本發(fā)明涉及細胞信息獲取方法以及細胞信息獲取裝置。

背景技術：

以細胞的增殖、分化為首的各種生命現(xiàn)象中，蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA等各種分子在細胞中局部存在。在解析細胞中的各種分子的局部存在時，期待分子的功能解析、蛋白質(zhì)間相互作用的解析、信號傳遞路徑的解析等大量的生命現(xiàn)象的解明。

在國際公開第2005/098430號中，公開了通過熒光顯微鏡以及成像流式細胞儀來解析細胞內(nèi)的分子的局部存在的方法。

即使是來歷相同的同種的細胞，各個細胞也是多種多樣的，所以，例如，既有如圖23(a)所示特定的分子在特定的部位局部存在的細胞，也有如圖23(b)所示特定的分子在其它部位局部存在的細胞。另外，例如，還存在如圖23(c)所示分子的量由于各種因素而在細胞之間不均勻的情況。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了如果想要從細胞中的分布以及量多種多樣的分子獲取信息，則在獲取結(jié)果中會產(chǎn)生偏差。因此，期望精度良好地解析這樣細胞中的分布以及量多種多樣的分子的手法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的范圍僅由所附的權利要求書限定，不受此發(fā)明內(nèi)容說明的任何影響。

本發(fā)明的第1方案涉及細胞信息獲取方法。在本方案的細胞信息獲取方法中，使熒光波長相互不同的多個熒光物質(zhì)與細胞中包含的被檢測物質(zhì)結(jié)合，對細胞照射光而使得從多個熒光物質(zhì)產(chǎn)生波長以及強度不同的熒光，根據(jù)產(chǎn)生的各熒光獲取多個熒光信息。

在本方案的細胞信息獲取方法中，“熒光波長相互不同的多個熒光物質(zhì)”是指，在被照射了光時多個熒光物質(zhì)分別發(fā)出相互不同的波長的熒光。為了使得從多個熒光物質(zhì)產(chǎn)生波長以及強度不同的熒光，例如在多個熒光物質(zhì)中，激勵用的光的波長相互不同的情況下，針對細胞照射波長以及強度不同的多個光。熒光信息例如是基于熒光的圖像。此外，“使多個熒光物質(zhì)與被檢測物質(zhì)結(jié)合”是指，也可以未必是細胞中包含的同種的被檢測物質(zhì)的各分子全部與多個熒光物質(zhì)結(jié)合，多個熒光物質(zhì)特別地與至少一部分的同種的被檢測物質(zhì)的分子結(jié)合即可。

在細胞中的被檢測物質(zhì)的分布以及量是多種多樣的情況下，存在從熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光的強度過強的情況、過弱的情況，所以使用1個熒光信息未必能夠適當?shù)嘏袆e被檢測物質(zhì)的分布狀況等。然而，根據(jù)本方案的細胞信息獲取方法，使得從與被檢測物質(zhì)結(jié)合的多個熒光物質(zhì)產(chǎn)生強度不同的熒光，能夠根據(jù)強度不同的熒光獲取多個熒光信息。由此，即使利用一個熒光信息時由于熒光過強而無法適當?shù)嘏袆e被檢測物質(zhì)的分布狀況等的情況下，如果使用其它熒光信息，就能夠適當?shù)嘏袆e被檢測物質(zhì)的分布狀況等。因此，只要使用某一個熒光信息就能夠適當?shù)嘏袆e被檢測物質(zhì)的分布狀況等，所以即使細胞中的被檢測物質(zhì)的分布以及量是多種多樣，也能夠精度良好地解析被檢測物質(zhì)。

本發(fā)明的第2方案涉及細胞信息獲取方法。在本方案的細胞信息獲取方法中，使基質(zhì)與細胞中包含的被檢測物質(zhì)接觸來使得產(chǎn)生熒光波長相互不同的多個熒光物質(zhì)，對細胞照射光而使得從多個熒光物質(zhì)產(chǎn)生波長以及強度不同的熒光，根據(jù)產(chǎn)生的各熒光獲取多個熒光信息。

在本方案的細胞信息獲取方法中，使基質(zhì)與細胞中包含的被檢測物質(zhì)接觸來使得產(chǎn)生熒光波長相互不同的多個熒光物質(zhì)，由此用多個熒光物質(zhì)標識被檢測物質(zhì)。在本方案的細胞信息獲取方法中，也與第1方案同樣地，只要使用某一個熒光信息就能夠適當?shù)嘏袆e被檢測物質(zhì)的分布狀況等，所以能夠精度良好地解析被檢測物質(zhì)。

本發(fā)明的第3方案涉及細胞信息獲取方法。在本方案的細胞信息獲取方法中，使熒光物質(zhì)與細胞中包含的被檢測物質(zhì)結(jié)合，對細胞照射光而使得從熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，從產(chǎn)生的熒光獲取波長以及強度不同的多個熒光，根據(jù)獲取的各熒光獲取多個熒光信息，根據(jù)多個熒光信息，判別細胞中的被檢測物質(zhì)的分布狀況。

在本方案的細胞信息獲取方法中，1種熒光物質(zhì)與被檢測物質(zhì)結(jié)合。為了從產(chǎn)生的熒光獲取波長以及強度不同的多個熒光，例如，使從熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光通過透射波長段不同的多個濾光片部件而分離。此外，在本方案的細胞信息獲取方法中，熒光信息也是例如基于熒光的圖像。另外，也可以未必是細胞中包含的同種的被檢測物質(zhì)的各分子全部與熒光物質(zhì)結(jié)合，熒光物質(zhì)特別地與至少一部分的同種的被檢測物質(zhì)的分子結(jié)合即可。在本方案的細胞信息獲取方法中，也與第1方案同樣地，只要使用某一個熒光信息就能夠適當?shù)嘏袆e被檢測物質(zhì)的分布狀況等，所以能夠精度良好地解析被檢測物質(zhì)。

本發(fā)明的第4方案涉及細胞信息獲取方法。在本方案的細胞信息獲取方法中，使基質(zhì)與細胞中包含的被檢測物質(zhì)結(jié)合來使得產(chǎn)生熒光物質(zhì)，對細胞照射光而使得從熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，從產(chǎn)生的熒光獲取波長以及強度不同的多個熒光，根據(jù)獲取的各熒光獲取多個熒光信息，根據(jù)多個熒光信息，判別細胞中的被檢測物質(zhì)的分布狀況。

在本方案的細胞信息獲取方法中，通過使基質(zhì)與細胞中包含的被檢測物質(zhì)接觸來使得產(chǎn)生熒光物質(zhì)，用熒光物質(zhì)標識被檢測物質(zhì)。在本方案的細胞信息獲取方法中，也與第3方案同樣地，只要使用某一個熒光信息就能夠適當?shù)嘏袆e被檢測物質(zhì)的分布狀況等，所以能夠精度良好地解析被檢測物質(zhì)。

本發(fā)明的第5方案涉及細胞信息獲取裝置。本方案的細胞信息獲取裝置具備：光照射部，對包含結(jié)合了熒光波長相互不同的多個熒光物質(zhì)的被檢測物質(zhì)的細胞照射光，使得從多個熒光物質(zhì)產(chǎn)生波長以及強度不同的熒光；受光部，接受從多個熒光物質(zhì)產(chǎn)生的各熒光；以及獲取部，根據(jù)強度不同的熒光獲取多個熒光信息。

根據(jù)本方案的細胞信息獲取裝置，能夠起到與第1方案同樣的效果。

本發(fā)明的第6方案涉及細胞信息獲取裝置。本方案的細胞信息獲取裝置具備：光照射部，對包含結(jié)合了熒光物質(zhì)的被檢測物質(zhì)的細胞照射光而使得從熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光；受光部，接受從熒光物質(zhì)產(chǎn)生的波長及強度不同的多個熒光；獲取部，根據(jù)所接受到的多個熒光，獲取多個熒光信息；以及解析部，根據(jù)多個熒光信息，判別細胞中的被檢測物質(zhì)的分布狀況。

根據(jù)本方案的細胞信息獲取裝置，能夠起到與第3方案同樣的效果。

本發(fā)明的第7方案涉及細胞信息獲取裝置。本方案的細胞信息獲取裝置具備：光照射部，對包含通過與基質(zhì)接觸而使得產(chǎn)生熒光物質(zhì)的被檢測物質(zhì)的細胞照射光而使得從熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光；受光部，接受從熒光物質(zhì)產(chǎn)生的波長及強度不同的多個熒光；獲取部，根據(jù)所接受到的多個熒光，獲取多個熒光信息；以及解析部，根據(jù)多個熒光信息，判別細胞中的被檢測物質(zhì)的分布狀況。

根據(jù)本方案的細胞信息獲取裝置，能夠起到與第4方案同樣的效果。

根據(jù)本發(fā)明，能夠精度良好地解析細胞中的分布以及量多種多樣的分子。

附圖說明

圖1是示出實施方式1的細胞信息獲取方法的流程圖。

圖2是示出實施方式1的熒光獲取的概要的圖。

圖3是示出根據(jù)實施方式1的高強度的熒光以及低強度的熒光獲取的圖像的概念圖。

圖4(a)是示出在實施方式1的驗證中獲取的圖像的圖。圖4(b)是示出在實施方式1的驗證中獲取的數(shù)值的圖。

圖5是示出實施方式1的裝置的結(jié)構的框圖。

圖6是示出實施方式1的光學檢測部的結(jié)構的圖。

圖7是示出實施方式1的變更例的光學檢測部的結(jié)構的圖。

圖8是示出實施方式1的利用細胞信息獲取裝置進行的處理的流程圖。

圖9是示出在實施方式1的顯示部中顯示的畫面的圖。

圖10是示出根據(jù)實施方式1的變更例的高強度的熒光以及低強度的熒光獲取的圖表的概念圖。

圖11是示出實施方式2的熒光獲取的概要的圖。

圖12是示出實施方式3的熒光獲取的概要的圖。

圖13是用于說明實施方式3的濾光片部件的透射波長段以及獲取的熒光的波長段的圖。

圖14是示出在實施方式3的驗證中獲取的圖像的圖。

圖15是示出實施方式3的光學檢測部的結(jié)構的圖。

圖16是示出實施方式4的熒光獲取的概要的圖。

圖17是示出實施方式4的光學檢測部的結(jié)構的圖。

圖18是示出實施方式5的熒光獲取的概要的圖。

圖19是示出實施方式5的光學檢測部的結(jié)構的圖。

圖20是示出實施方式6的熒光獲取的概要的圖。

圖21是示出在實施方式6的驗證中獲取的圖像的圖。

圖22是示出實施方式7的熒光獲取的概要的圖。

圖23是用于說明發(fā)明想要解決的課題的示意圖。

具體實施方式

以下將參考附圖描述本發(fā)明的優(yōu)選實施例。

<實施方式1>

在實施方式1中，在使熒光波長相互不同的多個熒光物質(zhì)與細胞中包含的被檢測物質(zhì)相結(jié)合并根據(jù)從熒光物質(zhì)產(chǎn)生的多個熒光來判別被檢測物質(zhì)的局部存在狀況的細胞信息獲取方法中，應用了本發(fā)明。在實施方式1中，被檢測物質(zhì)是NF-κB。作為轉(zhuǎn)錄因子的NF-κB在與IκB形成了復合體的狀態(tài)下存在于細胞質(zhì)內(nèi)，認為通過由于各種刺激引起的IκB的分解而轉(zhuǎn)移到核的內(nèi)部。在實施方式1中，進行如下解析：將NF-κB作為被檢測物質(zhì)，用熒光物質(zhì)特別地標識，根據(jù)來自熒光物質(zhì)的熒光，判定NF-κB存在于細胞質(zhì)和核中的哪一個。此外，被檢測物質(zhì)也可以是NF-κB以外的蛋白質(zhì)、分子。例如，被檢測物質(zhì)也可以是NF-κB以外的轉(zhuǎn)錄因子，例如，也可以是STAT(Signal Transducer and Activator of Transcription，信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子)、NFAT(nuclear factor of activated T cells，活化T細胞的核因子)、HIF(hypoxia-inducible factor，缺氧誘導因子)。另外，被檢測物質(zhì)也可以是mRNA、microRNA。另外，“使多個熒光物質(zhì)與被檢測物質(zhì)結(jié)合”是指，未必是細胞中包含的同種的被檢測物質(zhì)的各分子全部與多個熒光物質(zhì)結(jié)合，多個熒光物質(zhì)特別地與至少一部分的同種的被檢測物質(zhì)的分子結(jié)合即可。另外，局部存在狀況的判別不限于被檢測物質(zhì)局部存在于核中還是局部存在于細胞質(zhì)中的判別。例如，在如神經(jīng)細胞那樣具有突起形狀的情況下，也可以判別被檢測物質(zhì)是否局部存在于突起的前端。

如圖1所示，細胞信息獲取方法包括步驟S1～S4的步驟。以下，說明操作者使用能夠?qū)晒鈭D像進行攝像的流式細胞儀和能夠?qū)z像的圖像進行解析的處理裝置來執(zhí)行圖1的細胞信息獲取方法的情況。圖1的各步驟也可以通過細胞信息獲取裝置中的處理來執(zhí)行。隨后，參照圖5以后，說明細胞信息獲取裝置進行圖1的各步驟的情況下的結(jié)構以及處理。

在步驟S1中，操作者用熒光波長相互不同的熒光物質(zhì)11、12標識從被檢者提取的細胞中包含的NF-κB。例如，如圖2所示，經(jīng)由一次抗體和二次抗體，熒光物質(zhì)11、12與細胞中包含的NF-κB結(jié)合。熒光物質(zhì)11、12既可以通過多個一次抗體而與NF-κB結(jié)合，也可以通過抗體的一部分或者抗體的全部而與NF-κB結(jié)合。另外，在步驟S1中，操作者用熒光波長與熒光物質(zhì)11、12不同的熒光物質(zhì)13，標識細胞中包含的核。

熒光物質(zhì)11、12、13是熒光色素。熒光物質(zhì)11、12、13分別構成為當被照射波長λ1、λ2、λ3的光時激勵相互不同的波長段的熒光。即，用于從熒光物質(zhì)11～13激勵熒光的光的波長被設定為相互不同。這樣，通過步驟S1調(diào)制試樣。此外，在被檢測物質(zhì)是mRNA、microRNA的情況下，熒光物質(zhì)經(jīng)由核酸探測器而與被檢測物質(zhì)結(jié)合。

在步驟S2中，操作者驅(qū)動流式細胞儀，使包含用熒光物質(zhì)11～13標識的細胞的試樣流入到流通池，對在流通池中流動的細胞照射波長λ1～λ3的光，使得從熒光物質(zhì)11～13產(chǎn)生熒光。

如圖2所示，當對細胞照射波長λ1～λ3的激光時，從熒光物質(zhì)11～13分別產(chǎn)生不同的波長段的熒光。濾光片部件21使從熒光物質(zhì)11產(chǎn)生的波長段B1的熒光通過，遮斷波長段B1以外的光。通過濾光片部件21，從熒光物質(zhì)11產(chǎn)生的波長段B1的熒光被分離。濾光片部件22使從熒光物質(zhì)12產(chǎn)生的波長段B2的熒光通過，遮斷波長段B2以外的光。通過濾光片部件22，從熒光物質(zhì)12產(chǎn)生的波長段B2的熒光被分離。濾光片部件23使從熒光物質(zhì)13產(chǎn)生的波長段B3的熒光通過，遮斷波長段B3以外的光。通過濾光片部件23，從熒光物質(zhì)13產(chǎn)生的波長段B3的熒光被分離。

在此，以高功率對細胞照射波長λ1的激光，以低功率對細胞照射波長λ2的激光。通過以高功率對細胞照射波長λ1的激光，通過了濾光片部件21的波長段B1的熒光成為高強度。通過以低功率對細胞照射波長λ2的激光，通過了濾光片部件22的波長段B2的熒光成為低強度。

在步驟S3中，處理裝置根據(jù)從熒光物質(zhì)11～13產(chǎn)生的熒光，針對每個細胞獲取3個熒光信息。流式細胞儀具備用于使通過濾光片部件21～23分離的波長段B1～B3的熒光分別成像到由攝像元件構成的受光部而獲取基于各熒光的圖像的結(jié)構。處理裝置根據(jù)流式細胞儀的受光部輸出的攝像信號，獲取基于波長段B1的高強度的熒光的圖像、基于波長段B2的低強度的熒光的圖像以及基于波長段B3的熒光的圖像作為熒光信息。

關于波長段B1～B3的熒光，既可以通過3個受光部分別個別地進行攝像，也可以通過1個受光部進行攝像。光學系統(tǒng)構成為，在通過1個受光部對波長段B1～B3的熒光進行攝像的情況下波長段B1～B3的熒光在受光部的受光面上在不同的區(qū)域中成像。

如圖3所示，當是NF-κB局部存在于核中的細胞的情況下，在步驟S3中，例如獲取圖像31、32。圖像31是基于波長段B1的高強度的熒光的圖像，圖像32是基于波長段B2的低強度的熒光的圖像。在圖像31、32中，設定核存在的區(qū)域33。區(qū)域33是從基于與圖像31、32同時生成的波長段B3的熒光即從核產(chǎn)生的熒光的圖像獲取的。

在是NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中的細胞的情況下，在步驟S3中，例如獲取圖像41、42。圖像41是基于波長段B1的高強度的熒光的圖像，圖像42是基于波長段B2的低強度的熒光的圖像。在圖像41、42中都設定核存在的區(qū)域43。區(qū)域43是從基于與圖像41、42同時生成的波長段B3的熒光的圖像獲取的。

在是NF-κB的發(fā)現(xiàn)量少的細胞的情況下，根據(jù)圖像31，熒光的強度適當，并且在核與細胞質(zhì)之間在熒光強度上出現(xiàn)差異，所以能夠判別NF-κB局部存在于核的區(qū)域33。另一方面，根據(jù)圖像32，熒光的強度過低，所以無法判別NF-κB局部存在于核的區(qū)域33。另一方面，在是NF-κB的發(fā)現(xiàn)量多的細胞的情況下，根據(jù)圖像41，熒光的強度過高，所以成為在核與細胞質(zhì)之間在熒光強度上沒有差異的狀態(tài)。因此，無法判別NF-κB局部存在于核的區(qū)域43和比核的區(qū)域43寬的細胞質(zhì)的區(qū)域中的哪一個區(qū)域。另一方面，根據(jù)圖像42，熒光的強度適當，并且在核與細胞質(zhì)之間在強度上產(chǎn)生差異，所以能夠判別NF-κB局部存在于比核的區(qū)域43寬的細胞質(zhì)的區(qū)域。

在NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中的情況下，NF-κB以包圍核的方式分布在細胞內(nèi)。即，在攝像方向上觀察了細胞時，在核的跟前也分布有NF-κB。因此，在基于高強度的熒光的圖像41中，通過分布在核的跟前的NF-κB在核的區(qū)域中也產(chǎn)生強的熒光。因此，在圖像41中，存在無法適當?shù)嘏袆eNF-κB局部存在于核中還是局部存在于細胞質(zhì)中的趨勢。相對于此，在基于低強度的熒光的圖像42中，雖然通過分布在核的跟前的NF-κB在核的區(qū)域中也產(chǎn)生熒光，但該熒光的強度低。因此，在圖像41中，即使NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中的情況下，也能夠適當?shù)嘏袆e局部存在狀況。

另外，在NF-κB局部存在于核中的情況下，NF-κB的一部分分布在細胞質(zhì)中，但大半分布在核內(nèi)。因此，在基于高強度的熒光的圖像31中，從分布在核內(nèi)的NF-κB產(chǎn)生強的熒光，能夠適當?shù)嘏袆eNF-κB局部存在于核中。另一方面，在基于低強度的熒光的圖像32中，來自分布在核內(nèi)的NF-κB的熒光過弱，所以存在無法適當?shù)嘏袆eNF-κB局部存在于核中還是局部存在于細胞質(zhì)中的趨勢。

這樣，根據(jù)作為細胞內(nèi)的被檢測物質(zhì)的NF-κB的量和分布，用于判別NF-κB的局部存在的適當強度不同。

因此，波長λ1的激光的功率被設定為在NF-κB局部存在于核中的細胞中能夠適當?shù)嘏袆e如圖像31所示NF-κB局部存在于核中。波長λ2的激光的功率被設定為在NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中的細胞中能夠適當?shù)嘏袆e如圖像42所示NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中。由此，在成為判別對象的細胞中，不論NF-κB局部存在于核和細胞質(zhì)中的哪一個中，都能夠使用2個圖像中的至少某一方來判別NF-κB的局部存在。

返回到圖1，在步驟S4中，操作者參照基于波長段B1的高強度的熒光的圖像和基于波長段B2的低強度的熒光的圖像，判別作為被檢測物質(zhì)的NF-κB的分布狀況。具體而言，操作者選擇基于波長段B1的高強度的熒光的圖像和基于波長段B2的低強度的熒光的圖像中的、能夠判別NF-κB的局部存在位置的圖像，根據(jù)該圖像，判別在該細胞中NF-κB局部存在于核和細胞質(zhì)中的哪一個中、即局部存在狀況。也可以代替局部存在狀況，判別NF-κB分布在哪個位置、例如細胞內(nèi)的分布范圍等。

如上所述，在實施方式1中，通過調(diào)整從標識了NF-κB的熒光物質(zhì)11、12產(chǎn)生的2個熒光，成為基于高強度的熒光的圖像和基于低強度的熒光的圖像中的某一方能夠適當?shù)嘏卸∟F-κB的局部存在的狀態(tài)。因此，操作者能夠根據(jù)2個圖像，精度良好地解析細胞中的分布多種多樣的NF-κB。具體而言，能夠精度良好地判別細胞中的NF-κB的局部存在狀況、即NF-κB局部存在于核和細胞質(zhì)中的哪一個。

另外，在實施方式1中，還考慮如下情況：即使NF-κB局部存在于核中的情況下，由于NF-κB的量多，所以成為圖像31的熒光的強度過高的狀態(tài)，成為圖像32的熒光的強度適當?shù)臓顟B(tài)。在該情況下，也通過使用熒光的強度適當?shù)膱D像32來能夠判別NF-κB局部存在于核中。另外，還考慮如下情況：即使在NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中的情況下，由于NF-κB的量少，所以成為圖像41的熒光的強度適當?shù)臓顟B(tài)，成為圖像42的熒光的強度過低的狀態(tài)。在該情況下，也通過使用熒光的強度適當?shù)膱D像41來能夠判別NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中。這樣，根據(jù)實施方式1，根據(jù)2個圖像，無論NF-κB的量多少，都能夠精度良好地判別細胞中的NF-κB的局部存在狀況。

在此，血管內(nèi)皮細胞從血管的內(nèi)壁剝離而流入到血液中。血管內(nèi)皮細胞的剝離，除了由于因炎癥所致的刺激而產(chǎn)生以外，還由于因壓迫等所致的壓力的變化也產(chǎn)生。在由于因炎癥所致的刺激而剝離的血管內(nèi)皮細胞中，NF-κB傾向于局部存在于核中，在由于因炎癥所致的刺激以外的刺激而剝離的血管內(nèi)皮細胞中，NF-κB傾向于不局部存在于核中。根據(jù)實施方式1，如上所述能夠精度良好地判別NF-κB的局部存在，所以能夠根據(jù)作為信號分子的NF-κB是否局部存在于核中來判定是由于這些剝離原因中的炎癥所致的刺激而產(chǎn)生的剝離，能夠判定血管內(nèi)皮細胞有無活性化。由此，例如，能夠判斷血管內(nèi)皮細胞的剝離是由于采血時的壓迫而產(chǎn)生還是以疾病等為主要原因而產(chǎn)生，有臨床上的意義。

也可以通過與波長λ1、λ2不同的波長的中功率的激光，獲取中強度的熒光的圖像。即，也可以用熒光波長相互不同的3個熒光物質(zhì)標識NF-κB，對細胞照射3個激光而使得從3個熒光物質(zhì)產(chǎn)生強度不同的熒光來獲取基于各熒光的圖像。由此，通過從熒光的強度不同的3個圖像中使用最適當?shù)膱D像，能夠精度更良好地判別NF-κB的局部存在。從被檢測物質(zhì)產(chǎn)生的熒光的強度也可以是4個等級以上，也可以針對1個細胞獲取基于4個以上的強度的熒光的4個以上的圖像。

進而，在步驟S4中，操作者根據(jù)如上所述判別的每個細胞的局部存在狀況，獲取試樣中包含的細胞中的、NF-κB局部存在于特定部位中的細胞的比例。具體而言，如果將判別為NF-κB局部存在于核中的細胞的數(shù)量設為N1，將判別為NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中的細胞的數(shù)量設為N2，則操作者通過以下的式，獲取核局部存在率和細胞質(zhì)局部存在率。此外，在步驟S4中，操作者也可以代替核局部存在率和細胞質(zhì)局部存在率而獲取核局部存在數(shù)和細胞質(zhì)局部存在數(shù)。

核局部存在率＝{N1/(N1+N2)}×100

細胞質(zhì)局部存在率＝{N2/(N1+N2)}×100

在步驟S2中，如上所述使用流式細胞儀來獲取了各熒光的圖像，但不限于此，也可以使用顯微鏡，獲取各熒光的圖像作為熒光信息。即，也可以通過顯微鏡，獲取從熒光物質(zhì)11產(chǎn)生的高強度的熒光圖像、從熒光物質(zhì)12產(chǎn)生的低強度的熒光圖像以及從熒光物質(zhì)13產(chǎn)生的與核對應的圖像。

<實施方式1的驗證>

接下來，說明發(fā)明人進行的實施方式1的驗證。

1.準備

作為細胞，準備了人類心臟微小血管內(nèi)皮細胞(HMVEC-C)(Lonza CatNo.CC-7030，Lot No.0000296500(P4))。作為一次抗體，準備了NF-κB p65(D14E12)XP Rabbit mAb(Cell Signaling Technologies #8242S)。作為二次抗體，準備了Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Secondary Antibody，Alexa Fluor 647 conjugate(Life technologies A-21245)、Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Secondary Antibody，Alexa Fluor 488 conjugate(Life technologies A-11008)。對二次抗體，作為熒光色素，結(jié)合了Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 488。作為核染色色素，準備了Cellstain Hoechst 33342 solution(DOjinDO H342)。另外，準備了EGM-2MV Medium(Lonza Cat No.CC-3202)、EGM-2MV SingleQuots Kit(Lonza Cat No.CC-3202)、PBS pH7.4(GIBCO Cat No.10010-023)、BSA(LAMPIRE Cat No.7500805)、PFA(WAKO Cat No.160-16061)、TritonX100(Nacalai Tesque CatNo.35501-15)。

2.試劑調(diào)制

對500mL的EGM-2MV Medium添加EGM-2MV SingleQuots Kit的FBS以外的試劑，將100mL移到無菌瓶，制作了無血清培養(yǎng)基。對無血清培養(yǎng)基制作的剩余量(400mL)，添加20mL的Single Quots Kit的FBS，制作出培養(yǎng)基。在利用pH12的PBS溶解多聚甲醛以其最終濃度為8％w/v之后，調(diào)整為pH7.4。對PBS加上1.5g的BSA并溶解而補足成50mL，調(diào)制了3％BSA/PBS。對PBS加上0.5g的BSA并溶解而補足成50mL，調(diào)制了1％BSA/PBS。利用PBS調(diào)制TritonX100以其最終濃度為0.1％w/v。

3.步驟

HMVEC-C是遵照制造商推薦協(xié)議，利用EGM-2MV培養(yǎng)基來培養(yǎng)的。在本驗證中使用了從購入后起繼代次數(shù)為6次以內(nèi)的細胞。關于培養(yǎng)基，將開封后的使用期限設為3周期間。關于TNF-α刺激培養(yǎng)，去除約70％合流的HMVEC-C細胞的培養(yǎng)上清，加上以成為最終濃度25ng/mL的方式添加了Recombinant Human TNF-alpha的EGM-2MV培養(yǎng)基，并在37℃的CO₂恒溫箱內(nèi)靜置了1小時。保留3mL左右而用電動移液器去除培養(yǎng)基，并用刮刀剝離了細胞。加上與回收的懸浮液等量的8％PFA/PBS，在室溫下反應了15分鐘。在室溫下，以1000rpm進行了3分鐘的離心分離。用1mL的PBS將細胞顆粒沖洗了2次。去除上清，加上1mL的0.1％Triton X-100/PBS，在室溫下反應了15分鐘。在室溫下，以1000rpm進行了3分鐘的離心分離。用1mL的1％BSA/PBS沖洗了2次。去除上清，加上1mL的3％BSA/PBS，在室溫下靜置了30分鐘。在3％BSA/PBS中添加了1/1600的400μL的一次抗體。在室溫下反應了1小時。在室溫下，以1000rpm進行了3分鐘的離心分離。用1mL的1％BSA/PBS進行了沖洗。在3％BSA/PBS中添加了1/1000的400μL的二次抗體。在室溫下反應了30分鐘。用1mL的1％BSA/PBS沖洗了2次。去除上清，添加了50μL的1％BSA/PBS。

4.利用流式細胞儀進行檢測

作為能夠獲取熒光圖像的流式細胞儀，使用了ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer(Merck Millipore)。使依照上述3調(diào)制的試樣流入到該流式細胞儀的流通池中，對在流通池中流動的試樣，照射了波長488nm、647nm、405nm的激光。波長488nm、647nm、405nm的激光與上述波長λ1、λ2、λ3的激光對應。波長488nm、647nm、405nm的激光的射出功率分別為55mW、10mW、120mW。波長488nm、647nm的激光照射到標識NF-κB的2種熒光色素，由此分別產(chǎn)生了高強度的熒光和低強度的熒光。波長405nm的激光照射到核染色色素而產(chǎn)生了熒光。

在上述流式細胞儀中，經(jīng)由透射波長段505nm～560nm的濾光片部件，對通過波長488nm的激光產(chǎn)生的熒光進行攝像，獲取了高強度的熒光圖像。經(jīng)由透射波長段642nm～740nm的濾光片部件，對通過波長647nm的激光產(chǎn)生的熒光進行攝像，獲取了低強度的熒光圖像。經(jīng)由透射波長段430nm～505nm的濾光片部件，對通過波長405nm的激光產(chǎn)生的熒光進行攝像，獲取了與核對應的熒光圖像。另外，對在流通池中流動的試樣，照射了波長被設定為430nm～480nm之間的激光。經(jīng)由透射波長段430nm～480nm的濾光片部件，對該激光透射了細胞后的光進行攝像，獲取了明視場圖像。此外，在上述流式細胞儀中，通過濾光片部件等來去除不需要的波長段的光以使成為對象的波長段的光適當?shù)厝肷涞绞芄獠?。此外，在本驗證中獲取了明視場圖像，但不限于此，也可以獲取暗視場圖像。

參照圖4(a)，說明通過上述檢測來獲取的圖像。

“明視場”表示細胞的明視場圖像。“高強度的熒光”和“低強度的熒光”分別是基于從標識了NF-κB的熒光色素產(chǎn)生的高強度的熒光的圖像和基于從標識了NF-κB的熒光色素產(chǎn)生的低強度的熒光的圖像?！皝碜院说臒晒狻笔腔趶膶诉M行了染色的核染色用色素產(chǎn)生的熒光的圖像。“合成”是合成左側(cè)的4個圖像而得到的圖像。橫向排列的5個圖像是從1個細胞獲取的圖像?！案邚姸鹊臒晒狻?、“來自核的熒光”、“低強度的熒光”以及“合成”表示的圖像是為方便起見對所獲取的彩色圖像進行灰階化而得到的圖像。在“高強度的熒光”、“來自核的熒光”以及“低強度的熒光”表示的圖像中，白的部分表示熒光的強度強。

在上段所示的細胞的情況下，基于低強度的熒光的圖像的強度過低，所以難以判別NF-κB的局部存在。另一方面，基于高強度的熒光的圖像的強度適當，所以能夠判別為NF-κB局部存在于核中。在下段所示的細胞的情況下，基于高強度的熒光的圖像的強度過高，所以難以判別NF-κB的局部存在。另一方面，基于低強度的熒光的圖像的強度適當，所以能夠判別為NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中。

5.核局部存在率的計算

通過對所獲取的圖像進行目視，針對每個細胞判別了NF-κB的局部存在。與上述步驟S4同樣地進行了該判別。即，根據(jù)來自核的熒光圖像設定核的區(qū)域，將核的區(qū)域以外的區(qū)域作為細胞質(zhì)的區(qū)域。另外，在認為核的熒光強度為細胞質(zhì)的熒光強度的約2倍以上的情況下，判別為在該細胞中NF-κB局部存在于核中，在認為核的熒光強度小于細胞質(zhì)的熒光強度的約2倍的情況下，判別為在該細胞中NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中。

參照圖4(b)，說明針對用上述流式細胞儀識別的131個細胞判別了NF-κB的局部存在的結(jié)果。

判別為局部存在于核中的細胞的數(shù)量是44，判別為局部存在于細胞質(zhì)中的細胞的數(shù)量是87。無法判別局部存在的細胞的數(shù)量是0。此時的核局部存在率是44/131＝34％。

在此，說明僅根據(jù)高強度的熒光圖像判別了局部存在的比較例1和僅根據(jù)低強度的熒光圖像判別了局部存在的比較例2。在比較例1的情況下，判別為局部存在于核中的細胞的數(shù)量是42，判別為局部存在于細胞質(zhì)中的細胞的數(shù)量是10。熒光的強度過高，所以無法判別局部存在的細胞的數(shù)量是79。比較例1的核局部存在率是81％。在比較例2的情況下，判別為局部存在于核中的細胞的數(shù)量是16，判別為局部存在于細胞質(zhì)中的細胞的數(shù)量是84。熒光強度過低，所以無法判別局部存在的細胞的數(shù)量是31。比較例2的核局部存在率是16％。

如以上那樣，根據(jù)本驗證可知，在如實施方式1那樣根據(jù)強度不同的2個熒光圖像判別局部存在的情況下，關于在比較例1、2的情況下不可判別的細胞，也能夠判別NF-κB的局部存在。另外可知，在如實施方式1那樣判別局部存在的情況下，不可判別的細胞少，所以能夠精度良好地判別細胞中的NF-κB的局部存在。因此，根據(jù)實施方式1，能夠?qū)⒉豢膳袆e的細胞的數(shù)量抑制得較低，精度良好地判別NF-κB的局部存在。由此，例如，即使從被檢者提取的細胞少的情況下，也能夠在確保能夠判別的細胞的同時，精度良好地判別NF-κB的局部存在。

在實施方式1中，作為被檢測物質(zhì)的分布狀況的判別，示出了判別NF-κB的局部存在狀況的例子，但在被檢測物質(zhì)的分子的量發(fā)生變化的情況下，也可以判別該分子的量。在該情況下，操作者用熒光物質(zhì)11、12標識分子，處理裝置根據(jù)從熒光物質(zhì)11、12產(chǎn)生的強度不同的2個熒光，獲取圖像。操作者在分子的量多的情況下，使用低強度的熒光圖像來判別量，在分子的量少的情況下，使用高強度的熒光圖像來判別量。由此，能夠精度良好地判別分子的量。

<實施方式1的裝置結(jié)構>

說明用于根據(jù)實施方式1的細胞信息獲取方法對細胞圖像進行攝像并判別細胞中的被檢測物質(zhì)的局部存在的細胞信息獲取裝置的結(jié)構。

如圖5所示，細胞信息獲取裝置100具備處理部110、試樣調(diào)制部120、光學檢測部130、驅(qū)動部140、顯示部150、輸入部160以及存儲部170。

處理部110由微型計算機以及CPU等構成。存儲部170由RAM、ROM、硬盤等構成。存儲部170存儲由處理部110執(zhí)行的處理程序、圖像等各種數(shù)據(jù)。處理部110在與細胞信息獲取裝置100的各部之間進行信號的發(fā)送接收，控制各部。在處理部110中，通過存儲在存儲部170中的程序，賦予獲取部111和解析部112的功能。

試樣調(diào)制部120依照圖1的步驟S1，混合細胞和試劑，由此調(diào)制試樣。也可以由操作者進行試樣的調(diào)制。在該情況下，從細胞信息獲取裝置100省略試樣調(diào)制部120。光學檢測部130是流式細胞儀。光學檢測部130對試樣中包含的細胞照射光，對產(chǎn)生的熒光進行攝像。隨后，參照圖6說明光學檢測部130的結(jié)構。驅(qū)動部140驅(qū)動后述光學檢測部130的光源301～304。

顯示部150由顯示器構成。顯示部150顯示針對每個細胞獲取的圖像、針對每個細胞判別的NF-κB的局部存在、NF-κB局部存在于核中的細胞數(shù)、NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中的細胞數(shù)、核局部存在率以及細胞質(zhì)局部存在率等。輸入部160由鼠標以及鍵盤構成。操作者經(jīng)由輸入部160針對細胞信息獲取裝置100輸入指示。

如圖6所示，光學檢測部130具備流通池200、光照射部300、聚光部400以及受光部501～504。在流通池200中形成了流路210，在流路210中，流過利用試樣調(diào)制部120調(diào)制的試樣。在圖6中，為方便起見，圖示了相互正交的XYZ軸。

光照射部300對在流通池200中流通的試樣中包含的細胞照射光，從圖2所示的熒光物質(zhì)11、12產(chǎn)生強度不同的熒光。另外，光照射部300對細胞照射光而使得從圖2所示的熒光物質(zhì)13產(chǎn)生熒光，進而，對細胞照射明視場用的光。光照射部300具備光源301～304、聚光透鏡311～314以及二向色鏡321、322。

光源301～304由半導體激光源構成。從光源301～304射出的光分別是波長λ1～λ4的激光。波長λ1～λ4分別是例如488nm、647nm、405nm、785nm。波長λ1～λ3是如圖2所示用于從熒光物質(zhì)11～13激勵熒光的光。聚光透鏡311～314分別對從光源301～304射出的光進行聚光。二向色鏡321使波長λ1的光透射，使波長λ2的光反射。二向色鏡322使波長λ1、λ2的光透射，使波長λ3的光反射。

這樣，光照射部300對在流路210中流動的試樣中包含的細胞，以相互重疊的狀態(tài)照射從光源301～303射出的波長λ1～λ3的光。另外，光照射部300對被照射波長λ1～λ3的流路210的位置，照射波長λ4的光。如果對在流通池200中流動的試樣照射波長λ1～λ3的光，則如參照圖2說明那樣從熒光物質(zhì)11～13產(chǎn)生不同的波長段的熒光。如果對在流通池200中流動的試樣照射波長λ4的光，則該光透射細胞。透射了細胞的波長λ4的光被用于明視場圖像的獲取。

在此，光源301以高功率射出波長λ1的光，光源302以低功率射出波長λ2的光。通過圖5所示的驅(qū)動部140，控制光源301、302的射出功率。由此，如參照圖2說明那樣從熒光物質(zhì)11產(chǎn)生的熒光成為高強度，從熒光物質(zhì)12產(chǎn)生的熒光成為低強度。此外，在該實施方式1以及后述實施方式2、3中，也可以不調(diào)整光源301以及302的射出功率。通過選擇即便是同一射出功率但所得到的熒光強度有差異的熒光標識，從熒光物質(zhì)11產(chǎn)生的熒光成為高強度，從熒光物質(zhì)12產(chǎn)生的熒光成為低強度。

聚光部400使通過波長λ1～λ3的光的照射從流通池200產(chǎn)生的熒光聚光。聚光部400使從熒光物質(zhì)11～13產(chǎn)生的熒光分別聚光到受光部501～503。另外，聚光部400使從流通池200產(chǎn)生的波長λ4的光聚光到受光部504。聚光部400具備聚光透鏡401、濾光片部件411～413、421～424以及聚光透鏡431～434。

聚光透鏡401使從在流通池200中流動的試樣產(chǎn)生的熒光和透射了在流通池200中流動的試樣的波長λ4的光聚光。濾光片部件411～413由二向色鏡構成。

濾光片部件411使通過聚光透鏡401聚光的光中的、波長段B1的光反射，使波長段B1以外的光透射。濾光片部件421僅使通過濾光片部件411反射的光中的、波長段B1的光透射，遮斷波長段B1以外的光。這樣，濾光片部件411、421構成為只能夠分離從流通池200產(chǎn)生的光中的、波長段B1的熒光。同樣地，濾光片部件412、422構成為只能夠分離從流通池200產(chǎn)生的光中的、波長段B2的熒光，濾光片部件413、423構成為只能夠分離從流通池200產(chǎn)生的光中的、波長段B3的熒光。濾光片部件424使透射了濾光片部件411～413的光中的、波長λ4的光透射，遮斷波長λ4以外的光。

受光部501接受通過聚光透鏡431聚光的波長段B1的光，將基于接受到的光的圖像信息作為攝像信號輸出。受光部502接受通過聚光透鏡432聚光的波長段B2的光，將基于接受到的光的圖像信息作為攝像信號輸出。受光部503接受通過聚光透鏡433聚光的波長段B3的光，將基于接受到的光的圖像信息作為攝像信號輸出。受光部504接受通過聚光透鏡434聚光的波長λ4的光，將基于接受到的光的圖像信息作為攝像信號輸出。受光部501～504由例如彩色CCD等攝像元件構成。

聚光部400使波長段B1～B3的光和波長λ4的光分別聚光到受光部501～504，但也可以在1個受光部中成像。在該情況下，光學檢測部130構成為：使波長段B1～B3的光和波長λ4的光在受光部的受光面上在不同的區(qū)域中成像。

在圖6所示的結(jié)構中，為了分離波長段B1的光而使用了多個濾光片部件，但也可以如圖7所示，通過1個濾光片部件分離從流通池200產(chǎn)生的光。如圖7所示，聚光部400具備聚光透鏡441～444、濾光片部件451～454以及聚光透鏡461～464。波長段B1～B3的光分別通過濾光片部件451～453被分離，波長λ4的光通過濾光片部件454被分離。

接下來，參照圖8的流程圖，說明通過細胞信息獲取裝置100進行圖1的步驟S4的處理的情況。

如圖8所示，在步驟S11中，處理部110驅(qū)動試樣調(diào)制部120，與圖1的步驟S1同樣地，用熒光物質(zhì)11、12標識細胞中包含的NF-κB，用熒光物質(zhì)13標識細胞中包含的核，來調(diào)制試樣。在步驟S12中，處理部110使試樣流入流通池200，通過驅(qū)動部140驅(qū)動光源301～304，對在流通池200中流動的細胞照射光。在步驟S13中，處理部110通過受光部501～503對波長段B1～B3的熒光進行攝像，通過受光部504對波長λ4的光進行攝像。然后，處理部110的獲取部111根據(jù)受光部501～504輸出的攝像信號，獲取圖像。

在步驟S14中，處理部110的解析部112從高強度和低強度的熒光圖像，選擇能夠進行局部存在的判別的圖像。具體而言，解析部112選擇高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像中的、從圖像獲取的熒光的強度例如圖像整體的亮度處于預定的范圍內(nèi)的圖像。由此，熒光的強度極端地大的圖像、熒光的強度極端地小的圖像與圖3的圖像32、圖像41同樣地無法判別NF-κB的局部存在，所以從在判別中使用的圖像去掉。

另外，解析部112選擇高強度和低強度的熒光圖像中的、細胞的解析對象部位處的熒光強度與解析對象部位以外的細胞中的熒光強度之差比預定的閾值大的圖像。在實施方式1中，解析對象部位是核。即，選擇核內(nèi)的熒光強度與核外的細胞的熒光強度之差比預定的閾值大的圖像。由此，核內(nèi)與核外的熒光強度之差小的圖像與圖3的圖像32、圖像41同樣地無法判別NF-κB的局部存在，所以從在判別中使用的圖像去掉。

接下來，在步驟S15中，解析部112使用在步驟S14中選擇的圖像，針對每個細胞判別細胞中的NF-κB的局部存在。即，解析部112計算細胞的解析對象部位處的NF-κB的局部存在量相對細胞整體中的NF-κB的局部存在量的比例。例如，解析部112在步驟S14中選擇的圖像中，將核的區(qū)域中的熒光的強度除以細胞整體的區(qū)域中的熒光強度。解析部112在除法結(jié)果是2以上的情況下，判別為NF-κB局部存在于核中，在除法結(jié)果比2小的情況下，判別為NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中。判定除法結(jié)果的值不限于2，也可以是其它值。

此外，在步驟S14中選擇了2個圖像的情況下，在步驟S15中，針對兩方的圖像，如上所述取得除法結(jié)果并判別局部存在。另外，在步驟S14中未選擇圖像的情況下，在步驟S15中，該細胞的局部存在視為“不可判別”。

在步驟S16中，解析部112根據(jù)進行了處理的所有細胞的判別結(jié)果，計算上述核局部存在數(shù)、細胞質(zhì)局部存在數(shù)、核局部存在率以及細胞質(zhì)局部存在率。在步驟S17中，處理部110將在步驟S16中計算出的數(shù)值、針對每個細胞獲取的圖像以及每個細胞的判別結(jié)果等顯示于顯示部150。具體而言，處理部110將包括上述內(nèi)容的畫面161顯示于顯示部150。

如圖9所示，畫面161具備區(qū)域161a、161b。區(qū)域161a顯示核局部存在數(shù)、細胞質(zhì)局部存在數(shù)、核局部存在率以及細胞質(zhì)局部存在率。區(qū)域161b顯示圖像和NF-κB的局部存在的判別結(jié)果。在區(qū)域161b中，用實線包圍在步驟S15中用于局部存在的判別的圖像，以知道在局部存在判別中使用了該圖像。

在步驟S13中獲取的熒光信息也可以是表示隨時間變化的熒光強度的波形信號。在該情況下，在光學檢測部130中，作為受光部501～503，分別配置光電倍增管等光檢測器。3個光檢測器接受波長段B1的高強度的熒光、波長段B2的低強度的熒光以及波長段B3的熒光，分別輸出表示各熒光的強度的波形信號。

如圖10所示，解析部112根據(jù)光檢測器輸出的波形信號，在是NF-κB的發(fā)現(xiàn)量少的細胞的情況下，例如獲取圖表51、52，在是NF-κB的發(fā)現(xiàn)量多的細胞的情況下，例如獲取圖表61、62。另外，解析部112根據(jù)光檢測器輸出的波形信號，獲取與核對應的圖表。解析部112根據(jù)與圖表51、52同時獲取的核的圖表，在圖表51、52中設定與核對應的波形的寬度W1，根據(jù)與圖表61、62同時獲取的核的圖表，在圖表61、62中設定與核對應的波形的寬度W2。

根據(jù)圖表51，熒光的峰值處于閾值Sh1、Sh2之間，在與核對應的寬度W1中存在波形的峰值，所以解析部112能夠判別為NF-κB局部存在于核中。另一方面，根據(jù)圖表52，熒光的峰值比閾值Sh1小，所以解析部112無法判別NF-κB的局部存在。根據(jù)圖表61，熒光的峰值比閾值Sh2大，所以解析部112無法判別NF-κB的局部存在。另一方面，根據(jù)圖表62，熒光的峰值處于閾值Sh1、Sh2之間，在與核對應的寬度W2中存在波形的凹陷，所以解析部112能夠判別為NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中。因此，在該情況下，也與如圖3所示使用圖像的情況同樣地能夠通過強度不同的2個熒光來精度良好地判別NF-κB的局部存在。

<實施方式2>

在實施方式2中，并非使用2個光，而是僅使用波長λ1的光來獲取相互不同的強度的熒光。在實施方式2中，相比于實施方式1，圖1所示的細胞信息獲取方法的步驟中的、只有步驟S1、S2中的一部分步驟不同。以下，說明與實施方式1不同的步驟。

在步驟S1中，如圖11所示，用熒光波長相互不同的熒光物質(zhì)14、15標識細胞中包含的NF-κB。熒光物質(zhì)14、15是熒光色素。熒光物質(zhì)14如果被照射波長λ1的光，則激勵與實施方式1的熒光物質(zhì)11同樣的波長段的熒光。熒光物質(zhì)15如果被照射波長λ1的光，則激勵與圖2的熒光物質(zhì)12同樣的波長段的熒光。即，熒光物質(zhì)14、15的激勵用的光的波長實質(zhì)上相同。

在步驟S2中，包含用熒光物質(zhì)14、15、13標識的細胞的試樣流入到流通池，波長λ1、λ3的光照射到在流通池中流動的細胞，從熒光物質(zhì)14、15、13產(chǎn)生熒光。從熒光物質(zhì)14、15產(chǎn)生的熒光分別通過濾光片部件21、22而成為波長段B1、B2的熒光。此時，熒光物質(zhì)14、15構成為，波長段B1的熒光成為高強度，波長段B2的熒光成為低強度。

在實施方式2的裝置結(jié)構中，相比于實施方式1，省略了圖6所示的光學檢測部130中的、光源302、聚光透鏡312以及二向色鏡321。

在實施方式2中，也與實施方式1同樣地，能夠產(chǎn)生波長段B1的高強度的熒光和波長段B2的低強度的熒光，獲取高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像。因此，與實施方式1同樣地，能夠根據(jù)高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像，精度良好地解析細胞中的分布以及量多種多樣的NF-κB。

<實施方式3>

在實施方式3中，并非使用2個光和2個熒光物質(zhì)，而是使用1個波長λ1的光和1個熒光物質(zhì)11，獲取相互不同的強度的熒光。在實施方式3中，相比于實施方式1，圖1所示的細胞信息獲取方法的步驟中的、只有步驟S1、S2中的一部分步驟不同。以下，說明與實施方式1不同的步驟。

在步驟S1中，如圖12所示，僅用與實施方式1同樣的熒光物質(zhì)11標識細胞中包含的NF-κB。此時，熒光物質(zhì)11也可以經(jīng)由1個抗體而與NF-κB結(jié)合。在步驟S2中，包含用熒光物質(zhì)11、13標識的細胞的試樣流入到流通池，波長λ1、λ3的光照射到在流通池中流動的細胞，從熒光物質(zhì)11、13產(chǎn)生熒光。

如圖12所示，將從熒光物質(zhì)11產(chǎn)生的熒光分割為2個，使一方通過與實施方式1同樣的濾光片部件21，使另一方通過與實施方式1同樣的濾光片部件22。濾光片部件21僅使波長段B1的光透射，濾光片部件21僅使波長段B4的光透射。如圖13所示，波長段B1包含例如從熒光物質(zhì)11產(chǎn)生的熒光的強度為峰值的波長。波長段B4例如被設定為比波長段B1大的波長段、并且、被設定為不與波長段B1重疊的波長段。由此，如圖12所示，通過了濾光片部件21的波長段B1的熒光成為高強度，通過了濾光片部件22的波長段B4的熒光成為低強度。

此外，波長段B1也可以未必包含從熒光物質(zhì)11產(chǎn)生的熒光的強度為峰值的波長。波長段B4也可以設定為比波長段B1小的波長段，也可以與波長段B1重疊一部分。

<實施方式3的驗證>

接下來，說明發(fā)明人進行的實施方式3的驗證。

1.準備

作為細胞，準備了人類心臟微小血管內(nèi)皮細胞(HMVEC-C)(Lonza CatNo.CC-7030，Lot No.0000296500(P4))。作為一次抗體，準備了NF-κB p65(D14E12)XP Rabbit mAb(Cell Signaling Technologies #8242S)。作為二次抗體，準備了Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Secondary Antibody，Alexa Fluor 647 conjugate(Life technologies A-21245)。對二次抗體，作為熒光色素，結(jié)合了Alexa Fluor 647。另外，準備了EGM-2MV Medium(Lonza Cat No.CC-3202)、EGM-2MV SingleQuots Kit(LonzaCat No.CC-3202)、PBS pH7.4(GIBCO Cat No.10010-023)、BSA(LAMPIRE Cat No.7500805)、PFA(WAKO Cat No.160-16061)、TritonX100(Nacalai Tesque CatNo.35501-15)。

2.試劑調(diào)制

對500mL的EGM-2MV Medium添加EGM-2MV SingleQuots Kit，制作了培養(yǎng)基。在利用pH12的PBS溶解多聚甲醛以其最終濃度為8％w/v之后，調(diào)整為pH7.4。對PBS加上1.5g的BSA并溶解而補足成50mL，調(diào)制了3％BSA/PBS。對PBS加上0.5g的BSA并溶解而補足成50mL，調(diào)制了1％BSA/PBS。利用PBS調(diào)制TritonX100以其最終濃度為0.1％w/v。

3.步驟

HMVEC-C是遵照制造商推薦協(xié)議，利用EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng)的。在本驗證中使用了從購入后起繼代次數(shù)為6次以內(nèi)的細胞。關于培養(yǎng)基，將開封后的使用期限設為3周期間。關于TNF-α刺激培養(yǎng)，去除約70％合流的HMVEC-C細胞的培養(yǎng)上清，加上以成為最終濃度25ng/mL的方式添加了Recombinant Human TNF-alpha的EGM-2MV培養(yǎng)基，并在37℃的CO₂恒溫箱內(nèi)靜置了1小時。保留3mL左右而用電動移液器去除培養(yǎng)基，并用刮刀剝離了細胞。加上與回收的懸浮液等量的8％PFA/PBS，在室溫下反應了15分鐘。在室溫下，以1000rpm進行了3分鐘的離心分離。將細胞顆粒用1mL的PBS沖洗了2次。去除上清，加上1mL的0.1％Triton X-100/PBS，在室溫下反應了15分鐘。在室溫下，以1000rpm進行了3分鐘的離心分離。用1mL的1％BSA/PBS沖洗了2次。去除上清，加上1mL的3％BSA/PBS，在室溫下靜置了30分鐘。在3％BSA/PBS中添加了1/1600的400μL的一次抗體。在室溫下反應了1小時。在室溫下，以1000rpm進行了3分鐘的離心分離。用1mL的1％BSA/PBS進行了沖洗。在3％BSA/PBS中添加了1/1000的400μL的二次抗體。在室溫下反應了30分鐘。用1mL的1％BSA/PBS沖洗了2次。去除上清，添加了50μL的1％BSA/PBS。

4.利用流式細胞儀進行檢測

作為能夠獲取熒光圖像的流式細胞儀，使用了ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer(Merck Millipore)。使依照上述3調(diào)制出的試樣流入到該流式細胞儀的流通池中，對在流通池中流動的試樣，照射了波長647nm的激光。波長647nm的激光與圖12所示的波長λ1的激光對應。波長647nm的激光的射出功率為10mW。通過對標識NF-κB的熒光色素照射波長647nm的激光，產(chǎn)生了熒光。

在上述流式細胞儀中，經(jīng)由透射波長段642nm～740nm的濾光片部件，對通過波長647nm的激光產(chǎn)生的熒光進行攝像，獲取了高強度的熒光圖像。另外，經(jīng)由透射波長段740nm～800nm的濾光片部件，對通過波長647nm的激光產(chǎn)生的熒光進行攝像，獲取了低強度的熒光圖像。此外，在上述流式細胞儀中，通過濾光片部件等來去除了不需要的波長段的光，以使成為對象的波長段的光適當?shù)厝肷涞绞芄獠俊?/p>

參照圖14(a)、(b)，說明通過上述檢測來獲取的圖像。

“高強度的熒光”和“低強度的熒光”分別是基于從標識了NF-κB的熒光色素產(chǎn)生的高強度的熒光的圖像和基于從標識了NF-κB的熒光色素產(chǎn)生的低強度的熒光的圖像。在圖14(a)、(b)中，橫向排列的2個圖像是從1個細胞獲取的圖像。各圖像是為方便起見對所獲取的彩色圖像進行灰階化而得到的圖像。在各圖像中，白的部分表示熒光的強度強。

在圖14(a)所示的3個細胞的情況下，基于低強度的熒光的圖像的強度過低，所以難以判別NF-κB的局部存在。另一方面，基于高強度的熒光的圖像的強度適當，所以能夠判別為NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中。在圖14(b)所示的3個細胞的情況下，基于高強度的熒光的圖像的強度過高，所以難以判別NF-κB的局部存在。另一方面，基于低強度的熒光的圖像的強度適當，所以能夠判別為NF-κB局部存在于細胞質(zhì)中。

如以上那樣，根據(jù)本驗證可知，即使在如實施方式3那樣根據(jù)強度不同的2個熒光圖像判別局部存在的情況下，也能夠判別NF-κB的局部存在。這樣，根據(jù)實施方式3，使從1種熒光色素產(chǎn)生的熒光通過使不同的波長段的熒光通過的濾光片部件21、22來獲取2個熒光圖像，由此能夠針對1個細胞在一次的測定中正確地獲取NF-κB的局部存在。

<實施方式3的裝置結(jié)構>

如圖15所示，在實施方式3的裝置結(jié)構中，相比于實施方式1，省略圖6所示的光學檢測部130中的、光源302、聚光透鏡312以及二向色鏡321，代替濾光片部件412、422而分別追加濾光片部件414、425。濾光片部件414使透射了濾光片部件411的光中的、波長段B4的光反射，使波長段B4以外的光透射。濾光片部件425僅使通過濾光片部件414反射的光中的、波長段B4的光透射，遮斷波長段B4以外的光。這樣，濾光片部件414、425構成為能夠僅分離從流通池200產(chǎn)生的光中的、波長段B4的熒光。受光部502對波長段B4的低強度的熒光進行攝像。

在實施方式3中，也與實施方式1同樣地，使得分別產(chǎn)生高強度的熒光和低強度的熒光，能夠獲取高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像。因此，與實施方式1同樣地，能夠根據(jù)高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像，精度良好地解析細胞中的分布以及量多種多樣的NF-κB。

<實施方式4>

在實施方式4中，相比于實施方式1，圖1所示的細胞信息獲取方法的步驟中的、只有步驟S1、S2中的一部分步驟不同。以下，說明與實施方式1不同的步驟。

在步驟S1中，如圖16所示，僅用與實施方式1同樣的熒光物質(zhì)11標識細胞中包含的NF-κB。在步驟S2中，包含用熒光物質(zhì)11、13標識的細胞的試樣流入到流通池，波長λ1、λ3的光照射到在流通池中流動的細胞，從熒光物質(zhì)11、13產(chǎn)生熒光。此時，針對細胞以高功率照射波長λ1的光，所以透射濾光片部件21的波長段B1的熒光與實施方式1同樣地成為高強度。進而，使該細胞在流通池內(nèi)移動，對移動的細胞照射波長λ1的光，從熒光物質(zhì)11產(chǎn)生熒光。此時，針對細胞以低功率照射波長λ1的光。因此，透射濾光片部件21的波長段B1的熒光成為低強度。

在實施方式4的裝置結(jié)構中，相比于實施方式1，省略圖6所示的光學檢測部130中的、光源302、聚光透鏡312、二向色鏡321、濾光片部件412、422、聚光透鏡432以及受光部502。另外，如圖17所示，在實施方式3的裝置結(jié)構中，相比于實施方式1，對光照射部300追加光源305和聚光透鏡315，對聚光部400追加聚光透鏡471、濾光片部件472以及聚光透鏡473。另外，在實施方式3的裝置結(jié)構中，相比于實施方式1，追加受光部505。

此外，圖17是在與XY平面平行的方向上觀察了光學檢測部130的圖。在圖17中，為方便起見，關于光照射部300，圖示了在Y軸正方向上觀察的狀態(tài)，關于聚光部400和受光部505，圖示了在X軸負方向上觀察的狀態(tài)。

在流通池200的流路210中，對位置211照射從光源301射出的波長λ1的光。光源305與光源301同樣地構成，以比光源301低的功率射出光。聚光透鏡315使從光源305射出的光聚光到在流路210中位于位置211的Z軸正側(cè)的位置212。聚光透鏡471使從位置212產(chǎn)生的熒光聚光。濾光片部件472僅使由聚光透鏡471聚光的光中的、波長段B1的光透射。受光部505接受由聚光透鏡473聚光的波長段B1的低強度的光，將基于接受到的光的圖像信息作為攝像信號輸出。

預先取得細胞從位置211對位到位置212的時間T。由此，如果在通過受光部501接受到基于某個細胞的光之后，經(jīng)過時間T，則基于同一細胞的光被受光部505接受。因此，能夠?qū)⒏鶕?jù)受光部501獲取的圖像和根據(jù)受光部505獲取的圖像與從同一細胞獲取的圖像對應起來。

在實施方式4中，也與實施方式1同樣地，使得分別產(chǎn)生高強度的熒光和低強度的熒光，能夠獲取高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像。因此，與實施方式1同樣地，能夠根據(jù)高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像，精度良好地解析細胞中的分布以及量多種多樣的NF-κB。

<實施方式5>

在實施方式5中，相比于實施方式1，圖1所示的細胞信息獲取方法的步驟中的、只有步驟S2中的一部分步驟不同。以下，說明與實施方式1不同的步驟。

在步驟S2中，如圖18所示，包含用熒光物質(zhì)11～13標識的細胞的試樣流入到流通池，波長λ1～λ3的光照射到在流通池中流動的細胞，從熒光物質(zhì)11～13產(chǎn)生熒光。從熒光物質(zhì)11、12產(chǎn)生的熒光合起來入射到濾光片部件24。濾光片部件24由棱鏡構成。從熒光物質(zhì)11、12產(chǎn)生的熒光根據(jù)波長段的差異而通過濾光片部件24分成波長段B1的熒光和波長段B2的熒光。在此，與實施方式1同樣地，針對細胞以高功率照射波長λ1的光，針對細胞以低功率照射波長λ的光。由此，與實施方式1同樣地，透射濾光片部件21的波長段B1的熒光成為高強度，透射濾光片部件22的波長段B2的熒光成為低強度。

此外，也可以是，從熒光物質(zhì)11～13產(chǎn)生的熒光合起來入射到濾光片部件24，根據(jù)波長段的差異通過濾光片部件24分別分成波長段B1～B3的熒光。在此，示出了針對實施方式1的結(jié)構使用的例子，但也可以在實施方式2～4的結(jié)構中使用濾光片部件24。

如圖19所示，在實施方式5的裝置結(jié)構中，相比于實施方式1，省略圖6所示的光學檢測部130中的、濾光片部件411、412、421、422，對聚光部400追加濾光片部件481。濾光片部件481由棱鏡構成。

從在流通池200中流動的試樣產(chǎn)生的熒光入射到濾光片部件481。根據(jù)熒光的波長，從濾光片部件481以不同的角度射出入射到濾光片部件481的熒光。聚光透鏡431和受光部501配置于與從濾光片部件481射出的熒光中的波長段B1的熒光對應的方向。由此，受光部501能夠?qū)ΣㄩL段B1的高強度的熒光進行攝像。聚光透鏡432和受光部502配置于與從濾光片部件481射出的熒光中的波長段B2的熒光對應的方向。由此，受光部502能夠?qū)ΣㄩL段B2的低強度的熒光進行攝像。

在實施方式5中，也與實施方式1同樣地，使得分別產(chǎn)生高強度的熒光和低強度的熒光，能夠獲取高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像。因此，與實施方式1同樣地，能夠根據(jù)高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像，精度良好地解析細胞中的分布以及量多種多樣的NF-κB。

<實施方式6>

在實施方式6中，使基質(zhì)接觸到細胞中包含的被檢測物質(zhì)來使得產(chǎn)生熒光物質(zhì)，對產(chǎn)生的熒光物質(zhì)照射光，根據(jù)通過光的照射從熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光，判別被檢測物質(zhì)的局部存在狀況。在實施方式6中，被檢測物質(zhì)是細胞質(zhì)。基質(zhì)包括當接觸到被檢測物質(zhì)時被切斷的切斷部位，如果切斷部位被切斷則產(chǎn)生熒光物質(zhì)。更具體而言，基質(zhì)通過接觸到作為被檢測物質(zhì)的細胞質(zhì)，被存在于細胞質(zhì)中的酶切斷。在實施方式6中，根據(jù)來自標識細胞質(zhì)的熒光物質(zhì)的熒光，判定細胞質(zhì)的局部存在。此外，被檢測物質(zhì)也可以是例如細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)、細胞小器官、細胞膜等除了細胞中包含的細胞質(zhì)以外的物質(zhì)。

在實施方式6中，相比于實施方式3，圖1所示的細胞信息獲取方法的步驟中的、步驟S1中的一部分的步驟不同。以下，說明與實施方式3不同的步驟。

在步驟S1中，如圖20所示，細胞和基質(zhì)16a混合?；|(zhì)16a是當通過細胞質(zhì)中包含的酯酶加水分解時產(chǎn)生熒光物質(zhì)16b的物質(zhì)。如果細胞和基質(zhì)16a混合，則透射了細胞膜的基質(zhì)16a通過與細胞質(zhì)接觸，通過細胞質(zhì)中包含的酯酶加水分解，產(chǎn)生熒光物質(zhì)16b。這樣，利用熒光物質(zhì)16b標識細胞質(zhì)。

接下來，與實施方式3同樣地，進行步驟S2以后的處理。即，在步驟S2中，包含用熒光物質(zhì)16b標識的細胞的試樣流入到流通池，如圖20所示，波長λ1、λ3的光照射到在流通池中流動的細胞，分別從熒光物質(zhì)16b、13產(chǎn)生熒光。然后，如圖20所示，從熒光物質(zhì)16b產(chǎn)生的熒光分割成2個，使一方通過濾光片部件21，使另一方通過濾光片部件22。由此，與實施方式3同樣地，透射了濾光片部件21的波長段B1的熒光成為高強度，透射了濾光片部件22的波長段B4的熒光成為低強度。此外，基于實施方式6的裝置與實施方式3同樣地構成。

在實施方式6中，也與實施方式3同樣地，使得產(chǎn)生強度不同的2個熒光，能夠獲取高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像。因此，能夠根據(jù)高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像，精度良好地判別細胞質(zhì)的局部存在。這樣，如果能夠精度良好地判別細胞質(zhì)的局部存在，則能夠精度良好地定義細胞質(zhì)的范圍。由此，例如，能夠?qū)⒓毎|(zhì)的范圍與其它解析組合而進行更詳細的解析。另外，例如，能夠使細胞質(zhì)的范圍在細胞等的研究中發(fā)揮作用。

<實施方式6的驗證>

接下來，說明發(fā)明人進行的實施方式6的驗證。

1.準備

作為細胞，準備了人類心臟微小血管內(nèi)皮細胞(HMVEC-C)(Lonza CatNo.CC-7030，Lot No.0000296500(P4))。作為細胞質(zhì)標識試劑，準備了Cell Explorer Fixable Live Cell Tracking Kit*Green Fluorescence*(Cosmobio 22621)。細胞質(zhì)標識試劑包含與圖20所示的基質(zhì)16a對應的物質(zhì)。細胞質(zhì)標識試劑具有疏水性。細胞質(zhì)標識試劑通過細胞膜，由于通過細胞內(nèi)酯酶加水分解而產(chǎn)生熒光物質(zhì)。在此產(chǎn)生的熒光物質(zhì)與圖20所示的熒光物質(zhì)16b對應。作為核染色色素，準備了Cellstain Hoechst 33342 solution(DOjinDO H342)。另外，準備了EGM-2MV Medium(Lonza Cat No.CC-3202)、EGM-2MV SingleQuots Kit(LonzaCat No.CC-3202)、PBS pH7.4(GIBCO Cat No.10010-023)、BSA(LAMPIRE Cat No.7500805)、PFA(WAKO Cat No.160-16061)、TritonX100(Nacalai Tesque CatNo.35501-15)。

2.試劑調(diào)制

對500mL的EGM-2MV Medium添加EGM-2MV SingleQuots Kit，制作了培養(yǎng)基。在利用pH12的PBS溶解多聚甲醛以其最終濃度為8％w/v之后，調(diào)整為pH7.4。對PBS加上1.5g的BSA并溶解而補足成50mL，調(diào)制了3％BSA/PBS。對PBS加上0.5g的BSA并溶解而補足成50mL，調(diào)制了1％BSA/PBS。利用PBS調(diào)制TritonX100以其最終濃度為0.1％w/v。在Track kit Green的瓶中添加100μL的DMSO，制作1000×Track kit Green stock solution，對Kit附屬的Assay buffer添加1/1000量，從而調(diào)整了Track kit working solution。

3.步驟

HMVEC-C是遵照制造商推薦協(xié)議，利用EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng)的。在本驗證中，使用了從購入后起繼代次數(shù)為6次以內(nèi)的細胞。關于培養(yǎng)基，將開封后的使用期限設為3周期間。在將細胞按照70％合流培養(yǎng)之后，保留3mL左右的培養(yǎng)基并用電動移液器去除培養(yǎng)基，用刮刀剝離了細胞。對回收的3mL的懸浮液添加3μL的Track kit working solution，在37℃的CO₂恒溫箱內(nèi)靜置了30分鐘。在靜置了30分鐘之后，在室溫下，以1000rpm進行了3分鐘的離心分離。將細胞顆粒用5mL的PBS沖洗3次。去除上清，添加了50μL的1％BSA/PBS。

4.利用流式細胞儀進行檢測

作為能夠獲取熒光圖像的流式細胞儀，使用了ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer(Merck Millipore)。使依照上述3調(diào)制的試樣流入到該流式細胞儀的流通池，對在流通池中流動的試樣照射了波長488nm、405nm的激光。波長488nm、405nm的激光與圖20所示的波長λ1、λ3的激光對應。波長488nm、405nm的激光的射出功率分別為50mW、20mW。由于波長488nm的激光照射到標識細胞質(zhì)的熒光色素而產(chǎn)生了熒光。由于波長405nm的激光照射到核染色色素而產(chǎn)生了熒光。

在上述流式細胞儀中，經(jīng)由透射波長段480nm～560nm的濾光片部件，對通過波長488nm的激光產(chǎn)生的熒光進行攝像，獲取了高強度的熒光圖像。另外，經(jīng)由透射波長段560nm～595nm的濾光片部件，對通過波長488nm的激光產(chǎn)生的熒光進行攝像，獲取了低強度的熒光圖像。經(jīng)由透射波長段420nm～505nm的濾光片部件，對通過波長405nm的激光產(chǎn)生的熒光進行攝像，獲取了與核對應的熒光圖像。另外，對在流通池中流動的試樣照射了波長設定為420nm～480nm之間的激光。經(jīng)由透射波長段420nm～480nm的濾光片部件，對該激光透射了細胞后的光進行攝像，獲取了明視場圖像。此外，在上述流式細胞儀中，通過濾光片部件等來去除了不需要的波長段的光，以使成為對象的波長段的光適當?shù)厝肷涞绞芄獠俊?/p>

參照圖21，說明通過上述檢測來獲取的圖像。

“明視場”表示細胞的明視場圖像?！案邚姸鹊臒晒狻焙汀暗蛷姸鹊臒晒狻狈謩e是基于從標識了細胞質(zhì)的熒光色素產(chǎn)生的高強度的熒光的圖像和基于從標識了細胞質(zhì)的熒光色素產(chǎn)生的低強度的熒光的圖像?！皝碜院说臒晒狻笔腔趶膶诉M行了染色的核染色用色素產(chǎn)生的熒光的圖像。橫向排列的4個圖像是從1個細胞獲取的圖像。為方便起見，明視場圖像以外的圖像是對所獲取的彩色圖像進行灰階化而得到的圖像。在明視場圖像以外的圖像中，白的部分表示熒光的強度強。

在最上段所示的細胞以及最上段的下1段所示的細胞的情況下，基于低強度的熒光的圖像的強度過低，所以細胞質(zhì)的局部存在不清楚。另一方面，基于高強度的熒光的圖像的強度適當，所以能夠精度良好地判別細胞質(zhì)的局部存在。在最下段所示的細胞以及最下段的上1段所示的細胞的情況下，基于高強度的熒光的圖像的強度過高，所以難以判別細胞質(zhì)的局部存在。另一方面，基于低強度的熒光的圖像的強度適當，所以能夠精度良好地判別細胞質(zhì)的局部存在。

如以上那樣，根據(jù)本驗證可知，如果如實施方式6那樣基于強度不同的2個熒光圖像，則能夠判別細胞質(zhì)的局部存在。這樣，根據(jù)實施方式6可知，使從標識細胞質(zhì)的1種熒光色素產(chǎn)生的熒光通過使不同的波長段的熒光通過的濾光片部件21、22來獲取2個熒光圖像，由此能夠針對1個細胞在一次的測定中正確地獲取細胞質(zhì)的局部存在。

<實施方式7>

在實施方式7中，使2種基質(zhì)接觸到細胞中包含的被檢測物質(zhì)來使得產(chǎn)生2種熒光物質(zhì)，對產(chǎn)生的2種熒光物質(zhì)照射光，根據(jù)通過光的照射從2種熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光，判別被檢測物質(zhì)的局部存在狀況。即，在實施方式7中，并非如實施方式6那樣使用1個光，而是使用相互不同的波長的光來獲取相互不同的強度的熒光。此外，也可以使1種基質(zhì)接觸到被檢測物質(zhì)來使得產(chǎn)生2種熒光物質(zhì)。

在實施方式7中，相比于實施方式6，圖1所示的細胞信息獲取方法的步驟中的、只有步驟S1、S2中的一部分步驟不同。以下，說明與實施方式6不同的步驟。

在步驟S1中，如圖22所示，細胞和基質(zhì)17a、18a混合?；|(zhì)17a、18a是當通過細胞質(zhì)中包含的酯酶加水分解時分別產(chǎn)生熒光物質(zhì)17b、18b的物質(zhì)。熒光物質(zhì)17b、18b分別構成為當被照射波長λ1、λ2的光時激勵相互不同的波長段的熒光。如果細胞和基質(zhì)17a、18a混合，則透射了細胞膜的基質(zhì)17a、18a與細胞質(zhì)接觸，從而通過細胞質(zhì)中包含的酯酶加水分解，產(chǎn)生熒光物質(zhì)17b、18b。這樣，利用熒光物質(zhì)17b、18b標識細胞質(zhì)。

在步驟S2中，包含用熒光物質(zhì)17b、18b標識的細胞的試樣流入到流通池，如圖22所示，波長λ1、λ2、λ3的光照射到在流通池中流動的細胞，分別從熒光物質(zhì)17b、18b、13產(chǎn)生熒光。此時，以高功率對細胞照射波長λ1的激光，以低功率對細胞照射波長λ2的激光。通過使從熒光物質(zhì)17b產(chǎn)生的熒光通過濾光片部件21來成為波長段B1的熒光。通過使從熒光物質(zhì)18b產(chǎn)生的熒光通過濾光片部件22來成為波長段B2的熒光。這樣，通過了濾光片部件21的波長段B1的熒光成為高強度，通過了濾光片部件22的波長段B2的熒光成為低強度。此外，基于實施方式7的裝置與實施方式1同樣地構成。

在實施方式7中，也與實施方式6同樣地，能夠產(chǎn)生強度不同的2個熒光，獲取高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像。因此，與實施方式6同樣地，能夠根據(jù)高強度的熒光圖像和低強度的熒光圖像，精度良好地判別細胞質(zhì)的局部存在。