本發(fā)明涉及基因工程和黃瓜的蛋白和基因，屬于分子遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種微型化黃瓜植株相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃瓜(cucumissativusl.2n＝2x＝14)屬葫蘆科甜瓜屬一年生蔓生草本植物，是世界上十大蔬菜作物之一。盡管黃瓜的地理分布十分廣泛，但其遺傳基礎(chǔ)狹窄，導(dǎo)致現(xiàn)有可用于各種表型基因研究的材料較為缺乏，阻礙了黃瓜功能基因組學(xué)和遺傳研究工作的快速發(fā)展。在用ems構(gòu)建的黃瓜突變體庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)可穩(wěn)定遺傳的單基因控制黃瓜植株微型化的突變體。該突變體可以用于選育優(yōu)良的黃瓜新品種類型，同時(shí)也是研究黃瓜果實(shí)遺傳和進(jìn)化的理想材料。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)微型化突變體和野生型單株進(jìn)行高通量簡(jiǎn)化基因組混池測(cè)序，在七號(hào)染色體上初定位到一個(gè)14.11-17.63mb的區(qū)間，通過ems誘變?cè)瓌t(g→a和c→t)以及δsnp指數(shù)≥0.8，最終定位到控制黃瓜植株微型化的基因mp1。

植物細(xì)胞微管骨架的排布方式對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及形態(tài)建成具有重要意義。微管的這種動(dòng)態(tài)組織行為不僅需要自身組成的微管蛋白，還需要微管結(jié)合蛋白(microtubule-associatedproteins，maps)的參與，它是一類能夠特異地與微管結(jié)合，并參與調(diào)節(jié)微管結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)合蛋白。植物微管結(jié)合蛋白在植物組織中廣泛發(fā)揮作用，如調(diào)節(jié)微管的組裝和動(dòng)力學(xué)，形成和支持微管骨架并用這個(gè)骨架來進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等。劍蛋白(katanin)是微管結(jié)合蛋白之一，由p⁶⁰亞基和p⁸⁰亞基組成的異源二聚體，是一種微管切割因子。p⁶⁰亞基屬于aaaatp酶(atpaseassociatedwithvariouscelluaractivities)家族，能切割微管。p⁸⁰亞基參與劍蛋白在微管組織中心的定位和p⁶⁰亞基的微管切割活性的調(diào)節(jié)。mp1編碼了一個(gè)p⁶⁰劍蛋白，它在植物生長(zhǎng)過程中起重要作用，包括各向異性的細(xì)胞延伸、激素信號(hào)的傳遞和根毛的形成等(lloydandchan，2004)。在p⁶⁰劍蛋白突變體中，擬南芥根伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞周質(zhì)微管的排列方向發(fā)生了明顯改變(burkandye，2002)，meier等(2002)在表達(dá)赤霉素-熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因(一個(gè)p⁶⁰劍蛋白突變體的等位基因)luel突變體中檢測(cè)到赤霉素異常表達(dá)。mp1在黃瓜中的克隆，將有助于闡明p⁶⁰劍蛋白在黃瓜細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)與功能方面的作用，在黃瓜新品種選育和株型研究中具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種黃瓜植株微型化相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白屬于p⁶⁰劍蛋白，在氨基酸取代的情況下，能使微管細(xì)胞骨架缺失，細(xì)胞排列異常，導(dǎo)致黃瓜植株微型化的現(xiàn)象，可以為黃瓜的株型改良和雜交育種或轉(zhuǎn)基因植物的開發(fā)創(chuàng)造條件。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：定位到一個(gè)黃瓜植株微型化的相關(guān)蛋白，命名為mp1，來源于黃瓜，mp1是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中seqidno：2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

b)在序列表seqidno：2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代一個(gè)氨基酸且與黃瓜植株微型化相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。

seqidno：2氨基酸序列由521個(gè)氨基酸殘基組成，屬于aaaatp酶家族，能切割微管，使細(xì)胞骨架缺失，植株表現(xiàn)出微型化。

上述b)中的mp1可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述b)中的mp1的編碼基因可以通過將序列表中seqidno：1所示的dna序列中進(jìn)行一個(gè)堿基對(duì)的非同義突變。

編碼所述mp1的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

mp1基因具體可分為1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中seqidno：1所示的dna分子；

2)在嚴(yán)格條件下可與序列表seqidno：1限定的dna序列雜交且編碼上述與植株微型化相關(guān)蛋白的dna分子；

3)與1)的基因有90％以上的同源性，且編碼上述與植株微型化相關(guān)蛋白的dna分子。

seqidno：1序列由1566個(gè)堿基組成，自5端第1-3位為起始密碼子，編碼具有序列表中seqidno：2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；該氨基酸序列為aaaatp酶類，具有七個(gè)外顯子和六個(gè)內(nèi)含子?；虻膲A基序列的1058bp位的胞嘧啶(c)被胸腺嘧啶(t)取代，編碼的氨基酸殘基序列的353位絲氨酸(ser)突變?yōu)楸奖彼?phe)。

含有mp1基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于一種黃瓜植株微型化相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，該蛋白的氨基酸序列如序列表seqidno：2所示，屬于aaaatp酶家族，與微管切割相關(guān)；該蛋白的編碼基因如序列表seqidno：1所示的堿基序列，該堿基序列若在1058bp位的胞嘧啶被胸腺嘧啶取代，編碼的氨基酸殘基序列的353位ser突變?yōu)閜he，這樣該蛋白抑制微管細(xì)胞正常發(fā)育，使微管細(xì)胞骨架缺失，排列異常，具體在植株表型為植株微型化，突變體植株高度只有正常野生型植株高度的20％左右，果實(shí)長(zhǎng)度也只有正常野生型果實(shí)長(zhǎng)度的10％左右，同時(shí)葉片和種子均明顯變短。該蛋白及其編碼基因的應(yīng)用，可以為黃瓜株型的改良和雜交育種或轉(zhuǎn)基因植物的開發(fā)創(chuàng)造條件。

附圖說明

圖1黃瓜植株微型化突變體mp1的株高表型，左邊為突變體mp1，中間為中間型，右邊為野生型。

圖2黃瓜植株微型化突變體mp1的成熟瓜表型，左邊為突變體mp1，中間為中間型，右邊為野生型。

圖3黃瓜植株微型化突變體mp1的葉片表型，左邊為突變體mp1，中間為中間型，右邊為野生型。

圖4黃瓜植株微型化突變體mp1的種子表型，左邊為突變體mp1，右邊為野生型。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例1突變體的表型及遺傳分析

從ems(ethylmethylsulfonate)誘變的長(zhǎng)春密刺突變體庫(kù)中篩選到一個(gè)黃瓜植株微型化的突變體mp1。突變體與野生型相比，它的株高顯著降低，生長(zhǎng)勢(shì)減弱、育性降低，葉片變小變深綠，無側(cè)枝，卷須變短，果實(shí)變短，種子變小變圓(圖1、2、3、4)。

以突變體mp1為父本，與野生型長(zhǎng)春密刺雜交，獲得子一代f1植株，f1植株與野生型相比，株高變矮，果實(shí)長(zhǎng)度變短，出現(xiàn)了中間型。f1代自花授粉所得的f2中，正常植株、中間型與突變體的分離比為113∶255∶117≈1∶2∶1，正常植株對(duì)突變體是不完全顯性突變，表明該突變體是隱性單基因突變體，命名該基因?yàn)閙p1。

實(shí)施例2mp1基因的定位

利用獲得的f2群體中的突變單株和野生型單株進(jìn)行混池測(cè)序，突變體dna池用超聲波方法隨機(jī)打斷，依照illuminapaired-enddnasampleprepkit建議的方法建庫(kù)。然后選取長(zhǎng)度為200-300bp之間的片段，采用hiseq2000平臺(tái)(pe101)進(jìn)行重測(cè)序。測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量監(jiān)控，去除低質(zhì)量及接頭污染的數(shù)據(jù)后，通過soap2軟件，將數(shù)據(jù)比對(duì)到黃瓜參考基因組9930上，得到比對(duì)到唯一位置的reads。然后利用這些數(shù)據(jù)，采用soapsnp軟件尋找突變體與9930參考基因組間的單核苷酸多態(tài)性(snp)，并根據(jù)snp指數(shù)在染色體上作出突變體池的圖。采用同樣的方法測(cè)序并分析野生型長(zhǎng)春密刺個(gè)體重測(cè)序數(shù)據(jù)，得到野生型長(zhǎng)春密刺與9930之間的snp位點(diǎn)，作出野生型池的snp指數(shù)圖。然后將突變體/9930snp與野生型長(zhǎng)春密刺/9930snp相比較，根據(jù)δsnp指數(shù)在染色體上作圖。根據(jù)滑動(dòng)窗口法的計(jì)算，將初定位區(qū)間定位到七號(hào)染色體14.11-17.63mb的區(qū)域上。理論上，造成突變性狀的突變位點(diǎn)snp指數(shù)應(yīng)該等于1，即為純合位點(diǎn)；由于遺傳連鎖，其附近的snp位點(diǎn)指數(shù)應(yīng)該等于或接近1。在初定位區(qū)域內(nèi)尋找成簇分布的snp位點(diǎn)，再根據(jù)ems誘變通常產(chǎn)生的突變，即g→a或c→t突變，一共找到了37個(gè)snp位點(diǎn)。大多數(shù)的snp位點(diǎn)處在內(nèi)含子以及基因間區(qū)，有一個(gè)snp處在csa7m414410.1的3端非翻譯區(qū)，只有5個(gè)snp位點(diǎn)處在基因的外顯子上，但是只有一個(gè)snp是非同義的純合突變，原本的胞嘧啶(c)被胸腺嘧啶(t)取代，導(dǎo)致編碼的絲氨酸(ser)突變?yōu)楸奖彼?phe)，從而確定導(dǎo)致突變的候選基因mp1。

實(shí)施例3mp1基因克隆和鑒定

mp1基因突變位于距離起始密碼子1058bp處，堿基c突變?yōu)閠。為了驗(yàn)證測(cè)序的結(jié)果，對(duì)cucurbitgenomicsdatabase中編號(hào)為csa7m435510.1基因的cdna進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)編碼區(qū)cdna的胞嘧啶(c-1058)突變?yōu)樾叵汆奏?t)，造成編碼的絲氨酸(ser-353)突變?yōu)楸奖彼?phe)，與測(cè)序結(jié)果相符，證實(shí)該基因的突變導(dǎo)致植株微型化，定名為基因mp1。

mp1基因全長(zhǎng)cdna的獲得：

黃瓜長(zhǎng)春密刺和mp1葉片總rna的提取采用trizol方法，并在25℃條件下進(jìn)行dna消化30分鐘，從總rna中吸取2mg為模板采用takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒primescript^tmrtreagentkit合成第一鏈cdna。以此cdna為模板，用引物csa7m435510.1-f(5’-atggggagcaatacactggtg-3’)和引物csa7m435510.1-r(5’-tgcagacccaaattctgaaaac-3’)采用takara公司的高保真酶gxldnapolymerase進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體積26ul，其中含有：

用雙蒸水補(bǔ)足至26ul體積。

反應(yīng)程序如下：98℃，變性1分鐘，然后98℃變性15秒，60℃退火30秒，68℃延伸2分鐘，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后在68℃下延伸5分鐘。

擴(kuò)增產(chǎn)物用omega公司的dna凝膠回收試劑盒按產(chǎn)品說明書進(jìn)行純化，然后純化的產(chǎn)物用rtaq酶(takara)進(jìn)行加a反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體積10ul，其中含有

反應(yīng)程序：72℃連接10分鐘。

將加a后的產(chǎn)物與pmd19-t載體(takara)在16℃下連接4小時(shí)，構(gòu)建重組載體pmd19-mp1。42℃熱擊60秒將重組載體pmd19-mp1轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α(takara)，轉(zhuǎn)化物在含有氨芐青霉素的lb平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，挑取克隆，提取質(zhì)粒，送交genscript測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增到的片段的核苷酸序列如序列表1所示，將該片段命名為mp1基因，mp1基因全長(zhǎng)1566bp，其編碼的氨基酸序列見序列表中序列2所示。