本發(fā)明涉及一種金磁納米顆粒的制備方法，及其在表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測(cè)河豚毒素中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

河豚毒素(tetrodotoxin，ttx)是鲀魚類(俗稱河豚魚)及其他生物體內(nèi)含有的一種生物堿。其分子式為c11h17o8n3，分子量為319。為氨基全氫喹唑啉型化合物，是自然界中所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的神經(jīng)毒素之一，曾一度被認(rèn)為是自然界中毒性最強(qiáng)的非蛋白類毒素。0.5mg即可致人于死命。河豚毒素化學(xué)性質(zhì)和熱性質(zhì)均很穩(wěn)定，只有高溫加熱30min以上或在堿性條件下才能被分解。

目前河豚毒素的檢測(cè)方法主要有小白鼠生物法、液相色譜法、薄層色譜法、免疫學(xué)方法等。小白鼠生物法雖然能準(zhǔn)確、穩(wěn)定的測(cè)出河豚毒素，并且是日本法定的測(cè)定ttx含量的方法，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且重復(fù)性差，缺乏特異性。而液相色譜法較多的被用于定量檢測(cè)河豚毒素，但是檢測(cè)之前需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜耗時(shí)的前處理，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。薄層色譜法則操作簡(jiǎn)單，但靈敏度過低，無(wú)法進(jìn)行定量檢測(cè)分析。免疫學(xué)方法中抗血清制備方法叫簡(jiǎn)單，但因?yàn)閱慰寺】贵w的特異性較差，可能會(huì)存在交叉反應(yīng)所以會(huì)對(duì)河豚毒素的定量檢測(cè)有較大影響。

表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhancedramanspectroscopy，sers)是一種具有表面選擇性的增強(qiáng)效應(yīng)，在表面科學(xué)、分析科學(xué)和生物科學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，從而發(fā)展成一種新型的快速分析方法。fleischmann等人于1974年對(duì)光滑銀電極表面進(jìn)行粗糙化處理后，第一次得到吸附在銀電極表面上單分子層吡啶分子的拉曼光譜。隨后van等人通過系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)與計(jì)算，發(fā)現(xiàn)此信號(hào)相比于拉曼散射信號(hào)增強(qiáng)約6個(gè)數(shù)量級(jí)，指出這是一種與粗糙表面相關(guān)的表面增強(qiáng)效應(yīng)，被稱為sers效應(yīng)。表面信號(hào)增強(qiáng)10⁶倍相當(dāng)于表面單層分子放大成為100萬(wàn)層，因?yàn)閟ers能有效地避免溶液相中相同物種的信號(hào)干擾，輕而易舉地獲取高質(zhì)量的表面分子信號(hào)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于研究制備一種新的fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒，該顆粒能在外磁場(chǎng)中快速分離，表面包覆具良好表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)的金納米顆粒。以該金磁納米顆粒作為sers檢測(cè)的基底，將檢測(cè)樣品快速濃縮，提高檢測(cè)靈敏度。并利用該金磁納米顆粒與表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)快速檢測(cè)河豚毒素。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒，其特征在于所述fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒按以下方法制備：先以fe3o4納米顆粒為起始物，加入teos在fe3o4表面形成sio2外殼，再加入aptes以及mptes對(duì)sio2外殼表面進(jìn)行功能化，得到表面帶-nh2和-sh的fe3o4/sio2納米顆粒；同時(shí)用檸檬酸鈉還原h(huán)aucl4溶液得到粒徑均勻分布的au納米顆粒；將au納米顆粒加入表面帶-nh2和-sh的fe3o4/sio2納米顆粒，通過-nh2的靜電吸附和au-s鍵的作用進(jìn)一步將au納米顆粒致密地組裝在fe3o4/sio2表面，形成具有核殼結(jié)構(gòu)的fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒，再加入teos和aptes，最終得到所述的fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述的fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒，具體制備方法包括以下步驟：

(1)表面帶-nh2和-sh的fe3o4/sio2納米顆粒的制備：將fe3o4納米顆粒用含乙醇、氨水的水溶液a分散，所述含乙醇、氨水的水溶液a中乙醇、氨水與水體積比例為45～55:1:10，所述fe3o4納米顆粒在所述含乙醇、氨水的水溶液a中質(zhì)量濃度為0.02％-0.04％，在ph＝9～11的條件下超聲5-10min，加入teos，在超聲下反應(yīng)6～8h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，先后用無(wú)水乙醇、水洗滌，用含乙醇、氨水的水溶液a分散，超聲5-10min，再加入aptes與mptes，在超聲作用下反應(yīng)16-18h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，得到表面帶-nh2和-sh的fe3o4納米顆粒，再依次用無(wú)水乙醇、水洗滌，最后分散在水中待用；所述teos的體積用量以fe3o4納米顆粒的質(zhì)量計(jì)為1.5～2.5ml/g；所述teos與aptes、mptes體積比為1.5～2.5:1:1；

(2)au納米顆粒的制備：將水加熱至95～101℃，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％～6％檸檬酸鈉溶液，15～25s后加入10mg/ml～12mg/ml氯金酸水溶液，保持100℃至反應(yīng)結(jié)束后停止加熱，攪拌下自然冷卻，冷卻至室溫后離心分離，收集下層顆粒，分散至水中待用；所述檸檬酸鈉溶液與水、氯金酸水溶液的體積比為1:500:10～12；

(3)fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒的制備：取步驟(1)所得顆粒溶液與步驟(2)顆粒溶液，步驟(1)所得顆粒溶液中表面帶-nh2和-sh的fe3o4納米顆粒與步驟(2)中au納米顆粒的質(zhì)量比為1:5～6，混合后反應(yīng)6～8h，然后磁分離后棄去上清液，用水洗滌，重復(fù)上述反應(yīng)再分離洗滌過程，最后分散于水中，得到fe3o4納米顆粒表面完全包覆au納米顆粒的金磁納米顆粒，即fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒；再用水洗滌后磁分離收集，用含乙醇、氨水的水溶液b分散，所述含乙醇、氨水的水溶液b中水、氨水與乙醇的體積比例為10:1:60～80，所述fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒在含乙醇、氨水的水溶液b中質(zhì)量濃度為0.029％-0.035％，超聲震蕩5-10min，緩慢加入teos，在超聲環(huán)境下反應(yīng)6～8h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，即fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒，用水洗滌，再用所述含乙醇、氨水的水溶液b分散，所述fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒在含乙醇、氨水的水溶液b中質(zhì)量濃度為0.029％-0.038％，超聲振蕩5-10min，再加入aptes，在超聲振蕩作用下反應(yīng)16～18h，反應(yīng)結(jié)束后用水洗滌，得到所述fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒；所述teos的體積用量以fe3o4/sio2/au納米顆粒的質(zhì)量計(jì)為2.1～2.4ml/g；所述aptes與teos體積比為3:1.5～2.5。進(jìn)一步，本發(fā)明步驟(3)中所述步驟(1)所得顆粒與步驟(2)顆粒混合推薦采用攪拌方式實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明還提供所述的fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測(cè)河豚毒素的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述的fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測(cè)河豚毒素方法為：

(a)拉曼光譜基底制備

將fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒與nhs-peg-nhs在ph＝7.4磷酸鹽緩沖液中反應(yīng)，再與河豚毒素抗體反應(yīng)得到金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體；所述nhs-peg-nhs的體積用量以fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒的質(zhì)量計(jì)為1ml/mg～1.5ml/mg；所述河豚毒素抗體的體積用量以fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒的質(zhì)量計(jì)為0.1ml/mg～0.2ml/mg；

將羅丹明b拉曼染料與河豚毒素抗體在ph＝8.3的nahco3緩沖液反應(yīng)得到rhb修飾后的河豚毒素抗體；所述羅丹明b拉曼染料的用量以河豚毒素抗體的體積用量計(jì)為0.50mg/ml～0.55mg/ml；

(b)建立水中河豚毒素檢測(cè)的工作曲線

金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體與rhb修飾后的河豚毒素抗體混合后磁分離，所述rhb修飾后的河豚毒素抗體與金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體的體積用量比為1:5～10；并轉(zhuǎn)移至凹面載玻片上，通過激光拉曼光譜儀直接照射得到羅丹明rhb的拉曼光譜圖；

取與上述步驟等量的金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體、rhb修飾后的河豚毒素抗體，與河豚毒素配制成具有梯度的0.01～0.5μg/ml濃度范圍的河豚毒素溶液，測(cè)量其拉曼光譜圖，與羅丹明rhb的拉曼光譜圖比較得河豚毒素存在時(shí)，rhb有1510cm^-1的特征峰，以1510cm^-1處的rhb特征峰的峰強(qiáng)對(duì)河豚毒素濃度進(jìn)行雙對(duì)數(shù)作圖，獲得水中快速檢測(cè)河豚毒素的工作曲線；

(c)水中河豚毒素樣品的檢測(cè)

將樣品與步驟(c)中等量的金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體、rhb修飾后的河豚毒素抗體配置成溶液，測(cè)量其拉曼光譜圖，如出現(xiàn)1510cm^-1處的rhb特征峰，讀取其峰強(qiáng)，代入步驟(b)中所得工作曲線可計(jì)算出溶液中河豚毒素的濃度，即可計(jì)算出樣品中河豚毒素的濃度；如未出現(xiàn)1510cm^-1處的rhb特征峰，說明樣品中河豚毒素的量極微少或不存在。

具體地，本發(fā)明所述的fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測(cè)河豚毒素方法為：

(a)稱取1mgnhs-peg-nhs,溶于1mlph＝7.4的磷酸鹽緩沖液(pbs)中，與1mlfe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆?；旌希袷幏磻?yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，用pbs洗滌金磁納米顆粒，再次磁分離；用2mlpbs將收集到的顆粒分散，加入0.1ml1mg/ml河豚毒素抗體溶液，室溫下振蕩反應(yīng)6h；反應(yīng)結(jié)束后保存在4℃冰箱中備用，得到金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體；

取50μg羅丹明b拉曼染料溶于0.2mlph＝8.3的nahco3緩沖液中；再加入0.1ml1mg/ml的河豚毒素抗體；混勻后室溫下振蕩反應(yīng)6h；反應(yīng)結(jié)束后用nahco3緩沖液透析混合液，除去多余的羅丹明b拉曼染料，得到rhb修飾后的河豚毒素抗體；

(b)取金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體50μlrhb修飾后的河豚毒素抗體10μl，與河豚毒素配制成濃度為0.5μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml時(shí)的拉曼光譜圖，以1510cm^-1處的rhb特征峰的峰強(qiáng)對(duì)河豚毒素濃度進(jìn)行雙對(duì)數(shù)作圖，獲得水中快速檢測(cè)河豚毒素的工作曲線；ttx濃度在0.5μg/ml至0.01μg/ml范圍內(nèi)，1510cm^-1處拉曼峰強(qiáng)的對(duì)數(shù)與河豚毒素濃度的對(duì)數(shù)線性關(guān)系良好，線性方程為ini1510＝9.34725incttx+0.89229，其中l(wèi)ni1510為1510cm^-1處拉曼峰強(qiáng)的對(duì)數(shù)，lncttx為河豚毒素濃度的對(duì)數(shù)，r＝0.9959；

(c)將樣品與金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體50μlrhb修飾后的河豚毒素抗體10μl配置成溶液，測(cè)量其拉曼光譜圖，如出現(xiàn)1510cm^-1處的rhb特征峰，讀取其峰強(qiáng)，代入步驟(b)中所得工作曲線可計(jì)算出溶液中河豚毒素的濃度，即可計(jì)算出樣品中河豚毒素的濃度；如未出現(xiàn)1510cm^-1處的rhb特征峰，說明樣品中河豚毒素的量極微少或不存在。

文中，teos為四乙氧基硅烷，aptes為3-氨丙基三乙氧基硅烷，mptes為3-巰丙基三乙氧基硅烷，nhs-peg-nhs為活性酯聚乙二醇活性酯，rhb為羅丹明b。

從fe3o4磁納米顆粒到fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒，其質(zhì)量變化很微小，因此本發(fā)明計(jì)算時(shí)認(rèn)為所有磁納米顆粒質(zhì)量不變。

本發(fā)明的有益效果為：

1.fe3o4/sio2/au/sio2/nh2磁納米顆粒能在外磁場(chǎng)中快速分離，在其表面包覆具有良好表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)的金納米顆粒并使用這種金磁納米顆粒作為sers檢測(cè)的基底，且改善制備方法，使得制備的金納米顆粒可以更好地與無(wú)定形二氧化硅包覆層表面結(jié)合，不但使樣品易于分離，省去傳統(tǒng)離心沉淀或過柱分離的復(fù)雜過程，還能將樣品快速濃縮，從而提高檢測(cè)靈敏度。

2.金納米顆粒能包覆在fe3o4/sio2納米顆粒的表面，并且結(jié)合地非常緊密。從不同分辨率下fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒的tem圖像與edx分析可以證明，fe3o4/sio2磁性納米顆粒的粒徑較大，在顆粒的邊界可以看到一層明顯的無(wú)定形sio2的包覆層，且在磁性粒子的表面吸附了大量au納米顆粒，吸附的au納米顆粒十分均勻，粒徑在40nm左右，呈球形。金納米顆粒緊密的包覆在fe3o4/sio2納米顆粒的表面，克服了傳統(tǒng)方法中金納米顆粒包覆不上且包覆不緊密的缺點(diǎn)，在檢測(cè)過程中可以大大提高檢測(cè)靈敏度，如圖1、圖2所示。

3.確定了氨基修飾的最佳方案，使得金納米顆粒能夠緊密地吸附在sio2包覆的fe3o4納米顆粒表面，即能防止金納米顆粒的聚集，又能使金納米顆粒均勻的吸附在fe3o4表面，表現(xiàn)出良好的磁分離效果，如圖3所示。

4.確定了fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒的最佳組裝方式，使得實(shí)驗(yàn)制備的金磁納米顆粒整體包覆均勻，磁納米顆粒表面吸附的金納米顆粒分散的較好。在相同檢測(cè)情況下，能夠收集到較強(qiáng)的sers信號(hào)，如圖4所示。

5.確定teos的最佳用量，使得無(wú)定形sio2層的厚度適中，既能提供較大的比表面積以及保護(hù)fe3o4納米顆粒不被氧化和相互聚集，又不會(huì)使二氧化硅層包覆過厚，導(dǎo)致fe3o4/sio2納米顆粒磁性降低；并且既能達(dá)到較好的包覆率增加檢測(cè)時(shí)的增強(qiáng)效果又能達(dá)到較為高的金納米粒子利用率，如圖5所示。

6.fe3o4/sio2納米顆粒溶液以及fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒溶液在室溫下十分穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間放置(3個(gè)月)分散性依然良好，可以利用磁濃縮效應(yīng)提高其sers檢測(cè)靈敏度，如圖6、圖7所示。

7.在檢測(cè)體系中存在河豚毒素時(shí)，fe3o4/au/antittx基底與rhb/antittx上的ttx抗體會(huì)與河豚毒素發(fā)生抗原抗體特異性結(jié)合，將fe3o4/au/antittx基底與rhb/antittx間的距離拉近，從而使基底上的au納米顆粒與rhb染料分子的距離拉近，產(chǎn)生較強(qiáng)的sers增強(qiáng)效應(yīng)，從而提高了檢測(cè)的靈敏度和選擇性，降低了檢測(cè)背景的干擾，相比于其它檢測(cè)手段(如高效液相色譜、質(zhì)譜、薄層色譜等)，拉曼光譜技術(shù)更加簡(jiǎn)單便捷、易應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，如圖8、圖9所示。

8.以fe3o4/au/antittx金磁納米顆粒為拉曼基底快速檢測(cè)河豚毒素。將合成的金磁納米顆粒溶液與河豚毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制一系列不同金磁納米顆粒濃度與河豚毒素濃度的溶液，將這些溶液用移液槍轉(zhuǎn)移到凹面載玻片上，并于凹面載玻片下用一圓形釹鐵硼磁鐵將金磁納米顆粒聚集成點(diǎn)，在激光拉曼光譜儀的照射下，讀取河豚毒素的相關(guān)特征峰及譜圖，并繪制快速檢測(cè)河豚毒素的工作曲線，單個(gè)樣品的測(cè)試時(shí)間小于10分鐘，如圖10所示。

附圖說明

圖1：不同分辨率下實(shí)施例2的fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒的tem圖像。

圖2：實(shí)施例2的fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒的edx譜圖。

圖3：實(shí)施例3不同基團(tuán)修飾后得到的fe3o4/sio2/au納米顆粒的圖片(a、c、e)與tem圖像(b、d、f)。圖3(a)、(e)對(duì)應(yīng)實(shí)施例2的步驟(1)所得(1)表面帶-nh2和-sh的fe3o4/sio2納米顆粒，圖3(c)、(d)對(duì)應(yīng)實(shí)施例3(a)所得只修飾-nh2的fe3o4/sio2磁性納米顆粒，圖3(e)、(f)對(duì)應(yīng)實(shí)施例3(b)只修飾-sh的fe3o4/sio2磁性納米顆粒。

圖4分別為實(shí)施例4(a)攪拌方式、(b)振蕩方式、(c)超聲方式得到的fe3o4/sio2/au納米顆粒tem圖像(a、c、e)與相應(yīng)拉曼圖譜(b、d、f)。

圖5：實(shí)施例5不同量(3μl、4.5μl、6μl)的teos條件下得到產(chǎn)物fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒的tem圖像(a、c、e)與相應(yīng)拉曼圖譜(b、d、f)。μl圖6：實(shí)施例2制備的fe3o4/sio2納米顆粒溶液以及fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒溶液:未分離時(shí)圖示。在室溫下十分穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間放置(3個(gè)月)后分散性依然良好。

圖7：用一釹鐵硼外磁體(直徑25mm×厚度20mm)對(duì)實(shí)施例2制備的fe3o4/sio2、fe3o4/sio2/au納米顆粒溶液進(jìn)行濃縮實(shí)驗(yàn)，在30s之內(nèi)即可完成濃縮分離，說明包覆了au納米顆粒的fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒仍具有良好的磁學(xué)效應(yīng)，可以利用磁濃縮效應(yīng)提高其sers檢測(cè)靈敏度。

圖8：為應(yīng)用實(shí)施例1中未添加河豚毒素時(shí)的空白對(duì)照組的拉曼光譜圖。

圖9：為fe3o4/au/antittx金磁納米顆粒為拉曼基底測(cè)得ttx濃度為0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml、0.005μg/ml的拉曼圖。

圖10：應(yīng)用實(shí)施例1中以fe3o4/au/antittx金磁納米顆粒為拉曼基底檢測(cè)河豚毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

實(shí)施例1

i)表面帶-nh2和-sh的fe3o4/sio2納米顆粒的制備

取4.00mgfe3o4納米顆粒，用蒸餾水洗滌2次，洗完之后磁分離收集，用2ml蒸餾水分散，裝入15ml玻璃瓶中，同時(shí)加入11ml無(wú)水乙醇與0.2ml氨水。在ph＝11的條件下超聲10min，加入8μlteos，在超聲下反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，先后用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗滌兩次，最后在含2ml蒸餾水與11ml無(wú)水乙醇的混合液中分散，加入0.2ml氨水，超聲10min，再加入5.3μlaptes與5.3μlmptes，在超聲作用下反應(yīng)18h。反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，得到表面帶-nh2和-sh的fe3o4納米顆粒，先后用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗滌兩次，最后分散在12ml蒸餾水中待用。

ⅱ)金納米顆粒的制備

稱取12.00mg氯金酸，溶于1.00ml蒸餾水中，備用。在裝有溫度探頭的250ml圓底燒瓶中加入50ml蒸餾水，500rpm磁力攪拌下加熱至101℃，然后一次性加入100μl(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6％)檸檬酸鈉溶液，25s后加入1.0ml溶有10.00mg的氯金酸水溶液，保持101℃至反應(yīng)結(jié)束后停止加熱，攪拌下自然冷卻。冷卻至室溫后12000r/min下離心10min，收集下層顆粒，分散在6ml蒸餾水中待用。

ⅲ)表面帶-nh2的fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒的制備

取4ml步驟(1)修飾后的fe3o4納米顆粒，磁分離后棄去上清液，加入4ml金納米顆粒，混合后反應(yīng)8h。然后磁分離后棄去上清液，用蒸餾水洗滌2次，重復(fù)實(shí)施例(ⅲ)上述過程5次，最后分散在4ml蒸餾水中。得到fe3o4納米顆粒表面完全包覆au納米顆粒的fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒。

取上述制備的金磁納米顆粒4ml，用蒸餾水洗滌兩次，洗完后磁分離收集，用0.5ml水分散，移至10ml玻璃瓶中，同時(shí)加入3.5ml乙醇以及50μl氨水，超聲震蕩10min，緩慢加入3.2μlteos，在超聲環(huán)境下反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，即fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒，用蒸餾水洗滌兩次，再用0.5ml水和4.0ml無(wú)水乙醇分散，加入50μl氨水，超聲振蕩10min，再加入2.6μlaptes，在超聲振蕩作用下反應(yīng)18h。反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水洗滌兩次，最后用蒸餾水分散成4ml，得到表面帶-nh2的fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒。

實(shí)施例2

(1)表面帶-nh2和-sh的fe3o4/sio2納米顆粒的制備

取4.00mgfe3o4納米顆粒，用蒸餾水洗滌2次，洗完之后磁分離收集，用2ml蒸餾水分散，裝入15ml玻璃瓶中，同時(shí)加入9ml無(wú)水乙醇與0.2ml氨水。在ph＝10的條件下超聲5min，加入8μlteos，在超聲下反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，先后用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗滌兩次，最后在含2ml蒸餾水與9ml無(wú)水乙醇的混合液中分散，加入0.2ml氨水，超聲5min，再加入3.2μlaptes與3.2μlmptes，在超聲作用下反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，得到表面帶-nh2和-sh的fe3o4納米顆粒，先后用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗滌兩次，最后分散在12ml蒸餾水中待用。

(2)金納米顆粒的制備

稱取10.00mg氯金酸，溶于1.00ml蒸餾水中，備用。在裝有溫度探頭的250ml圓底燒瓶中加入50ml蒸餾水，500rpm磁力攪拌下加熱至100℃，然后一次性加入100μl(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％)檸檬酸鈉溶液，20s后加入1.00ml溶有10.00mg的氯金酸水溶液，保持95℃至反應(yīng)結(jié)束后停止加熱，攪拌下自然冷卻。冷卻至室溫后12000r/min下離心10min，收集下層顆粒，分散在6ml蒸餾水中待用。

(3)表面帶-nh2的fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒的制備

取4ml步驟(1)修飾后的fe3o4納米顆粒，磁分離后棄去上清液，加入4ml金納米顆粒，混合后反應(yīng)6h。然后磁分離后棄去上清液，用蒸餾水洗滌2次，重復(fù)實(shí)施例(3)上述過程5次，最后分散在4ml蒸餾水中。得到fe3o4納米顆粒表面完全包覆au納米顆粒的fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒。

取上述制備的金磁納米顆粒4ml，用蒸餾水洗滌兩次，洗完后磁分離收集，用0.5ml水分散，移至10ml玻璃瓶中，同時(shí)加入3.5ml乙醇以及50μl氨水，超聲震蕩5min，緩慢加入2.8μlteos，在超聲環(huán)境下反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，即fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒，用蒸餾水洗滌兩次，再用0.5ml水和3ml無(wú)水乙醇分散，加入50μl氨水，超聲振蕩5min，再加入1.4μlaptes，在超聲振蕩作用下反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水洗滌兩次，最后用蒸餾水分散成4ml，得到表面帶-nh2的fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒。

所得fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒tem圖和edx圖如圖1、2所示，fe3o4/sio2磁性納米顆粒的粒徑較大(圖2a、b)，在顆粒的邊界可以看到一層無(wú)定形的sio2包覆層，且在磁性粒子的表面吸附了大量au納米顆粒，吸附的au納米顆粒粒徑均勻，大約為40nm，呈球形，且au納米顆粒外層還分布著一層sio2(圖2c)。從圖中可以看出au納米顆粒緊密地接合在了fe3o4/sio2納米顆粒的表面。從圖3能譜分析中可以看出，au元素的信號(hào)峰和fe元素信號(hào)峰都十分明顯，而圖中c元素峰來(lái)源于銅網(wǎng)的超薄碳支膜，cu元素峰來(lái)源于電鏡銅網(wǎng)，說明fe3o4納米顆粒的表面覆蓋有au元素和si元素。

實(shí)施例3

(a)只修飾-nh2的fe3o4/sio2磁性納米顆粒

取4.00mgfe3o4納米顆粒，用蒸餾水洗滌2次，洗完后磁分離收集，用2ml蒸餾水分散，裝入15ml玻璃瓶中，同時(shí)加入10ml無(wú)水乙醇與0.2ml氨水。在ph＝10的條件下超聲5min，加入8μlteos，在超聲下反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離磁分離收集顆粒，先后用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗滌兩次，最后用2ml與10ml無(wú)水乙醇分散，加入0.2ml氨水，超聲5min，再加入8μlaptes，在超聲作用下反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，得到表面帶-nh2的fe3o4納米顆粒，先后用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗滌兩次，最后分散在12ml蒸餾水中待用。

稱取10.00mg氯金酸，溶于1.00ml蒸餾水中，備用。在裝有溫度探頭的250ml圓底燒瓶中加入50ml蒸餾水，500rpm磁力攪拌下加熱至100℃，然后一次性加入100μl(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％)檸檬酸鈉溶液，20s后加入1.00ml溶有10.00mg的氯金酸水溶液，保持100℃至反應(yīng)結(jié)束后停止加熱，攪拌下自然冷卻。冷卻至室溫后12000r/min下離心10min，收集下層顆粒，分散在6ml蒸餾水中待用。

取4ml修飾后的fe3o4納米顆粒溶液，磁分離后棄去上清液，加入4ml金納米顆粒，混合后反應(yīng)7h。然后磁分離后棄去上清液，用蒸餾水洗滌2次，磁分離后棄去上清液。重復(fù)上述添加金納米顆粒修飾操作5次，最后分散在4ml蒸餾水中。得到fe3o4納米顆粒表面包覆金納米顆粒的fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒。

(b)只修飾-sh的fe3o4/sio2磁性納米顆粒

取4.00mgfe3o4納米顆粒，用蒸餾水洗滌2次，洗完后磁分離收集，用2ml蒸餾水分散，裝入15ml玻璃瓶中，同時(shí)加入10ml無(wú)水乙醇與0.2ml氨水。在ph＝10的條件下超聲5min，加入8μlteos，在超聲下反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離磁分離收集顆粒，先后用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗滌兩次，最后用2ml水與10ml無(wú)水乙醇分散，加入0.2ml氨水，超聲5min，再加入8μlmptes，在超聲作用下反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，得到表面帶-nh2的fe3o4納米顆粒，先后用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗滌兩次，最后分散在12ml蒸餾水中待用。

稱取10.00mg氯金酸，溶于1.00ml蒸餾水中，備用。在裝有溫度探頭的250ml圓底燒瓶中加入50ml蒸餾水，500rpm磁力攪拌下加熱至100℃，然后一次性加入100μl(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％)檸檬酸鈉溶液，20s后加入1.00ml溶有10.00mg的氯金酸水溶液，保持100℃至反應(yīng)結(jié)束后停止加熱，攪拌下自然冷卻。冷卻至室溫后12000r/min下離心10min，收集下層顆粒，分散在6ml蒸餾水中待用。

取4ml修飾后的fe3o4納米顆粒溶液，磁分離后棄去上清液，加入4ml金納米顆粒，混合后反應(yīng)7h。然后磁分離后棄去上清液，用蒸餾水洗滌2次，磁分離后棄去上清液。重復(fù)上述添加金納米顆粒修飾操作5次，最后分散在4ml蒸餾水中。得到fe3o4納米顆粒表面包覆金納米顆粒的fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒。

圖3即為不同基團(tuán)修飾后得到的fe3o4/sio2/au納米顆粒的圖片(a、c、e)與tem圖像(b、d、f)，圖3(a)、(e)對(duì)應(yīng)實(shí)施例2的步驟(1)所得(1)表面帶-nh2和-sh的fe3o4/sio2納米顆粒，圖3(c)、(d)對(duì)應(yīng)實(shí)施例3(a)所得只修飾-nh2的fe3o4/sio2磁性納米顆粒，圖3(e)、(f)對(duì)應(yīng)實(shí)施例3(b)只修飾-sh的fe3o4/sio2磁性納米顆粒。由圖可知，兩種基團(tuán)-nh2和-sh修飾的fe3o4，經(jīng)磁分離后上清液已澄清，表明金納米顆?？杀煌耆?圖3a)，且磁納米顆粒表面吸附的金也比較均勻(圖3b)。只修飾上-nh2的fe3o4經(jīng)磁分離后上層溶液還是比較渾濁(圖3c)，tem下看到磁顆粒表面也只吸附了非常少的金納米顆粒(圖3d)。而只修飾上-sh的fe3o4經(jīng)磁分離后上層溶液也較渾濁(圖3e)，而且磁納米顆粒表面吸附的金納米顆粒也不均勻，存在金納米顆粒的聚集情況(圖3f)。因此選取同時(shí)修飾了-nh2和-sh的fe3o4來(lái)組裝金磁納米顆粒。

實(shí)施例4

(a)攪拌反應(yīng)法組裝fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒

取4ml實(shí)施例2步驟(1)修飾后的fe3o4納米顆粒，磁分離后棄去上清液，加入4ml金納米顆粒，攪拌反應(yīng)6h。然后磁分離后棄去上清液，用蒸餾水洗滌2次。

重復(fù)上述過程5次，最后分散在4ml蒸餾水中。得到fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒。

(b)振蕩反應(yīng)法組裝fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒

取4ml實(shí)施例2步驟(1)修飾后的fe3o4納米顆粒，磁分離后棄去上清液，加入4ml金納米顆粒，振蕩反應(yīng)6h。然后磁分離后棄去上清液，用蒸餾水洗滌2次。

重復(fù)上述過程5次，最后分散在4ml蒸餾水中。得到fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒。

(c)超聲反應(yīng)法組裝fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒

取4ml實(shí)施例2步驟(1)修飾后的fe3o4納米顆粒，磁分離后棄去上清液，加入4ml金納米顆粒，超聲反應(yīng)6h。然后磁分離后棄去上清液，用蒸餾水洗滌2次。

重復(fù)上述過程5次，最后分散在4ml蒸餾水中。得到fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒。

由圖4可知，攪拌方式得到的金磁納米顆粒整體包覆比較均勻，磁納米顆粒表面吸附的金納米顆粒分散的較好(圖4a)，對(duì)應(yīng)的拉曼峰也較為理想，1510cm^-1處的峰可達(dá)到8000以上(圖4b)。修飾過程采用振蕩修飾時(shí)，fe3o4納米顆粒表面的金納米顆粒的密集度則不如攪拌修飾(圖4c)。同時(shí)所測(cè)得的拉曼峰值也比前者略低，1510cm^-1處的峰只有6000左右(圖4d)。而采用超聲方式組裝得到的金磁納米顆粒tem下看到fe3o4納米顆粒表面只吸附了少量的金納米顆粒，大部分表面無(wú)吸附(圖4e)，同時(shí)對(duì)應(yīng)所測(cè)得的拉曼峰也降低了很多，1510cm^-1處的峰也有3000左右(圖4f)。這是因?yàn)槌曨l率過大，會(huì)使已經(jīng)吸附在fe3o4納米顆粒表面的金納米顆粒脫落，而振蕩頻率較低，金磁組裝過程不會(huì)致金納米顆粒脫落，但卻不能fe3o4表面完全包覆金納米顆粒。攪拌過程相比于振蕩較劇烈，但又不同于超聲，使fe3o4表面充分吸附金納米顆粒的同時(shí)又不致二次脫落。因此選用攪拌方式組裝最為理想。

實(shí)施例5不同量teos對(duì)fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒sers效果的影響

取實(shí)施例2步驟(3)fe3o4/sio2/au金磁納米顆粒4ml，用蒸餾水洗滌兩次，洗完后磁分離收集，用0.5ml水分散，移至10ml玻璃瓶中，同時(shí)加入3.5ml乙醇以及50μl氨水，超聲震蕩5min，緩慢加入teos，在超聲環(huán)境下反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，用蒸餾水洗滌兩次，再用0.5ml水和3.5ml無(wú)水乙醇分散。重復(fù)以上操作，做三組平行實(shí)驗(yàn)，其中teos的用量分別為3μl、4.5μl、6μl。得到三組修飾了不同teos量且未修飾-nh2與-sh的金磁納米顆粒。將上述金磁納米顆粒與60μl1mg/ml羅丹明b染料混合，超聲30s。用羅丹明染料標(biāo)記后測(cè)拉曼峰(型號(hào)advantage785，激光波長(zhǎng)785nm，功率為120mw，積分時(shí)間10s)。

由圖5可知，teos添加量為3μl的金磁納米顆粒的金外層已經(jīng)有較薄的一層sio2包覆(圖5a)，對(duì)應(yīng)的拉曼圖中1510cm^-1與1648cm^-1處的峰值均可達(dá)到7000以上(圖5b)。硅烷外層隨著teos量的增加也隨之增加了一定厚度(圖5c)，硅烷外層的變厚使得拉曼信號(hào)也有一定程度的降低，1648cm^-1處的峰值降低到了6000左右(圖5d)。而當(dāng)teos的添加量再次增加，可以看到硅烷外層明顯變厚(圖5e)，導(dǎo)致拉曼信號(hào)大幅下降(圖5f)。因此當(dāng)包覆金磁納米顆粒整體時(shí)，外層硅烷層越厚，會(huì)導(dǎo)致測(cè)得的拉曼信號(hào)變?nèi)酢?/p>

應(yīng)用實(shí)施例1

(a)拉曼基底的制備

i)fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒修飾后的抗體

稱取1mgnhs-peg-nhs,溶于1mlph＝7.4的磷酸鹽緩沖液(pbs)中。量取1ml實(shí)施例1制備得到的表面帶-nh2的fe3o4/sio2/au/sio2金磁納米顆粒溶液，將1mlnhs-peg-nhs溶液與1ml金磁納米顆粒溶液混合至玻璃瓶中，振蕩反應(yīng)6h。通過-nh2將-nhs基團(tuán)固定在金磁納米顆粒的表面。反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，用pbs洗滌金磁納米顆粒，再次磁分離。用2mlpbs將收集到的顆粒分散到玻璃瓶中，加入0.1ml1mg/ml河豚毒素抗體溶液，室溫下振蕩反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后保存在4℃冰箱中備用。

ii)rhb修飾后的抗體

稱取50μg羅丹明b拉曼染料至棕色玻璃瓶中，溶于0.2mlph＝8.3的nahco3緩沖液中。量取0.1ml1mg/ml的河豚毒素抗體加入至棕色玻璃瓶中。混勻后室溫下振蕩反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后用nahco3緩沖液透析混合液，除去多余的羅丹明b拉曼染料。

(b)建立水中河豚毒素檢測(cè)的工作曲線

取fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒修飾后的抗體50μl，rhb修飾后的抗體10μl，混合振蕩反應(yīng)30min，磁分離后置于凹面載玻片上，使用拉曼光譜儀(型號(hào)advantage785，激光波長(zhǎng)785nm，功率為120mw，積分時(shí)間1s)測(cè)量其拉曼圖譜作為空白對(duì)照組。1376cm^-1處的尖峰為玻璃板的峰，由圖8可知，1510cm^-1與1648cm^-1處均無(wú)明顯峰值。說明缺少河豚毒素，未能連接金磁-抗體復(fù)合物與rhb-抗體復(fù)合物，金納米顆粒與rhb相距較遠(yuǎn)，因此不出峰。

取fe3o4/sio2/au/sio2/nh2金磁納米顆粒修飾后的抗體50μl，rhb修飾后的抗體10μl，再加入一定濃度的河豚毒素，配制成河豚毒素濃度分別為0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml、0.005μg/ml的溶液，磁分離后置于凹面載玻片上，在激光拉曼光譜下得到羅丹明rhb的相關(guān)特征峰及譜圖，以1510cm^-1處的峰強(qiáng)對(duì)ttx濃度進(jìn)行雙對(duì)數(shù)作圖，獲得工作曲線，如圖10所示，線性方程為ini1510＝9.34725incttx+0.89229(lni1510為1510cm^-1處拉曼峰強(qiáng)的對(duì)數(shù)，lncttx為河豚毒素濃度的對(duì)數(shù))，r＝0.9959。

圖9為ttx濃度為0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml、0.005μg/ml的拉曼光譜圖。由圖可知，隨著ttx濃度的降低，拉曼信號(hào)也在隨之降低，當(dāng)濃度達(dá)到0.01μg/ml時(shí)，拉曼信號(hào)還有一定的強(qiáng)度，而當(dāng)濃度再降低到0.005μg/ml時(shí)，信號(hào)接近消失，說明此方法檢測(cè)ttx時(shí)，可達(dá)到0.01μg/ml的檢測(cè)限，靈敏度非常高，已超越ttx國(guó)家檢測(cè)限的20μg/kg。

(c)水中河豚毒素樣品的檢測(cè)

配制濃度為0.5、0.05、0.01μg/ml的河豚毒素水溶液樣品作為待測(cè)溶液，每個(gè)濃度在同等條件下測(cè)試三次。檢測(cè)結(jié)果中河豚毒素的回收率為82.64％～92.60％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)在2.6％～11.1％之間。由于磁分離顯著提高了檢測(cè)靈敏度，顯著縮短了激光拉曼光譜儀對(duì)樣品的照射時(shí)間，使整個(gè)測(cè)試過程能在10分鐘內(nèi)完成，從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)河豚毒素的快速檢測(cè)。