用于細胞檢測和分離的微流體分揀器的制造方法
【專利說明】用于細胞檢測和分離的微流體分揀器
【背景技術】
[0001]傳統(tǒng)宏觀細胞分離方法包括:采用膜類過濾器的物理過濾法；以及利用細胞大小、 變形性及密度差異過濾出目標細胞的密度梯度離心法。這些技術均為勞動密集型工藝，而 且需要實施多步驟的樣本制備過程。這些過程可能引入人為現(xiàn)象，或者導致所需細胞的損 失。此外，膜過濾方法易發(fā)生堵塞且需要頻繁清理。另外，已有報告證明，經過濾及離心技術 處理的目標細胞的原始表現(xiàn)型會發(fā)生機械應力所致變化。
[0002] 因此，很顯然地，需要開發(fā)更加簡單有效的血樣處理技術，以減小細胞損失并為后 續(xù)分析保持目標細胞的原始表現(xiàn)型。

【發(fā)明內容】

[0003] 微流體在長度上具有較小尺寸，因此可在血液分離過程中實現(xiàn)更佳的細胞微環(huán)境 控制，從而極其適用于初步血樣處理。許多研究組已展示了芯片內血液分析法在紅細胞 (RBC)變形性研究、血小板和血漿分離、白細胞分離、以及血液中循環(huán)腫瘤細胞(CTC)或胎兒 細胞等罕量細胞的分離等不同方面的應用。然而，這些微流體系統(tǒng)因主要限制于樣本稀釋 或流量較低造成的低處理量，而不適合處理體積通常為數(shù)毫升的臨床血樣。本文描述了可 克服上述問題的微流體裝置。
[0004] 在本發(fā)明的第一種具體表現(xiàn)形式中，提供一種檢測個人樣本中的一種或多種循環(huán) 腫瘤細胞(CTC)的方法，包括:將所述樣本導入微流體裝置的至少一個入口，所述微流體裝 置包括一個或多個螺旋形通道，其中，每個通道具有長度和截面，所述截面的高度和寬度定 義了適于根據細胞大小沿所述通道截面各部分分離循環(huán)腫瘤細胞的高寬比；當所述循環(huán)腫 瘤細胞存在時，該細胞則沿所述通道的徑向最內部分流至第一出口，而所述樣本中的其他 細胞沿所述通道的另一部分流至第二出口，從而檢測出所述個人樣本中的一種或多種循環(huán) 腫瘤細胞。
[0005]各實施方式可具有許多優(yōu)點，包括:在較高流量下連續(xù)運行而不使樣本發(fā)生化學 改性，從而實現(xiàn)更快的臨床樣品處理速度，并減少處理時間和成本；以及/或者收集活細胞， 用于后續(xù)生物測定。
【附圖說明】
[0006] 以下，通過對附圖展示的例示實施方式進行更加具體的描述，上述內容將變得容 易理解。各附圖中，類似附圖標記指代相同部件。各附圖并非一定按比例繪制，相反，其重點 在于對實施方式進行說明。
[0007] 圖1A和圖1B為具有單入口和八等分出口（標為1~8)的PDMS制螺旋形CTC分離微通 道(該微通道內填有可視化染料)的照片。圖1A還示出了所述螺旋形微通道出口部分的顯微 圖像。
[0008] 圖2為CTC分離螺旋形分揀器的示意圖。在入口處，血液細胞(RBC、白細胞以及CTC) 隨機分布于微通道截面上。在慣性升力和迪恩禍(Dean vortices)的影響下，這些細胞根據 大小，在所述截面的不同位置處達到平衡，其中，較大的CTC在最靠近微通道內側壁處達到 平衡。其后，利用所述八個均勻間隔的出口提取各個細胞流，從而實現(xiàn)分離。
[0009]圖3為本發(fā)明超高處理量CTC分離芯片的工作原理示意圖。其中，全血經該裝置的 內側入口栗送，而鞘液經外側入口輸入。在迪恩拖曳力的影響下，較小血液細胞(RBC和WBC) 因所述曲線形通道的幾何形狀而隨兩個反向旋轉渦流(剖面圖）朝通道外側壁迀移。此外， CTC因其較大的尺寸而承受較強的慣性升力，該力使得CTC沿所述微通道內側壁達到平衡， 從而實現(xiàn)分離。
[0010]圖4A和圖4B為表明所述螺旋形微通道出口處的RBC、白細胞和CTC的平均合成圖像 4A和掃描曲線圖4B。如圖所示，血液細胞(RBC和白細胞)在迪恩拖曳力的影響下轉移至通道 外半部分，而較大的CTC在慣性升力的影響下在通道內側壁附近發(fā)生聚集。
[0011] 圖5包括根據一種實施方式的微流體裝置曲線形通道俯視圖5a~5d，以及利用半 迪恩周期細胞分離原理分離細胞的相應方法示意圖。
[0012] 圖6包括根據另一實施方式的微流體裝置螺旋形通道俯視圖6a~6d，以及利用單 全迪恩周期原理分離細胞的相應方法示意圖。
[0013] 圖7為圖5a或圖6a中用于將CTC與樣本中其他細胞分離的微流體裝置的制造方法 流程圖。
[0014] 圖8a所示為根據另一實施方式的本發(fā)明生物芯片俯視圖，該生物芯片設有微通 道，該微通道具有兩個相對并聯(lián)設置的曲線形部分。
[0015] 圖8b所示為具有阻尼器822的單個圓弧部分820。
【具體實施方式】
[0016] 各實施方式可總體涉及微流體裝置，以及該裝置用于從含有兩種或更多（多種)細 胞類型（如細胞集合或細胞混合物）的樣本中檢測和/或分離出一種或多種特定類型細胞 (如待檢測和/或待分離的目標細胞）的用途。具體而言，本發(fā)明可用于許多將細胞/顆粒分 離的高分辨率和高處理能力作為重要要求的環(huán)境及生物用途。更具體地，下述實施方式涉 及具有簡單曲線形微通道幾何形狀的微流體裝置，所述幾何形狀用于實現(xiàn)基于尺寸和慣性 的細胞/顆粒分離。所述微流體裝置包括用于引入所述樣本的一個或多個入口，一個或多個 樣本流經通道，以及一個或多個出口，通常為至少兩個出口，其中，樣本中的待檢測和/或待 分離細胞流經所述出口中的一個出口（如第一出口），樣本中的其余細胞不與待分離細胞流 經同一出口，而是/或者流經另一(不同）出口（如第二出口）。所述一個或多個通道中的每個 通道均具有長度和截面，所述截面的高度和寬度定義了適于沿所述通道截面的至少一部分 分離所述目標細胞的高寬比，其中，所述目標細胞沿每個通道的第一部分流至第一出口，而 其余細胞沿每個通道的第二部分流過，而且不與所述目標細胞流經相同出口，并且/或者流 經一個或多個(不同，如第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八等）出口。
[0017] 如本文所述，所述微流體裝置可具有一個或多個(至少一個)入口，用于將所述樣 本導入該裝置中。舉例而言，所述裝置可具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八 個、九個、十個等入口。
[0018] 所述樣本可采用本領域技術人員已知的各種技術導入所述裝置中。舉例而言，所 述樣本可由注射器和/或栗導入所述裝置中。
[0019] 同樣地，所述微流體裝置可具有一個或多個出口。在某些方面，所述裝置可具有一 個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個等出口。在一個具體方面，所述裝置 具有至少兩個出口。在另一方面，所述裝置具有三個出口。在另外一方面，所述裝置具有四 個出口。在其他方面，所述裝置具有八個出口。
[0020] 所述裝置還包括將所述一個或多個入口連接至所述一個或多個出口的一個或多 個通道(例如平行通道，如一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個等平行 通道）。所述各通道包括截面，該截面的高度和寬度定義了可將目標細胞與樣本中其余細胞 分離的高寬比。本文中，高寬比是指通道高度除以其寬度之比，該高寬比為所述通道提供了 合適的截面，以使目標細胞沿該通道截面的至少一部分流至第一出口，而其余細胞則沿該 通道的不同（如第二、第三、第四等）部分或截面流動，從而不與所述目標細胞流至相同出 口，而是流至不同（如第二、第三、第四等）出口。所述合適高寬比使得樣本中的目標細胞根 據其結構特征與樣本中其余細胞的相同或相似結構特征之間的差異，流經所述通道的不同 部分。此類結構特征例如包括細胞大小、剛性、變形性、黏附性（如細胞黏附性)等。舉例而 言，如本文所示，可采用1、2.5、3.75、5或7的高寬比。
[0021] 在一個具體方面中，所述通道為一螺旋。舉例而言，所述螺旋形通道的高度處于約 1 Ομπι和約200μηι之間的范圍內，例如約100μπι和約140μηι之間。所述螺旋形通道的寬度可處于 約100μπι和約500μηι之間的范圍內。所述螺旋形通道的長度可處于約1 cm和約100cm之間的范 圍內。
[0022] 所述樣本可以各種流量流經所述微流體裝置，例如生理流量(如小動脈生理流量） 或非生理流量。例示流量包括約2千萬細胞/分鐘，或處于約2.5毫升/分鐘和約5微升/分鐘 之間的范圍內。
[0023]本文所述微流體裝置可用于從細胞樣本中檢測、分離和/或離析目標細胞。所述細 胞樣本可例如為血液(例如全血）、血漿、腹水、淋巴、髓液、尿液、組織等生物樣本。所述樣本 還可以為細胞培養(yǎng)樣本。在一個具體方面，所述樣本為血液樣本(例如全血樣本）。所述血液 樣本具有低的紅細胞比容(例如約1~10%)，或高的紅細胞比容(例如約20~50%)。
[0024] 血液為一種復雜的細胞血漿懸浮液(細胞約占血液體積的40~45% )，而且起到包 括向細胞運輸氧氣和營養(yǎng)、移除細胞廢液以及提供免疫保護在內的若干關鍵作用。紅細胞 (RBC)占所有血液細胞組分的>99 % (每毫升全血約有5 X 109個RBC)，其余的〈1 %由外周血 白細胞(PBL)和血小板組成。由于其復雜特性，采用微流體生物芯片分析血液一直是一個難 題。除了RBC和白細胞之外，在患者外周血中還存在胎兒有核紅細胞、循環(huán)腫瘤細胞(CTC)、 干細胞以及白血病細胞等低豐度細胞，這些細胞可用于患者監(jiān)測、疾病診斷、治療監(jiān)測以及 實施基礎科學研究等各種生物醫(yī)學應用。然而，由于這些細胞數(shù)量極其稀少，因此在幾乎所 有分析之前，均需要實施富集或分離步驟，以從血液中有效地分離出此類細胞。
[0025] 由此可見，本文所述的一個或多個微流體裝置(例如以并聯(lián)或串聯(lián)等方式級聯(lián)的 微流體裝置)可用于各種目的，而且在一個方面，可用于各種目標細胞的檢測、分離和/或離 析。各種目標細胞均可被檢測出?？蓹z測出的目標細胞例如包括病變細胞(如被瘧疾感染的 紅細胞、白血病紅細胞、鐮狀細胞貧血紅細胞或其組合，非同步混合物中的同步細胞，以及 循環(huán)腫瘤細胞(CTC)等病變血細胞）。
[0026] 在另一方面，所述微流體裝置可用于循環(huán)腫瘤細胞的檢測、分離和/或離析。在所 有癌癥相關死亡中，癌癥轉移以及腫瘤形成所帶來的致命性后果約占90 %。具體而言，在癌 癥轉移患者的外周血中，已發(fā)現(xiàn)了活的腫瘤衍生上皮細胞，即所謂的循環(huán)腫瘤細胞或CTC。 這些CTC負責外滲至較遠的器官，以形成新的轉移位點，從而將癌癥擴散。臨床報告顯示， CTC的存在數(shù)目通常與疾病階段相關，而且可用作預后指標。除了上述在預后方面的意義，