本發(fā)明涉及臨床醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)領(lǐng)域，特別是細(xì)胞分離裝置以及細(xì)胞分離方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞分選是細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)最重要的技術(shù)方法及必要前提，目前技術(shù)比較成熟且應(yīng)用較廣泛，主要有：密度梯度離心法、免疫密度離心法、免疫磁珠法和流式技術(shù)等。其中，密度梯度離心法是根據(jù)細(xì)胞的密度來實現(xiàn)特定類型細(xì)胞的分離，其操作簡單，成本低，但只能對細(xì)胞群體進行粗略的分離，不能滿足臨床和科研上復(fù)雜的細(xì)胞分離需要；免疫密度離心法、免疫磁珠法和流式分選法都是基于抗體捕獲細(xì)胞的原理，結(jié)合其他技術(shù)實現(xiàn)特定類型的細(xì)胞分離，這些分離技術(shù)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)特定類型細(xì)胞的分離，但操作復(fù)雜、分離效率低、成本高，限制了其在臨床上的大規(guī)模應(yīng)用。

三維抗體網(wǎng)細(xì)胞分離法，是結(jié)合三維細(xì)胞培養(yǎng)(3D培養(yǎng))和抗體捕獲細(xì)胞的原理，開發(fā)的一種新的細(xì)胞分離方法。

三維細(xì)胞培養(yǎng)就是將細(xì)胞置于具有三維立體結(jié)構(gòu)的載體中，如水凝膠、多孔PLGA支架等，再加入培養(yǎng)液在體外進行培養(yǎng)，使得細(xì)胞感到好像仍然在體內(nèi)的微環(huán)境中一樣，可以在三維空間中遷移、生長，形成多細(xì)胞聚集體等。三維培養(yǎng)基質(zhì)是在細(xì)胞培養(yǎng)過程當(dāng)中為細(xì)胞提供黏附、增殖和分化所需要的支撐材料，也充當(dāng)支架。三維培養(yǎng)基質(zhì)需要具有良好的細(xì)胞相容性，有一定的機械力學(xué)性能，內(nèi)部有大量的孔隙結(jié)構(gòu)。目前常用的三維培養(yǎng)基質(zhì)主要包括動物性凝膠、非動物性基質(zhì)材料和合成高分子凝膠類。

基于抗體分離細(xì)胞的方法，利用細(xì)胞表面特定的標(biāo)志物，通過抗體和細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，從而特異性捕獲細(xì)胞。基于該原理的細(xì)胞分選方法很多，但大多效率較低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)細(xì)胞分離效果差的技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種細(xì)胞分離裝置以及使用該裝置的細(xì)胞分離方法。

本發(fā)明的技術(shù)問題通過以下的技術(shù)方案予以解決：一種細(xì)胞分離裝置，包括內(nèi)管和外管，所述內(nèi)管的開口端設(shè)有向外延伸的凸緣以讓所述內(nèi)管套設(shè)在所述外管的開口端，所述內(nèi)管的底部與所述外管的底部之間設(shè)有預(yù)設(shè)距離，用于容納進入到所述外管中的未被三維抗體網(wǎng)捕獲的單細(xì)胞，所述內(nèi)管的底部為多孔結(jié)構(gòu)，用于分離所述未被三維抗體網(wǎng)捕獲的單細(xì)胞和被三維抗體網(wǎng)捕獲的細(xì)胞；所述未被三維抗體網(wǎng)捕獲的單細(xì)胞可通過所述多孔結(jié)構(gòu)進入到所述外管，所述被三維抗體網(wǎng)捕獲的細(xì)胞隨三維抗體網(wǎng)一起被所述多孔結(jié)構(gòu)截留在所述內(nèi)管。本發(fā)明還提供了利用細(xì)胞分離裝置的細(xì)胞分離方法，包括S1、制備生物樣本的單細(xì)胞懸液；S2、生物相容性高的高分子材料偶聯(lián)抗體，制備三維抗體網(wǎng)溶液；S3、將制備的三維抗體網(wǎng)溶液和單細(xì)胞懸液先后加入到細(xì)胞分離裝置的內(nèi)管中，顛倒混勻，室溫孵育；S4、離心處理，被三維抗體網(wǎng)捕獲的細(xì)胞留在內(nèi)管，未被三維抗體網(wǎng)捕獲的單細(xì)胞進入到外管。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對比的有益效果包括：采用細(xì)胞分離裝置進行細(xì)胞分離時，通過采用三維抗體網(wǎng)捕獲細(xì)胞在提高對樣本中稀有細(xì)胞捕獲效率的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)了對表達某一特定抗原的細(xì)胞的高準(zhǔn)確性捕獲，有效的實現(xiàn)了細(xì)胞的分離，而且操作簡單，只需要一次離心就可以實現(xiàn)細(xì)胞的快速分選，大大節(jié)約了分選的時間，降低了分選實驗的難度；另外三維抗體網(wǎng)由生物相容性高的高分子材料和抗體構(gòu)成，對細(xì)胞無毒無損傷，獲得的細(xì)胞可用于后面的檢測或?qū)嶒灐?/p>

附圖說明

圖1是本發(fā)明高效細(xì)胞分離裝置示意圖。

圖2是本發(fā)明應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析樣本中CD3+T淋巴細(xì)胞比例圖。左圖為分離前樣本中CD3+T淋巴細(xì)胞的比例，右圖為分離后樣本中CD3+T淋巴細(xì)胞的比例。

圖3是本發(fā)明應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析樣本中CD45+細(xì)胞比例圖。左圖為分離前樣本中CD45+細(xì)胞的比例，右圖為分離后樣本中CD45+細(xì)胞的比例。

具體實施方式

下面對照附圖并結(jié)合優(yōu)選的實施方式對本發(fā)明作進一步說明。

本發(fā)明提供了一種細(xì)胞分離裝置，如圖1所示，包括內(nèi)管1和外管2，所述內(nèi)管1的開口端設(shè)有向外延伸的凸緣11以讓所述內(nèi)管1套設(shè)在所述外管2的開口端，所述內(nèi)管的底部與所述外管的底部之間設(shè)有預(yù)設(shè)距離，用于容納進入到所述外管中的未被三維抗體網(wǎng)捕獲的單細(xì)胞，所述內(nèi)管1的底部12為多孔結(jié)構(gòu)，用于分離所述未被三維抗體網(wǎng)捕獲的單細(xì)胞和被三維抗體網(wǎng)捕獲的細(xì)胞；所述未被三維抗體網(wǎng)捕獲的單細(xì)胞可通過所述多孔結(jié)構(gòu)進入到所述外管，所述被三維抗體網(wǎng)捕獲的細(xì)胞隨三維抗體網(wǎng)一起被所述多孔結(jié)構(gòu)截留在所述內(nèi)管。

在本具體實施方式中，所述的三維抗體網(wǎng)由生物相容性高的高分子材料分散在水中形成的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和偶聯(lián)到所述三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的抗體組成。優(yōu)選地，所述生物相容性高的高分子材料包括改性膠原、改性聚糖或小分子高聚物。

需要說明的是，所述生物相容性高的高分子材料是一種三維培養(yǎng)基質(zhì)，可以分散在水溶液中形成三維立體網(wǎng)結(jié)構(gòu)，該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不改變液體的流動性。

在本具體實施方式中，所述偶聯(lián)方式包括物理吸附或共價結(jié)合，所述三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑為30-1000μm。優(yōu)選地，所述三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑為50-500μm。更優(yōu)選地，所述三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑為100-300μm。

在本具體實施方式中，所述多孔結(jié)構(gòu)的孔徑為20-100μm。優(yōu)選地，所述多孔結(jié)構(gòu)的孔徑為30-70μm。

在本具體實施方式中，所述多孔結(jié)構(gòu)包括篩網(wǎng)或篩板。

同時本發(fā)明提供了一種利用細(xì)胞分離裝置的細(xì)胞分離方法，包括以下步驟：

S1、制備生物樣本的單細(xì)胞懸液；

S2、生物相容性高的高分子材料偶聯(lián)抗體，制備三維抗體網(wǎng)溶液；

S3、將制備的三維抗體網(wǎng)溶液和單細(xì)胞懸液先后加入到細(xì)胞分離裝置的內(nèi)管中，顛倒混勻，室溫孵育；

S4、離心處理，被三維抗體網(wǎng)捕獲的細(xì)胞留在內(nèi)管中，未被三維抗體網(wǎng)捕獲的單細(xì)胞進入到了外管中。

在本具體實施方式中，在步驟S3中所述室溫孵育的時間為20-60min；在步驟S4中所述離心處理的離心力為250-800g，所述離心處理的離心時間為10-30min。

需要說明的是，當(dāng)樣本加入到三維抗體網(wǎng)中，特定類型的細(xì)胞會被三維抗體網(wǎng)上的抗體捕獲，捕獲后的細(xì)胞與抗體網(wǎng)形成較大的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，離心時無法通過多孔結(jié)構(gòu)而被截留，在多孔結(jié)構(gòu)的上層即可收獲到特定類型的細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞分離方法在外周血單個核細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞的富集、外周血單個核細(xì)胞中CD45+細(xì)胞的去除、或全血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集的應(yīng)用。

實施例1

外周血單個核細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞(CD3+T)細(xì)胞的富集，包括以下步驟：

a、密度梯度離心法分離50ml全血中的外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)將細(xì)胞密度調(diào)整到1×107個/ml，制成PBMCs的單細(xì)胞懸液；

b、將固化了CD3單克隆抗體(anti-CD3mAb)的FP001(一種改性聚糖，購買于Nissan Chemical Industries,LTD，貨號：385-07981)和PBS溶液按1：5的比例加入到50ml錐形離心管中，輕輕顛倒混合均勻，制備20ml固化了的anti-CD3mAb三維抗體網(wǎng)溶液；

c、將三維抗體網(wǎng)溶液加入到細(xì)胞分離裝置的內(nèi)管中，同時將分離獲得的PBMCs加入到內(nèi)管中，輕輕顛倒混合均勻，室溫孵育20min；

d、在500g的離心力下離心10min，加入5ml PBS溶液將篩網(wǎng)截留的三維抗體網(wǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一只錐形離心管中；

e、加入3倍以上體積的PBS溶液稀釋收獲的上清液，在800g離心力下離心10min，收集細(xì)胞沉淀即為富集到的CD3+T細(xì)胞；

f、流式細(xì)胞術(shù)分析所富集的CD3+T淋巴細(xì)胞的純度，從圖2可知，平均純度為92±3％。

實施例2

外周血單個核細(xì)胞中CD45+細(xì)胞的去除，包括以下步驟：

a、密度梯度離心法分離30ml全血中的外周血單個核細(xì)胞，用PBS溶液將細(xì)胞密度調(diào)整到1×107個/ml；

b、將固化了CD45單克隆抗體的FP001和PBS溶液按1：6的比例加入到50ml錐形離心管中，輕輕顛倒混合均勻，制備15ml anti-CD45mAb三維抗體網(wǎng)溶液；

c、將三維抗體網(wǎng)溶液加入到細(xì)胞分離裝置的內(nèi)管中，同時將分離獲得的PBMCs加入到內(nèi)管中，輕輕顛倒混合均勻，室溫孵育20min；

d、在500g離心力下離心10min，收集外管中的細(xì)胞沉淀即為去除CD45+細(xì)胞后的PBMCs；

e、流式細(xì)胞術(shù)分析CD45+細(xì)胞去除率，從圖3可知，去除率為84±3％。實施例3

全血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集，包括以下步驟：

a、肝素抗凝抽取腫瘤患者外周血10ml；

b、將固化了上皮細(xì)胞粘附分子單克隆抗體(anti-EpCAM mAb)的FP001和PBS溶液按1：4的比例加入到50ml錐形離心管中，輕輕顛倒混合均勻，制備30ml固化anti-EpCAM mAb三維抗體網(wǎng)溶液；

c、將三維抗體網(wǎng)溶液加入到細(xì)胞分離裝置的內(nèi)管中，同時將分離獲得的PBMCs加入到內(nèi)管中，輕輕顛倒混合均勻，室溫孵育20min；

d、在離心力為500g下離心10min，加入5ml PBS于內(nèi)管將篩網(wǎng)截留的三維抗體網(wǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一只錐形離心管中；

e、加入3倍以上體積的PBS溶液稀釋收獲的上清，在800g離心力下離心10min，收集細(xì)胞沉淀即為富集到的EpCAM陽性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干等同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。