中，從而 獲得過量表達(dá)malEMPpglB基因的重組大腸桿菌，命名為重組大腸桿菌CEB086。
[0019]本發(fā)明所述重組大腸桿菌CEB086在制備具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的應(yīng) 用。
[0020] 具體的，利用重組大腸桿菌CEB086制備具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白的方法 是：
[0021] 1.搖瓶培養(yǎng)
[0022]挑取所構(gòu)建的重組菌株CEB086單菌落置裝有3-5mL改良LB培養(yǎng)基的15mL的試管 中，其中氨芐青霉素終濃度為lOOwg/mL，壯觀霉素終濃度為50yg/mL，在37°C，200-225r/ min，培養(yǎng) 12h。
[0023]將過夜培養(yǎng)的菌液按照0.5-3 % (v/v)的接種量接入裝有50mL改良LB培養(yǎng)基的 100mL的三角瓶中，其中氨芐青霉素終濃度為100yg/mL，氯霉素終濃度為25yg/mL，在37°C， 200-225r/min條件下培養(yǎng)。
[0024] 待菌液0D6QQ = 0.4-0.6時，按照0.5-3% (v/v)的接種量接入裝有1L改良LB培養(yǎng)基 的3L的三角瓶中，其中氨芐青霉素終濃度為100yg/mL，氯霉素終濃度為25yg/mL，在37°C， 200-225r/min條件下培養(yǎng)。
[0025] 待菌液0D6Q() = (). 6-0.8時，加入終濃度為0.2 % (v/v)的L-阿拉伯糖和終濃度為 100mM/L 的 IPTG，在 16-37°C，200-225r/min 條件下培養(yǎng)。
[0026]其中，上述加入L-阿拉伯糖后，發(fā)酵溫度優(yōu)選28°C。
[0027] 待培養(yǎng)4-6h后，補(bǔ)加一次終濃度為0.2%(v/v)的L-阿拉伯糖，在200-225r/min，28 °(：繼續(xù)培養(yǎng)14-16小時。
[0028] 2. N-糖蛋白純化
[0029] 將搖瓶發(fā)酵的菌液以10,000-12,0001'/111；[11離心5-10111；[11。離心所得沉淀用111^/1111 溶菌酶4°C處理lh。再以10,000-12,000r/min離心5-10min，收集上清用親和鎳柱純化，收集 N-糖蛋白的洗脫液，超濾脫鹽。
[0030] 檢測結(jié)果:搖瓶發(fā)酵中N-糖蛋白的產(chǎn)量為1.5mg/L。
[0031] 本發(fā)明公開了一株重組大腸桿菌CEB086及其在制備具有人血型B抗原活性的N-糖 蛋白中的應(yīng)用，利用本發(fā)明提供的重組大腸桿菌發(fā)酵制備具有人血型B抗原活性的N-糖蛋 白的生產(chǎn)步驟簡單，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低，可以應(yīng)用于具有人血型B抗原的N-糖 蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)；同時，本發(fā)明生產(chǎn)的人血型B抗原的N-糖蛋白具有良好的B抗原活性，可 高效吸附人血漿中的抗B抗體，為通用血產(chǎn)品的制備提供新的選擇方案，同時，可用于血型 不兼容的器官移植，具有良好的工業(yè)開發(fā)和應(yīng)用前景，應(yīng)用價值巨大。
【附圖說明】
[0032]圖1.大腸桿菌086: B7的0抗原與人B血型抗原結(jié)構(gòu)圖。
[0033]圖2.基因敲除原理步驟示意圖及waal基因敲除瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0034]圖3.p_pglB表達(dá)載體圖譜。
[0035] 圖44_!1^舊表達(dá)載體圖譜。
[0036] 圖5.SDS-PAGE分析MBP糖基化。MBP為malEM基因表達(dá)的蛋白，MBP-0PS為糖基化的 MBP。泳道1為MBP-0PS，泳道2為MBP。
[0037] 圖6.Western blot分析MBP糖基化。泳道 1 為MBP-0PS，泳道2為MBP。
[0038] 圖7.MALDI-T0F 分析 MBP 糖基化。
[0039]圖8.MBP-0PS與人血漿中抗財允體特異性結(jié)合的ELISA檢測。
[0040]圖9 .MBP-0PS去除人血漿中抗B抗體及其對凝血功能的影響。
[0041 ] 圖10.重組大腸桿菌CEB086表達(dá)產(chǎn)物示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 一般性說明：如下實(shí)施例所涉及的酶均購自Thermo公司，質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂 糖凝膠回收DNA片段試劑盒購自天根公司，操作完全按照相應(yīng)說明書進(jìn)行。質(zhì)粒構(gòu)建中基因 測序由華大基因公司完成。質(zhì)粒PBAD24來源于ATCC(美國典型菌種保藏中心）；DH5a感受態(tài) 細(xì)胞購自全式金生物技術(shù)有限公司。所用人血液標(biāo)本在受試者知情同意條件下取自正常成 年人。實(shí)施例中的其他實(shí)驗方法及試劑如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法與市售試劑。 [0043]所述LB培養(yǎng)基為:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
[0044] 所述S0C培養(yǎng)基為：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl 0.0585g/L，KCl 0.0186g/L， MgCl2 0.203g/L，MgS〇4 0.246g/L，葡萄糖20mmol/L。
[0045] 所述改良LB培養(yǎng)基為：蛋白胨10-20g/L，酵母粉5-30g/L，甘油l-10ml/L，NaC15-10g/L〇
[0046] 實(shí)施例1、敲除大腸桿菌E.coli 086waal基因，構(gòu)建大腸桿菌工程菌CLM24
[0047] (1)同源片段的克隆
[0048]利用Red重組系統(tǒng)對目的基因進(jìn)行敲除。
[0049] 根據(jù)Genbank公布的waal基因序列設(shè)計引物如下：
[0050] pKD-waal F：
[0051 ] 5 '-TTGGAAAAGTTATCATCATTATAAAGGTAAAACATGCTAACATCCTTTAAACTTCATTC ATTGAAACCTTACACTCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3，
[0052] pKD-waal R：
[0053] 5 '-GAGTTTTAACTCACTTCTTAAACTTGTTTATTCTTAATTAATTGTATTGTTACGATTATT AATGACGAGTAAGAGGACATGGGAATTAGCCATGGTCC-3 ，
[0054] 以pKD4通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))體外擴(kuò)增獲得帶有卡那霉素抗性的重組片段。 PCR反應(yīng)體系如下：（引物濃度為20ymol/L) 1〇χ緩沖液 5μ1; 25mmol/L MgCl^ 4μΙ ； 1.0mmol/L 四神:dNTP 混合液 Ι.μL;:
[0055] 上下游引物各 ΙμL; Taq DNA 聚介_ 0.5μ1； 難 DNA ?μL； 加水補(bǔ)至 50μ1。
[0056] ?〇?反應(yīng)條件：97°(：預(yù)變性1〇111丨11，94°(：變性3〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸9〇8,30個 循環(huán)后72°C延伸10min，4°C保存。通過Dpnl內(nèi)切酶消化后，回收純化濃縮同源重組片段。 [0057] (2)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0058] (I)挑取帶有pS頂19質(zhì)粒的大腸桿菌086,轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中，同時加入100mg/L氨芐 青霉素，30 °C，200r/min，培養(yǎng)0D_至0.4;
[0059] (11)42。(：水浴1511^11，20(^/11^11;
[0060] (III)冰浴15min，離心菌體，然后利用10 %的甘油洗滌3次；
[00611 (IV)加入10 %的甘油，濃縮至50倍，分裝感受態(tài)。
[0062] (3)電轉(zhuǎn)化，篩選重組子
[0063] (I)吸取8μg/ml的同源重組片段，加入100μ1的感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷 的2mm電轉(zhuǎn)杯中，輕甩至杯底部。調(diào)節(jié)電穿孔儀，2.5Κν，電擊；
[0064] (II)加入900μ1的S0C培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)移至無菌ΕΡ管中，37°C，120r/min，培養(yǎng)lh;
[0065] (III)涂布卡那霉素抗性平板，調(diào)取重組子利用
[0066] waal test F:GGTATGTAGGGCTCCAAGAG
[0067] waal test R:AATTTGGTCCCCGAATCATC
[0068]進(jìn)行PCR檢測，通過PCR產(chǎn)物測序進(jìn)一步證實(shí)waal基因已被卡那霉素抗性基因替 換。
[0069] (IV)FLP位點(diǎn)特異性重組
[0070]將pCP20轉(zhuǎn)入卡那霉素抗性克隆，30°C培養(yǎng)8h，后提高至42°C過夜，熱誘導(dǎo)FLP重組 酶表達(dá)，質(zhì)粒也逐漸丟失。利用接種環(huán)沾取菌液在無抗性培養(yǎng)基上劃線，將長出的單克隆同 時轉(zhuǎn)入無抗性平板和卡那霉素抗性平板上培養(yǎng)，在無抗性平板上生長而在卡那霉素抗性平 板上不生長的已將卡那霉素抗性基因消除。利用檢測引物waal test F和waal test R進(jìn)行 進(jìn)一步鑒定。
[0071] (V)獲得敲除waal基因而構(gòu)建的大腸桿菌工程菌，其基因型為086Awaal，命名為 大腸桿菌CLM24。結(jié)果見圖2。
[0072]實(shí)施例 2、重組質(zhì)粒 pACT3-pglB、pBAD24-malEM 的構(gòu)建
[0073] (l)pglB基因 （PglB NCBI-GeneID:905417)表達(dá)載體的構(gòu)建
[0074] 根據(jù)NCBI公布的空腸彎曲桿菌NCTC 11168基因組序列設(shè)計引物：
[0075] pglB-F:
[0076] 5 '-CACGCCATGGTCTTGAAAAAAGAGTATTTAAAAAACCC-3 '
[0077] pglB-R:
[0078] 5 '-ATTCCCGGGTCAATGATGATGATGATGATGAATTTTAAGTTTAAAAACTTTAG-3 '
[0079] 以NCTC 11168基因組為模板，PCR克隆pglB基因。PCR反應(yīng)體系如下：（引物濃度為 20ymol/L) l〇x緩沖液 5μ1; 25mmol/L Mgd： 4μ!； lOmmol/L 叫種 dNT丨1 ?介液 ΙμΙ;
[0080] 上下游引物 各ΙμL; pfuDNA 災(zāi)介略 0.5μ1： 模板 DNA ΙμL； 加水補(bǔ)至 50μ1。
[0081 ] PCR 反應(yīng)條件:97°C 預(yù)變性 10min，94°C 變性 30s，50°C 退火 30s，72°C 延伸 2min，30 個 循環(huán)后72°C延伸10min，4°C保存。
[0082]將克隆的pglB基因片段分別利用限制性內(nèi)切酶Smal和Sail消化處理，同時將質(zhì)粒 載體PACT3也分別利用核酸內(nèi)切酶Smal和Sail消化處理。將消化處理的pglB基因片段和 PACT3質(zhì)粒載體利用瓊脂糖凝膠試劑盒回收，然后利用T4連接酶連接。
[0083] 連接體系為ΙΟμΙ: pglB j Wx 6μ1 ； pBAD24 錢休 2μΙ；
[0084] lOxBulTcr ΙμL； Τ4連接酶 ΙμL。
[0085] 16°C連接12h后，將10μ1的連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。
[0086] 轉(zhuǎn)化過程為:將10μ1的連接液加入100μΙ的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min， 42°C熱擊90s，冰浴2min，加入900μ1的LB培養(yǎng)基，37°C，lOOr/min，孵化lh，涂布氯霉素抗性 平板，培養(yǎng)16h，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒驗證。然后進(jìn)一步測序驗證pglB基因的正確。從而獲 得重組質(zhì)粒pACT3-pglB。
[0087] (2) ma 1EM (來源NEB公司的質(zhì)粒pMAL-p5X)基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0088] 根據(jù)NCBI公布的質(zhì)粒pMAL-p5x序列設(shè)計引物：
[0089] malEM-F:
[0090] 5'-TCCCCCGGGGGAAGGAGG CATAGATTATGAAAATAAAAACAGGTGC-3'
[0091] malEM-R:
[0092] 5 '-GCGTCGACGTCTCAATGATGATGATGATGATGGGTCGCGTTCTGATCTCCTCCAGTGG CGTTCTGATCGCCGCCGGTCGCGTTCTGATCGCCGCCGGTCGCGTTCTGATCTTCCAGC TGCGCGTCTTTCAGGGC -3，
[0093] 其中：上述malEM-R中含有表達(dá)糖基化序列的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.l 所示，具體是：
[0094] 5'-CTGGAAGATCAGAACGCGACCGGCGGCGATCAGAACGCGACCGGCGGCGATC AGAACGCCACTGG AGGAGATCAGAACGCGACC-3，
[0095]以質(zhì)粒pMAL-p5x為模板，PCR克隆malEM基因。PCR反應(yīng)體系如下：（引物濃度為20μ mol/L) l〇x緩沖液 5μΙ: 25 nimol/L MgCI；i 4μΙ； 10 mmoL/L, !叫種 dNTP 混合液 .ΙμL;
[0096] 上下游引物 各丨μΙ; P/mDNA 聚合酶 0.5μΙ; 模板 DNA ΙμL； 加水補(bǔ)至 50μ1,:.
[0097] PCR 反應(yīng)條件：97 °C 預(yù)變性 10min，94°C 變性 30s，55 °C 退火 30s，72 °C 延伸 90s，30 個 循環(huán)后72°C延伸10min，4°C保存。
[0098] 將克隆的malEM片段分別利用核酸內(nèi)切酶Sail和HindllI消化處理，同時將質(zhì)粒載 體PBAD24也分別利用核酸內(nèi)切酶Sal I和Hindll I消化處理。將消化處理的malEM片段和 PBAD24質(zhì)粒載體利用瓊脂糖凝膠試劑盒回收，然后利用T4連接酶連接。
[0099] 連接體系為10μ1: ιηα?ΕΜ 片段 6μΙ； pBAD24_^ 休 2μΙ;
[0100] χ lOxBuiTcr ΙμL； T4連接酶 ΙμL。
[0101] 16°c連接12h后，將10μ1的連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。
[0102] 轉(zhuǎn)化過程為:將10μ1的連接液加入100μ1的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。冰浴30min， 42°C熱擊90s，冰浴2min，加入900μ1的LB培養(yǎng)基，37°C，100r/min，孵化lh，涂布氨芐青霉素 抗性平板，培養(yǎng)16h，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒驗證。然后進(jìn)一步測序驗證malEM基因的正確。從 而獲得重組質(zhì)粒pBAD24-malEM。
[0103] 實(shí)施例3、構(gòu)建重組大腸桿菌菌株CEB086和利用該菌株制備具有人血型B抗原活性 的N-糖蛋白的應(yīng)用
[0104] (1)重組大腸桿菌菌株CEB086的構(gòu)建
[0105] 制備CLM24的CaCl2化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞50ul加入5yL的重組質(zhì)粒p-pglB，混勻冰浴 30min，42°C熱激90s，再冰浴2min，然后加入900ul LB培養(yǎng)基，37°C，120r/min恢復(fù)培養(yǎng)lh; 4,000r/min離心2min，倒出部分上清，將剩下的菌體涂布Cam抗生素平板，37°C培養(yǎng)24h后挑 取重組子驗證。從而獲得重組菌CLM24/p-pglB。
[0106] 向制備的CLM24/p-pglB CaCl2化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞50yL加入5yL質(zhì)粒p-malEM，混勻冰 浴30min，42°C水浴鍋熱激90s，冰浴2min，然后加入900yL LB培養(yǎng)基，37°C，120r/min恢復(fù)培 養(yǎng)lh;4,000r/min離心2min，倒出部分上清，將剩下的菌體涂布Amp抗生素平板，37°C培養(yǎng) 24h后挑取重組子驗證。從而獲得重組菌CLM24/p-pglB+p-malE M，命名為重組大腸桿菌 CEB086。
[0107] (2)重組大腸桿菌的發(fā)酵
[0108] 挑取所構(gòu)建的重組菌株CEB086(CLM24/p-pglB+p-malEM)單菌落至裝有5mL的改良 LB培養(yǎng)基的25mL的三角瓶中，其中氨芐青霉素終濃度為100yg/mL，氯霉素終濃度為25yg/ mL，在37°C，200r/min，培養(yǎng) 12h。
[0109]將過夜培養(yǎng)的菌液按照1 % (v/v)的接種量接入裝有50mL改良LB培養(yǎng)基的1 OOmL的 三角瓶中，其中氨芐青霉素終濃度為l〇〇yg/mL，氯霉素終濃度為25yg/mL，在37°C，200-225r/min條件下培養(yǎng)。
[0110]待菌液OD600 = 0.6時，按照1 % (v/v)的接種量接入裝有1L改良LB培養(yǎng)基的3L的三 角瓶中，其中氨芐青霉素終濃度為l〇〇yg/mL，氯霉素終濃度為25yg/mL，在37°C，200-225r/ min條件下培養(yǎng)。
[0111] 待菌液0D6q() = () . 6時，加入終濃度為0.2% (v/v)的L-阿拉伯糖和終濃度100mM/L IPTG，在28°C，200-225r/min條件下培養(yǎng)。
[0112] 待培養(yǎng)6h后，補(bǔ)加一次終濃度為0.2 % (v/v)的L-阿拉伯糖，在28°C，200-225r/min 條件下繼續(xù)培養(yǎng)14h。
[0113] (3)N_糖蛋白的純化
[0114] 取1L發(fā)酵液經(jīng)10,000r/min離心10min，收集菌體并用30mL的周質(zhì)空間蛋白提取液 (20mM Tris_HCl，20%(wt/vol)鹿糖，ImM EDTA，lmg/ml 溶菌酶，pH 7.5)4°C 處理菌體 lh。 12，000r/min離心30min，然后收集上清并加入到已用結(jié)合緩沖液（10mM咪唑，0.5M NaCl， 2〇1^他2冊〇4/似出?〇4緩沖液4117.4)預(yù)平衡過的51^的親和鎳柱中。經(jīng)過10個柱體積的結(jié) 合緩沖液洗滌，用洗脫緩沖液（250mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Na2HP〇4/NaH2P〇4緩沖液，pH 7.4)洗脫，收集含N-糖蛋白的洗脫液。
[0115] 將含有目的蛋白的洗脫液裝入截留分子量為1 OkDa超濾管，4°C 5，000g離心30min， 棄去下管液體，向套管內(nèi)加滿脫鹽緩沖液，4°C，5，000g離心30min。重復(fù)3次，至目的蛋白濃 縮至2mL，并將咪唑充分除去。濃縮后的蛋白凍存于-70°C冰箱中。
[0116] 實(shí)施例5、N-糖蛋白的鑒定
[0117] 純化的N-糖蛋白取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。MBP分子量在46KDa左右，與理論分子量 相符。N-糖基化的MBP形成梯狀條帶，主條帶分子量分布于50KDa與55KDa之間。由于SDS-PAGE靈敏度有限，有些糖蛋白的條帶未顯出。結(jié)果見圖5。
[0118]利用Western Blot鑒定N-糖蛋白，分別采用anti-His、anti_MBP、anti-〇157抗體 作為一抗，選用合適的羊抗鼠或羊抗兔作為二抗，進(jìn)行檢測分析。N-糖基化的MBP由于添加 了鏈長不等的〇-抗原而顯示出分子量比非糖基化的MBP大的梯狀條帶，證明MBP發(fā)生糖基 化。結(jié)果見圖6。
[0119] 利用MALDI-T0F對N-糖基化的MBP及MBP進(jìn)行分子量的鑒定。MBP分子量為45823Da， MBP主分子量分布于48790Da附近。結(jié)果見圖7。證明利用重組大腸桿菌CEB086發(fā)酵制備的蛋 白為N-糖蛋白，命名為N-糖蛋白MBP mut-〇PS。
[0120] 實(shí)施例6、N-糖蛋白的人血型B抗原活性
[0121] (1)N-糖蛋白與人抗B抗體的結(jié)合
[0122 ]不同濃度 MBP、MBP_0PS (lyg/mL，2yg/mL, 4yg/mL, 6yg/mL,8yg/mL, 1 Oyg/mL 和 12yg/ mL)包被96孔板，4°C過夜。2%BSA室溫封閉2小時后，PBST(PBS，0.05%Tween-20)洗板三次， 每次5分鐘。一抗(抗A/抗B抗體，稀釋度為1: 20)室溫孵育2小時候，PBST洗板3~5次，每次5 分鐘。加入羊抗鼠 IgM(l :20000)，并室溫孵育1小時。最后，加入TMB顯色10~20分鐘，并用1M HC1終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取450nm的吸光度值。結(jié)果見圖8。
[0123] (2)血漿抗B抗體滴度測定
[0124] 采用凝聚胺試驗測定血清血漿B抗體滴度。血漿倍比稀釋，取10支EP管，每管各加 入生理鹽水l〇〇yL，在第一管加入待測血漿100yL，混勻后移出100yL，至第二管，同樣操作稀 釋至第10管，從第10管吸出1〇〇此暫時保留在另一支EP管仲。從第1管到到第8管的血漿稀釋 度依次是：1: 2，1:4，1:8，1:16……1:1024。每管各加入2%的B紅細(xì)胞懸液100yL，充分混勻； 然后，各管加入凝聚胺試劑盒中的L頂液0.7ml，混勻后各加 Polybrene溶液2滴，混勻，離心， 加 Resuspending液2滴重懸溶液，觀察凝集情況，讀取結(jié)果。以肉眼觀察的最后一個"1+"的 凝集管作為判斷的終點(diǎn)，終點(diǎn)血漿稀釋度的倒數(shù)為效價。
[0125] (3)MBP_0PS吸附人血漿抗財允體
[0126] 將終濃度為0,80,160and 320yg/mL的MBPmut-〇PS與800yL血漿混合，置室溫1小時 候，測定血漿中抗B抗體滴度，方法同實(shí)例6(2);并應(yīng)用全自動凝血功能分析儀測定樣品血 漿凝血參數(shù)。結(jié)果見圖9
[0127] 根據(jù)所得吸附B抗體結(jié)果可得出結(jié)論，本發(fā)明的重組大腸桿菌CEB086生產(chǎn)的具有B 抗原活性的N-糖蛋白有明顯吸附去除人血漿中B抗體的作用，提示通過本發(fā)明的重組大腸 桿菌可大量合成去除B抗體所需要的B抗原，為人血型B抗原的生產(chǎn)提供了新的選擇，且其具 有成本低，產(chǎn)率高的特點(diǎn)。預(yù)示本發(fā)明的重組大腸桿菌可作為生人血型B抗原的工廠，具有 良好的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項】
1. 一株重組大腸桿菌，該菌株命名為重組大腸桿菌CEB086，其特征在于:所述重組大腸 桿菌由如下方法制得： 構(gòu)建含有PglB基因的pACT3-PglB的重組質(zhì)粒和含有malEM基因的pBAD24-malEM的重組 質(zhì)粒，然后將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒pACT3-PglB和pBAD24-malEM共轉(zhuǎn)化已缺失waal基因的大 腸桿菌CLM24中，得到能同時表達(dá)PglB和malE M基因的重組大腸桿菌，其基因型為CLM24/p-pglB+p-malEM，該菌株即為重組大腸桿菌CEB086; 其中，所述malEMS因來源于質(zhì)粒pMAL-p5X，所述PglB基因來源于空腸彎曲桿菌NCTC 11168； 上述malEM基因為malE基因突變體，是通過在malE基因的3'末端插入一段核苷酸序列如 SEQ ID No. 1所示的表達(dá)糖基化序列的基因所得； 上述大腸桿菌CLM24是通過敲除出發(fā)菌株大腸桿菌086的waaL基因而構(gòu)建的大腸桿菌 工程菌，其基因型為086 Δ waal。2. 權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌在制備具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P21/00GK106085933SQ201610403292
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】陳敏, 劉現(xiàn)偉, 商文靜, 翟亞菲
【申請人】山東大學(xué)