本發(fā)明屬于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于激發(fā)發(fā)射光譜分離同時(shí)測(cè)量受體-供體量子產(chǎn)額之比(qa/qd)與受體-供體消光系數(shù)之比(ka/kd)的方法。

背景技術(shù)：

基于熒光蛋白(fps)的fret顯微術(shù)已經(jīng)成為在活細(xì)胞中研究分子調(diào)控機(jī)制的重要工具。獲得不依賴于檢測(cè)系統(tǒng)和fps表達(dá)水平的定量fret信號(hào)是不同實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行學(xué)術(shù)交流和比較的前提。近年來，我們?cè)趯拡?chǎng)光譜顯微成像系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)了一種基于激發(fā)發(fā)射光譜分離的定量fret測(cè)量技術(shù)(exem-spfret)，能夠同時(shí)克服受體激發(fā)串?dāng)_和供體發(fā)射串?dāng)_[mengyandu,etal.“wide-fieldmicroscopicfretimagingusingsimultaneousspectralunmixingofexcitationandemissionspectra”,opt.express24(14),16037-16051(2016)]。

受體-供體量子產(chǎn)額之比(qa/qd)與受體-供體消光系數(shù)之比(ka/kd)是許多定量fret檢測(cè)技術(shù)必不可少的兩個(gè)重要參量。ka/kd與激發(fā)光源的光譜性質(zhì)、測(cè)量系統(tǒng)激發(fā)通道的傳輸函數(shù)以及供體和受體的吸收光譜有關(guān)。wlodarczyk[wlodarczykj,woehlera,kobef,etal.“analysisoffretsignalsinthepresenceoffreedonorsandacceptors”,biophysicaljournal94(3),986-1000(2008)]等人通過測(cè)量串聯(lián)質(zhì)粒樣本在雙波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)的激發(fā)比來得到ka/kd，該方法要求所有fret測(cè)量過程中系統(tǒng)設(shè)置保持不變。zhang[zhangj,yangf,chail,etal.“spectralmeasurementofacceptor-to-donorextinctioncoefficientratioinlivingcells”,micron68(1),98-106(2015)]等人提出的sp-ecr方法測(cè)量ka/kd時(shí)需要借助一個(gè)fret效率已知的串聯(lián)質(zhì)粒樣本。對(duì)于qa/qd的值，大多數(shù)fret相關(guān)研究都是通過引用文獻(xiàn)中報(bào)道的熒光基團(tuán)的量子產(chǎn)額值得到。但是實(shí)際上qa/qd不僅與供體、受體熒光基團(tuán)的光學(xué)性質(zhì)有關(guān)，還與熒光基團(tuán)所處的環(huán)境以及測(cè)量系統(tǒng)發(fā)射通道的光譜響應(yīng)性能有關(guān)。所以，在給定的測(cè)量系統(tǒng)上同時(shí)且準(zhǔn)確測(cè)得qa/qd和ka/kd的值是多種定量fret檢測(cè)的前提條件。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于激發(fā)發(fā)射光譜分離同時(shí)測(cè)量受體-供體量子產(chǎn)額之比(qa/qd)與受體-供體消光系數(shù)之比(ka/kd)的方法。該方法利用2種或2種以上受體個(gè)數(shù)與供體個(gè)數(shù)比值相同且fret效率不同的供體-受體串聯(lián)樣本同時(shí)測(cè)量qa/qd和ka/kd。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

分別獲得單轉(zhuǎn)供體樣本、單轉(zhuǎn)受體樣本以及2種或2種以上受體個(gè)數(shù)與供體個(gè)數(shù)比值相同且fret效率不同的供體-受體串聯(lián)樣本。通過線性分離供體-受體串聯(lián)樣本的激發(fā)發(fā)射光譜可以快速測(cè)定在給定的測(cè)量系統(tǒng)條件下qa/qd和ka/kd值，并且無需測(cè)量供體-受體串聯(lián)樣本的fret效率。

一種基于激發(fā)發(fā)射光譜分離同時(shí)測(cè)量受體-供體量子產(chǎn)額之比(qa/qd)與受體-供體消光系數(shù)之比(ka/kd)的方法，包括以下步驟：

(1)測(cè)量2種或2種以上受體個(gè)數(shù)與供體個(gè)數(shù)比值(na/nd)相同且fret效率不同的供體-受體串聯(lián)樣本的激發(fā)發(fā)射光譜(sda[i])，并將sda[i]按照三個(gè)激發(fā)發(fā)射光譜基矢進(jìn)行線性分離得到三個(gè)權(quán)重因子wd[i]，wa[i]和ws[i]；其中下標(biāo)i表示第i種供體-受體串聯(lián)樣本，i≥2；

(2)根據(jù)步驟(1)得到的wd[i]、wa[i]和ws[i]計(jì)算wa[i]/wd[i]和ws[i]/wd[i]的值；

(3)以wa/wd為自變量，ws/wd為因變量，線性擬合步驟(2)中得到的wa[i]/wd[i]、ws[i]/wd[i]，線性方程的斜率與na/nd的乘積的倒數(shù)即為ka/kd，線性方程的截距的絕對(duì)值即為qa/qd。

步驟(1)中所述的三個(gè)激發(fā)發(fā)射光譜基矢分別為供體的激發(fā)發(fā)射光譜基矢sd、受體的激發(fā)發(fā)射光譜基矢sa、供受體敏化的激發(fā)發(fā)射光譜基矢ss；

步驟(1)中所述的wd[i]為供體激發(fā)發(fā)射光譜所占權(quán)重，wa[i]為受體激發(fā)發(fā)射光譜所占權(quán)重，ws[i]為供受體敏化激發(fā)發(fā)射光譜所占權(quán)重；

步驟(1)中所述的供體-受體串聯(lián)樣本適用于所有串聯(lián)質(zhì)粒的供體-受體串聯(lián)樣本，其中受體個(gè)數(shù)與供體個(gè)數(shù)比值(na/nd)優(yōu)選為0.5～3；最優(yōu)選為1：1。

具體包括以下步驟：

(1)獲得單轉(zhuǎn)供體樣本和單轉(zhuǎn)受體樣本，測(cè)量供體的激發(fā)發(fā)射光譜基矢sd，受體的激發(fā)發(fā)射光譜基矢sa，以及供受體敏化的激發(fā)發(fā)射光譜基矢ss；

(2)獲得2種或2種以上受體個(gè)數(shù)與供體個(gè)數(shù)比值(na/nd)相同且fret效率不同的供體-受體串聯(lián)樣本，測(cè)量供體-受體串聯(lián)樣本的激發(fā)發(fā)射光譜(sda[i])，并將sda[i]按照三個(gè)激發(fā)發(fā)射光譜基矢進(jìn)行線性分離，得到三個(gè)權(quán)重因子wd[i]，wa[i]和ws[i]；

sda[i]＝wd[i]sd+ws[i]ss+wa[i]sa(2)

(3)根據(jù)步驟(2)得到的wd[i]、wa[i]和ws[i]計(jì)算wa[i]/wd[i]和ws[i]/wd[i]的值。

(4)以wa/wd為自變量，ws/wd為因變量線性擬合步驟(3)得到的wa[i]/wd[i]、ws[i]/wd[i]，線性方程的斜率與na/nd的乘積的倒數(shù)即為ka/kd，線性方程的截距的絕對(duì)值即為qa/qd。其中，wa/wd、ws/wd、ka/kd和qa/qd四者滿足如下關(guān)系：

為了更好的闡述本發(fā)明，下面以一個(gè)測(cè)量qa/qd和ka/kd的實(shí)例進(jìn)行說明：

給定的供體-受體串聯(lián)樣本(na/nd＝1)：供體為cerulean(簡(jiǎn)稱c)，受體為venus(簡(jiǎn)稱v)。

供體-受體串聯(lián)樣本c32v：由32個(gè)氨基酸的連接序列將c和v鏈接組成的供體-受體串聯(lián)樣本。

供體-受體串聯(lián)樣本c17v：由17個(gè)氨基酸的連接序列將c和v鏈接組成的供體-受體串聯(lián)樣本。

供體-受體串聯(lián)樣本ctv：由229個(gè)氨基酸的連接序列將c和v鏈接組成的供體-受體串聯(lián)樣本。

具體測(cè)量過程如下：

(1)在人的肝癌細(xì)胞(hepg2細(xì)胞)中單獨(dú)轉(zhuǎn)染并表達(dá)供體c和受體v，以及供體-受體串聯(lián)樣本c32v、c17v和ctv；

(2)用寬場(chǎng)熒光顯微鏡和相機(jī)測(cè)量c和v的激發(fā)譜和發(fā)射譜。選擇436±10nm和470±10nm兩個(gè)激發(fā)波段作為激發(fā)光；選擇470±10nm，490±10nm，510±10nm，530±10nm，550±10nm和585±20nm六個(gè)發(fā)射波段作為探測(cè)通道。經(jīng)過測(cè)量和計(jì)算可以得到歸一化的c的激發(fā)譜和發(fā)射譜以及歸一化的v的激發(fā)譜和發(fā)射譜

(3)根據(jù)和的外積得到供體的激發(fā)發(fā)射光譜基矢(sd)，和的外積得到受體的激發(fā)發(fā)射光譜基矢(sa)，以及和的外積得到供受體敏化的激發(fā)發(fā)射光譜基矢(ss)：

(4)測(cè)量供體-受體串聯(lián)樣本c32v、c17v和ctv的激發(fā)發(fā)射光譜(sda[i])。用436±10nm的激發(fā)光分別激發(fā)每個(gè)供體-受體串聯(lián)樣本，分別得到發(fā)射通道470±10nm，490±10nm，510±10nm，530±10nm，550±10nm和585±20nm下每個(gè)供體-受體串聯(lián)樣本的熒光強(qiáng)度；再用470±10nm的激發(fā)光分別激發(fā)每個(gè)供體-受體串聯(lián)樣本，分別得到發(fā)射通道510±10nm、530±10nm、550±10nm和585±20nm下每個(gè)供體-受體串聯(lián)樣本的熒光強(qiáng)度，從而得到每個(gè)供體-受體串聯(lián)樣本的激發(fā)發(fā)射光譜(sda[i])。

(5)根據(jù)公式(2)將sda[i]按照三個(gè)激發(fā)發(fā)射光譜基矢進(jìn)行線性分離，得到三個(gè)權(quán)重因子wd[i]、wa[i]和ws[i]。

sda[i]＝wd[i]sd+ws[i]ss+wa[i]sa(2)

(6)以wa/wd為自變量，ws/wd為因變量，線性擬合3個(gè)供體-受體串聯(lián)樣本的wa[i]/wd[i]，ws[i]/wd[i]，線性方程的斜率的倒數(shù)即為ka/kd，線性方程的截距的絕對(duì)值即為qa/qd。

本發(fā)明的基本原理如下：

(1)對(duì)于一個(gè)既含有自由的供體和自由的受體，又含有供體-受體對(duì)的fret樣本其激發(fā)發(fā)射光譜為如下四種激發(fā)發(fā)射光譜的線性組合：自由供體的激發(fā)發(fā)射光譜、與受體結(jié)合成對(duì)的供體的激發(fā)發(fā)射光譜、供受體敏化的激發(fā)發(fā)射光譜和直接激發(fā)受體的激發(fā)發(fā)射光譜。如公式(3)所示。

其中，e是fret樣本中成對(duì)的供體-受體的fret效率；cd是fret樣本中自由的供體的濃度；cda是成對(duì)的供體-受體的濃度；是fret樣本中受體的總濃度；

(2)簡(jiǎn)化公式(3)可得：

其中，為fret中供體的總濃度并且有：

(3)按受體濃度歸一化的表觀fret效率(ea)和按供體濃度歸一化的表觀fret效率(ed)可以表示為：

(4)聯(lián)立公式(5)和公式(6)可得：

(5)對(duì)于受體個(gè)數(shù)與供體個(gè)數(shù)比值為na/nd的供體-受體串聯(lián)樣本，有ea×na＝ed×nd，則公式(7)可以寫為：

(6)測(cè)量2種或2種以上受體個(gè)數(shù)與供體個(gè)數(shù)比值(na/nd)相同且fret效率不同的供體-受體串聯(lián)樣本可以得到多組wa/wd，ws/wd。以wa/wd為自變量，ws/wd為因變量對(duì)多組wa/wd，ws/wd進(jìn)行線性擬合，擬合得到線性方程的斜率與na/nd的乘積的倒數(shù)即為ka/kd，線性方程的截距的絕對(duì)值即為qa/qd。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

本發(fā)明是一種同時(shí)測(cè)量作為供體的熒光基團(tuán)和作為受體的熒光基團(tuán)在給定的測(cè)量系統(tǒng)條件下的qa/qd和ka/kd的方法，具有測(cè)量過程簡(jiǎn)單、測(cè)量時(shí)間短和測(cè)量結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明適用于不同的檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)于活細(xì)胞fret定量檢測(cè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值，必將極大地提高活細(xì)胞fret檢測(cè)的成功率，從而推動(dòng)fret定量檢測(cè)技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1是供體(sd)和受體(sa)以及供受體敏化(ss)的激發(fā)發(fā)射光譜基矢；其中，(a)左圖為單轉(zhuǎn)c和v的激發(fā)光譜圖像；白色區(qū)域?yàn)樗x發(fā)熒光的細(xì)胞區(qū)域(cell)，灰色區(qū)域?yàn)樗x背景區(qū)域(bg)；(a)右圖為根據(jù)(a)左圖單轉(zhuǎn)c和v對(duì)應(yīng)的白色區(qū)域的平均光強(qiáng)減去灰色區(qū)域的平均光強(qiáng)得到的激發(fā)熒光光強(qiáng)譜；(b)左圖為單轉(zhuǎn)c和v的發(fā)射光譜圖像；白色區(qū)域?yàn)樗x發(fā)熒光的細(xì)胞區(qū)域(cell)，灰色區(qū)域?yàn)樗x背景區(qū)域(bg)；(b)右圖為根據(jù)(b)左圖單轉(zhuǎn)c和v對(duì)應(yīng)的白色區(qū)域的平均光強(qiáng)減去灰色區(qū)域的平均光強(qiáng)得到的發(fā)射熒光光強(qiáng)譜；(c)左圖是歸一化的供體和受體的激發(fā)譜，(c)右圖是歸一化的供體和受體的發(fā)射譜；(d)是供體(sd)、受體(sa)和供受體敏化(ss)激發(fā)發(fā)射光譜基矢。

圖2是利用供體-受體串聯(lián)樣本c32v測(cè)量三個(gè)權(quán)重系數(shù)的比值wa[1]/wd[1]、ws[1]/wd[1]；其中，(a)上圖是表達(dá)c32v在hepg2細(xì)胞中的激發(fā)發(fā)射光譜圖像；(a)中、下圖分別是對(duì)應(yīng)的wa[1]/wd[1]、ws[1]/wd[1]的偽彩圖和柱形圖；(b)是以wa/wd為自變量，ws/wd為因變量線性擬合c32v、c17v和ctv的wa[i]/wd[i]、ws[i]/wd[i](i＝1，2，3)的平均值得到的線性方程表達(dá)式。其中線性方程的斜率的倒數(shù)即為ka/kd，線性方程的截距的絕對(duì)值即為qa/qd。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

1、質(zhì)粒來源

供體質(zhì)粒cerulean(c)、受體質(zhì)粒為venus(v)與fret參照質(zhì)粒c32v、c17v和ctv均購于美國addgene質(zhì)粒庫。

2.寬場(chǎng)光譜顯微成像系統(tǒng)

寬場(chǎng)熒光顯微鏡產(chǎn)自日本奧林巴斯公司，型號(hào)為ix73。光源是日本奧林巴斯hglgps系列的汞燈。物鏡是放大倍數(shù)為40、數(shù)值孔徑為1.3(40×1.3na)的油鏡，一個(gè)裝有四個(gè)激發(fā)片的激發(fā)轉(zhuǎn)輪，一個(gè)裝有八個(gè)cube(每個(gè)cube中可安裝激發(fā)片、分光片、發(fā)射片各一個(gè))的轉(zhuǎn)輪，一個(gè)裝有六個(gè)發(fā)射片的電動(dòng)發(fā)射轉(zhuǎn)輪，外接一個(gè)ccd相機(jī)。激發(fā)光波長(zhǎng)通過轉(zhuǎn)動(dòng)激發(fā)轉(zhuǎn)輪進(jìn)行選擇。

3、細(xì)胞培養(yǎng)以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

hepg2細(xì)胞來自中國廣州暨南大學(xué)，用dmem培養(yǎng)基加入10％的新生牛血清放在含有5％二氧化碳的37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞用胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時(shí)后，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70～90％時(shí)，用體外轉(zhuǎn)染試劑turbofect^tm將質(zhì)粒短暫轉(zhuǎn)入細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染的具體步驟：(1)取兩只滅菌的ep管，每個(gè)ep管中先加入40μl無血清的dmem，然后向一只ep管中加入1～2μl的轉(zhuǎn)染試劑，另一只ep管中加入1～2μl(500～600ng/μl)的質(zhì)粒，靜置5分鐘；(2)5分鐘后，將兩只ep管混勻，輕輕吹打6～8次后靜置20分鐘，(3)20分鐘后，將420μl的無血清的dmem加入到剛剛混勻的ep管中，輕輕混勻；(4)用無血清的dmem培養(yǎng)基或pbs清洗培養(yǎng)皿中細(xì)胞2～3次，主要洗去死細(xì)胞等臟污，然后把上述的(3)中的混合物移到培養(yǎng)皿中，把培養(yǎng)皿重新放回培養(yǎng)箱中4～6小時(shí)；(5)4～6小時(shí)后，吸去轉(zhuǎn)染液，然后用用無血清的dmem培養(yǎng)基或pbs清洗培養(yǎng)皿中細(xì)胞2～3次，再往培養(yǎng)皿中加入含有新生牛血清的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48小時(shí)即可用于實(shí)驗(yàn)。

4.測(cè)量供體-受體串聯(lián)樣本

4.1分別單轉(zhuǎn)c樣本、v樣本以及供體-受體串聯(lián)樣本ctv、c17v和c32v，測(cè)量每種供體-受體串聯(lián)樣本中三個(gè)激發(fā)發(fā)射光譜各占的權(quán)重因子wd[i]，wa[i]和ws[i]。

測(cè)量三個(gè)激發(fā)發(fā)射光譜基矢。將載有單獨(dú)表達(dá)供體c和受體v的hepg2細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于載物臺(tái)，選擇405±10nm、436±10nm、470±10nm和480±10nm四個(gè)激發(fā)波段作為激發(fā)光，470±10nm，490±10nm，510±10nm，530±10nm，550±10nm和585±20nm六個(gè)發(fā)射波段作為探測(cè)通道，測(cè)得c和v的激發(fā)譜(圖1(a))以及c和v的發(fā)射譜(圖1(b))。歸一化后得到的c的激發(fā)譜(圖1(c)左)和發(fā)射譜(圖1(c)右)；

將和代入公式(1)計(jì)算出供體的激發(fā)發(fā)射光譜基矢(sd)，受體的激發(fā)發(fā)射光譜基矢(sd)和供受體敏化的激發(fā)發(fā)射光譜基矢(ss)，如圖1(d)所示。

利用供體-受體串聯(lián)樣本c32v、c17v和ctv測(cè)量三個(gè)激發(fā)發(fā)射光譜各占的權(quán)重因子wd[i]，wa[i]和ws[i]。其中測(cè)得供體-受體串聯(lián)樣本c32v的激發(fā)發(fā)射光譜(sda[1])圖像(如圖2(a)上圖所示)，將sda[1]按照三個(gè)激發(fā)發(fā)射光譜基矢進(jìn)行線性分離，得到三個(gè)權(quán)重因子wd[1]，wa[1]和ws[1]。并通過計(jì)算得到wa[1]/wd[1]、ws[1]/wd[1]的值。圖2(a)中、下分別為對(duì)應(yīng)的wa[1]/wd[1]、ws[1]/wd[1]的偽彩圖和柱形圖。統(tǒng)計(jì)14個(gè)視野大概36個(gè)細(xì)胞得到wa[1]/wd[1]＝0.699±0.014、ws[1]/wd[1]＝0.737±0.033；同樣的方法測(cè)量c17v，統(tǒng)計(jì)13個(gè)視野大概32個(gè)細(xì)胞得到wa[2]/wd[2]＝0.786±0.027、ws[2]/wd[2]＝1.109±0.040；測(cè)量ctv，統(tǒng)計(jì)4個(gè)視野，大概14個(gè)細(xì)胞得到wa[3]/wd[3]＝0.498±0.002、ws[3]/wd[3]＝3.77×10^-6±7.33×10^-6。以wa/wd為自變量，ws/wd為因變量(i＝1，2，3)，線性擬合wa[i]/wd[i]、ws[i]/wd[i]。得到的線性方程表達(dá)式如圖2(b)所示，其中線性方程的斜率的倒數(shù)即ka/kd＝1/3.850，線性方程的截距的絕對(duì)值即qa/qd＝1.925。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。