從生物組織分離細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及從生物組織分離細(xì)胞的方法。更詳細(xì)地，涉及通過調(diào)整蛋白質(zhì)分解酶的使用量，能夠有效地穩(wěn)定并分離具有高的生物活性的細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
在哺乳類、鳥類、爬行類及魚類等多細(xì)胞動(dòng)物的肝臟、胰臟、腎臟、牙周組織、皮膚、軟骨、骨及神經(jīng)組織等各種臟器及組織、以及ES細(xì)胞組織、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的原材料用纖維芽細(xì)胞組織中存在的細(xì)胞或細(xì)胞集合體(細(xì)胞簇)的酶的離析在細(xì)胞移植或細(xì)胞株建立、治療及診斷、檢查等廣泛的用途中有用。例如，正在進(jìn)行通過將從胰臟離析的胰島移植給患者來治愈糖尿病的醫(yī)療。在胰島移植中，在胰臟組織中存在的稱為胰島的細(xì)胞集合體的分離是必須的，此時(shí)，需要使胰島不受到損壞地分解胰臟組織，將胰島分離。另夕卜，正在通過將從肝臟分離的肝細(xì)胞移植給患者，進(jìn)行肝功能衰竭等的治療。
為了使生物組織解離，從而使生物組織所含有的細(xì)胞或細(xì)胞集合體游離，需要使細(xì)胞等游離為所希望的程度，并從生物組織的其他部分分離。通過酶的離析，將細(xì)胞等從生物組織分離時(shí)，需要用膠原酶等蛋白質(zhì)分解酶對(duì)細(xì)胞間基質(zhì)進(jìn)行處理。
生物組織由細(xì)胞和細(xì)胞間基質(zhì)(細(xì)胞間物質(zhì))構(gòu)成。細(xì)胞間物質(zhì)是連接細(xì)胞的物質(zhì)，其具有結(jié)構(gòu)物和無結(jié)構(gòu)物。結(jié)構(gòu)物有膠原纖維、彈性纖維及網(wǎng)狀纖維等纖維。無結(jié)構(gòu)物是填充在纖維之間的成分并被稱為基質(zhì)的、溶膠或凝膠狀的物質(zhì)，其有糖蛋白質(zhì)及蛋白聚糖。
細(xì)胞間物質(zhì)的代表為稱為膠原蛋白(Collagen)的蛋白質(zhì)，其占生物體內(nèi)總蛋白質(zhì)重量的約1/3。膠原蛋白呈纖維結(jié)構(gòu)，并被正式地稱為膠原蛋白纖維、膠原纖維。
組織大致分為上皮組織、支持組織、肌肉組織及神經(jīng)組織4種。上皮組織為覆蓋身體或臟器表面的組織且細(xì)胞密度高、細(xì)胞間物質(zhì)不介于其間。支持組織起到支持身體、臟器及細(xì)胞等的作用，并包括結(jié)締組織、軟骨組織、骨組織、血液及淋巴。肌肉組織為以收縮運(yùn)動(dòng)為目的的分化后的細(xì)胞的融合，細(xì)胞間物質(zhì)所占的比例極少。肌肉組織雖然由肌細(xì)胞、結(jié)締組織、血管及神經(jīng)構(gòu)成，但主要的結(jié)構(gòu)物為肌纖維。神經(jīng)組織主要構(gòu)成神經(jīng)內(nèi)膜和神經(jīng)束膜，均含有大量細(xì)胞間物質(zhì)(膠原蛋白)。
結(jié)締組織為支持組織之中的I種，是指脂肪組織和纖維性結(jié)締組織。作為纖維性結(jié)締組織的構(gòu)成成分，有膠原纖維、彈性纖維。另外，纖維性結(jié)締組織大致分為疏水性結(jié)締組織和致密結(jié)締組織。疏水性結(jié)締組織是指采用膠原蛋白不規(guī)則排列的纖維性結(jié)締組織，并分布于皮下組織、粘膜組織、神經(jīng)、血管外膜及小葉間組織等。
構(gòu)成膠原蛋白的肽鏈的氨基酸具有如下特征:具有甘氨酸-氨基酸X-氨基酸Y”和甘氨酸每3個(gè)殘基重復(fù)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。已知人膠原蛋白有約30種分子種類存在。在體內(nèi)存在最豐富的是纖維性的I型膠原蛋白。非纖維性的膠原蛋白IV也大量含有，并介由分子間二硫鍵互相連結(jié)，參與網(wǎng)狀組織的形成(非專利文獻(xiàn)I)。報(bào)告了在胰島和內(nèi)分泌組織之間，存在膠原蛋白VI (非專利文獻(xiàn)2、3)。
關(guān)于組織分解用酶，就來自溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)的各種粗膠原酶而言，除了膠原酶以外，還包括各種蛋白酶(膠原蛋白分解活性及非特異性蛋白質(zhì)分解活性)和非蛋白酶成分(磷脂酶等)。正在進(jìn)行利用這種粗膠原酶從大部分生物組織的細(xì)胞及細(xì)胞簇的酶的分離。
已知胰島組織也通過選自來自溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)的2種膠原酶(ColG及ColH)、蛋白酶(嗜熱菌蛋白酶、分散酶或來自溶組織梭菌的中性蛋白酶(NP))的蛋白質(zhì)分解酶來分解(專利文獻(xiàn)1、2)。例如，已知優(yōu)選使用溶組織梭菌生產(chǎn)的2種膠原酶及I種中性金屬蛋白酶(非專利文獻(xiàn)4)。報(bào)告了從生物組織對(duì)細(xì)胞等進(jìn)行酶的分離時(shí)，在分離的細(xì)胞等的收率及生物活性方面，2種膠原酶起著重要的作用(非專利文獻(xiàn)5)。
另外，報(bào)告了與酶混合物示出的α-N-苯甲?；?L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)分解活性成比例，從人的胰臟的胰島分離數(shù)多(專利文獻(xiàn)I及非專利文獻(xiàn)6)。作為具有BAEE分解活性的酶，溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)產(chǎn)生的梭菌蛋白酶(CP)是已知的。
生物組織中的細(xì)胞間基質(zhì)的狀態(tài)(特別是膠原蛋白的含量)根據(jù)物種、年齡、性別、組織、生活環(huán)境等的不同而不同。膠原蛋白在哪個(gè)組織的哪種狀態(tài)的基質(zhì)中，含有怎樣的程度尚未明確。膠原蛋白從哺乳類至魚類廣泛地存在，由各個(gè)物種引起的結(jié)構(gòu)膠原蛋白的不同也不明確。
認(rèn)為對(duì)于特定類型的膠原蛋白是否在生物組織中的基質(zhì)中存在，可通過使用針對(duì)各類型的膠原蛋白的抗體的免疫染色來決定。但是，由于膠原蛋白的種類多，膠原蛋白廣泛存在于多細(xì)胞動(dòng)物，因此抗體的制造難等成為瓶頸，其實(shí)現(xiàn)困難。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn):
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開第1996/00283號(hào)專利文獻(xiàn)2:國(guó)際公開第1998/24889號(hào)非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) l:1noue et al.，J Cell B1l，97，1524-1539 (1983)
非專利文獻(xiàn) 2:SJ Hughes P McShane, Transplant Proceedings,37，3444-34445(2005)
非專利文獻(xiàn) 3:SJ Hughes，A Clark, P McShane, Transplantat1n,81(3)423-426(2006)
非專利文獻(xiàn) 4:E Linetsky et al.，Diabetes，46，1120-1123 (1997)
非專利文南犬 5:D Brandhorst et al.， Transplantat1n Proceedings，37(8)，3450-3451(2005)
非專利文獻(xiàn) 6:H Brandhorst et al.，Transplantat1n，87 (3)，370-375 (2009)

【發(fā)明內(nèi)容】

發(fā)明要解決的課題
從生物組織分離細(xì)胞或細(xì)胞集合體時(shí)，不將作為分離對(duì)象的細(xì)胞等表面分解或損壞，通過蛋白質(zhì)分解酶僅將構(gòu)成生物組織的細(xì)胞間基質(zhì)及臟器的各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分解是不容易的。另外，如上所述，生物組織中的細(xì)胞間基質(zhì)的狀態(tài)(特別是膠原蛋白的含量)根據(jù)物種、年齡、性別、組織、生活環(huán)境等的不同而不同。特別是關(guān)于膠原蛋白，年齡增加導(dǎo)致的物性的變化顯著。
雖然已知根據(jù)人的臟器的情況、年齡、性別、生活習(xí)慣、病歷等不同，對(duì)蛋白質(zhì)分解酶的活性是不同的，但情況是至今未開發(fā)出決定最適合的分解酶的種類、量的方法，只能根據(jù)經(jīng)驗(yàn)決定酶的種類或酶反應(yīng)時(shí)間來進(jìn)行離析。關(guān)于胰島分離，醫(yī)務(wù)人員根據(jù)某協(xié)議將酶的量設(shè)為大致一定，僅將分解時(shí)間作為變量，通過目視確認(rèn)胰臟的分解程度，并進(jìn)行胰臟的酶處理。因此，通過作為對(duì)象的胰臟的狀態(tài)而獲得的胰島的數(shù)量和品質(zhì)不統(tǒng)一。
鑒于上述情況，本發(fā)明的主要目的是提供一種能夠從生物組織中有效地穩(wěn)定并分離具有高的生物活性的細(xì)胞的細(xì)胞分離方法。
解決課題的方法
為解決上述課題，本發(fā)明提供以下的方法。
[1]一種從生物組織分離細(xì)胞的方法，其特征在于，使用分解酶組合物，所述分解酶組合物通過在一定量的中性蛋白酶和/或來自梭菌屬(Clostridium, sp)的蛋白酶中，根據(jù)所述生物組織的主要蛋白質(zhì)的組成加入該主要蛋白質(zhì)的分解酶用量而形成。
[2]根據(jù)[I]記載的方法，其包括:決定所述生物組織的主要蛋白質(zhì)的組成的步驟；在一定量的中性蛋白酶和/或來自梭菌屬(Clostridium, sp)的蛋白酶中，根據(jù)決定的組成加入所述主要蛋白質(zhì)的分解酶用量，調(diào)制分解酶組合物的步驟；利用調(diào)制的分解酶組合物處理所述生物組織的步驟。
根據(jù)該方法，可以由生物組織