本發(fā)明分子生物學領域，具體涉及一種基于DNA條形碼技術的魚類及其生肉制品品質(zhì)監(jiān)管方法及其系統(tǒng)。

背景技術：

現(xiàn)代商品零售業(yè)條形碼編碼系統(tǒng)是一種由計算機按一定編碼規(guī)則排列的條、空符號組成的信息系統(tǒng)，原理是通過N個數(shù)字的排列組合得到10^N種編碼方式，每一種編碼代表一種商品，依次區(qū)分不同類型商品，實現(xiàn)商品信息的自動化掃描。類似地，DNA序列作為遺產(chǎn)信息載體有A、T、G、C四種堿基，那么從理論上講，只需10個堿基位點就能出現(xiàn)4¹⁰種(大于10億)編碼方式，遠大于現(xiàn)存物種的數(shù)目。但在現(xiàn)實自然界中生物的進化是要受到自然選擇的影響，這就導致了在某些位點上的堿基是固定不變的，從而減少了編碼組合的數(shù)量。由于分子生物學技術的應用，尤其是聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)技術及基因測序技術的快速發(fā)展，可以短時間內(nèi)獲取幾百個堿基甚至更長的特異性DNA序列。近代分子生物學技術的興起，為生物分類學科注入了新的活力。

DNA條形碼(Barcoding)是一種近幾年剛剛興起的新技術，它的原理是利用基因組DNA上一個標準的或者大家公認的基因片段，作為分子靶標來進行大范圍掃描完成種級水平的物種鑒定。我國是魚肉消費大國，魚類及其生肉制品種類繁多，包括生魚片、海鮮、冷凍加工品(魚片或者魚段)、烤魚片及魚糜制品等。近年來魚類及其生肉制品的摻假行為頻頻曝光，給人們的健康造成嚴重威脅。目前我國的魚類生產(chǎn)企業(yè)缺乏有效的信息化規(guī)范管理手段，造成魚類產(chǎn)地來源不明、不同種類標價混亂，消費者對購買的魚類產(chǎn)品缺乏有效的信息獲取途徑，這些問題制約了我國水產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。由于產(chǎn)品流通環(huán)節(jié)較多、加之藥物殘渣、毒素等因素的存在，導致了偽劣的魚肉制品產(chǎn)品質(zhì)量下降，威脅著人民健康。如何快速有效的識別魚類在生物多樣性的保護、生態(tài)學調(diào)查、魚類資源的開發(fā)利用等諸多領域至關重要且具有廣泛的應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于DNA條形碼技術的水產(chǎn)品商業(yè)化監(jiān)管方法及其系統(tǒng)，可準確、高效的完成魚類及其生肉制品的快速鑒定。

本發(fā)明技術方案：

一種基于DNA條形碼技術的魚類及其生肉制品品質(zhì)監(jiān)管方法，包括如下步驟：

步驟一、分子生物學手段獲得魚類制品分子條形碼序列：提取樣品基因組DNA、特異性引物設計、測序及數(shù)據(jù)處理；

步驟二、DNA條形碼數(shù)據(jù)庫鑒定：進行序列相似比對，分析遺傳距離，獲得魚種類鑒定結果；

步驟三、根據(jù)步驟二鑒定魚種類結果結合其生肉制品的商品信息輸出二維碼標識：基于魚類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫平臺按照產(chǎn)品批次生成二維碼圖像，打印、粘貼防水標簽；

步驟四、不同移動終端掃描二維碼，立即可獲得魚類及其生肉制品信息，追溯任意同類產(chǎn)品信息。

優(yōu)選地，所述步驟一魚肉制片樣品DNA條形碼有效序列長度大于50bp。

優(yōu)選地，所述步驟一作為DNA條形碼片段為線粒體COI序列。

優(yōu)選地，所述步驟一特異性引物序列為：

COI1-F：TCAACCAACCACAAAGACATTGGCACR，

COI1-R：TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA；

COI2-F：TCTCAACCAACCACAAAGACATTGG，

COI2-R：GACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA；

COI3-F：TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC，

COI3-R：TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。

優(yōu)選地，所述步驟一魚肉制片的樣品來源為魚類組織樣本或血液樣本，所述組織樣本包括鰭條、肌肉、鱗片和粘液。

優(yōu)選地，所述步驟二相似性比對獲得魚類物種名，相同種類魚類DNA條形碼相似性比對相似度高達99％，不同種類魚類及其生肉制品間的遺傳距離>2％。

優(yōu)選地，所述步驟三中DNA條形碼數(shù)據(jù)庫作為整個系統(tǒng)的工作平臺，實現(xiàn)基因條形碼與商品信息一一對應，自動生成一個唯一的二維碼。

進一步優(yōu)選地，所述二維碼包含物種圖像、DNA條形碼圖解、物種序列、產(chǎn)品名稱、單位規(guī)格、儲藏方法、流通表單、魚類產(chǎn)地、養(yǎng)殖情況、生產(chǎn)操作記錄、產(chǎn)品加工記錄、產(chǎn)品檢測記錄或其他詳細溯源信息，實現(xiàn)魚類質(zhì)量溯源信息的管理。

進一步優(yōu)選地，所述二維碼防水標簽粘貼在商品包裝表面或者固定在魚類尾部鰭條，所述二維碼采用的材料為可食用油墨，所述可食用油墨包括按重量份計的以下組分：食用色素色劑10-35份；食用連接料20-85份；魔芋葡聚糖0.001-0.05份；食用納米SiO₂ 0.5-5份。

更進一步優(yōu)選地，所述的食用連接料包括下述重量份的組分：水20-80份；油20-80份；乳化劑0.01-20份。

更進一步優(yōu)選地，所述的油為大豆油，甘油，氫化大豆油，氫化蓖麻油、精制玉米油或橄欖油的其中之一或者任意組合。

更進一步優(yōu)選地，所述的乳化劑卵磷脂、黃原膠，聚山梨酯80或阿拉伯膠的其中之一或者任意組合。

將食用色素色劑、魔芋葡聚糖加入水中，攪拌溶解，再一次加入食用連接料、魔芋葡聚糖、食用納米SiO₂溶解，研磨得到食用油墨。

優(yōu)選地，所述步驟三二維碼防水標簽可以通過智能手機可以是GPRS網(wǎng)絡、3G網(wǎng)絡、4G網(wǎng)絡和WiFi網(wǎng)絡中的任意一種查看產(chǎn)品的信息。

本發(fā)明有益效果如下：

1、本發(fā)明能在缺乏專業(yè)鑒定人員情況下對魚類及其生肉制品不同大小或者殘缺個體進行準確鑒定，具有準確、迅速、便捷和費用低的特點。

2、本發(fā)明鑒定方法對使用的儀器要求較低，一般分子生物學實驗室均可進行，測序長度要求較短，在滿足準確鑒定魚類種類前提下，大大節(jié)約測序成本。

3、本發(fā)明中魚類及生肉制品獨有一個二維碼，不同種類、個體和批次產(chǎn)品間均有差異，不易偽造和仿造。此信息具備唯一可靠性，具備“一物一碼，全程追溯”特征，避免張冠李戴。

4、本發(fā)明形成了現(xiàn)代化水產(chǎn)品信息服務系統(tǒng)生產(chǎn)者-產(chǎn)品-消費者之間的生態(tài)鏈，魚類制品二維碼與生產(chǎn)、流通和銷售等環(huán)節(jié)相關聯(lián)，養(yǎng)殖、加工、銷售的各個環(huán)節(jié)相關聯(lián)的個人、企業(yè)或者相關部門都被完整記錄下來，這種現(xiàn)代化水產(chǎn)品信息服務系統(tǒng)利于有關部門對魚類及其生肉制品生產(chǎn)經(jīng)營活動的監(jiān)督管理。

5、二維碼具有儲存量大、安全性高的特點，包含除了文字和數(shù)字外大量可供消費者參考的信息。

6、防水標簽粘貼在商品表面或者固定在魚類尾鰭，可防止商品流通過程中信息的損失。二維碼具備自動錯誤糾正能力，即使商品二維碼變臟或破損，也可自動恢復數(shù)據(jù)，適應產(chǎn)品流通中標簽一定程度的損壞。

7、二維碼信息中包含了DNA條形碼圖解，不同顏色標識不同堿基，更直觀的反映魚的基因信息，可追溯的信息更加準確、全面。二維碼是可以脫離數(shù)據(jù)庫而單獨使用可以用以消費者掃碼印制條件要求不高，可被多種閱讀設備識讀。

8、DNA條形碼有效序列長度大于50bp，已包含足夠的信息用于魚肉制品鑒定。

9、本發(fā)明采用的條形碼片段為線粒體COI(線粒體細胞色素C氧化酶I)，具備以下三個特點：一是與整個基因組DNA相比要短得多；二是在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)高，獲得技術簡單；三是序列非常保守，在物種內(nèi)不同個體之間只有1-2％的差異，而近緣種間的差異大，非常適合作為DNA條形碼技術的分子標記。對于魚類具有較高的物種識別能力，可大范圍進行種類掃描，減少魚類鑒定的工作量。

10、本發(fā)明僅采用三對特異性引物序列就完成常見魚類DNA條形碼PCR擴增，鑒定出魚的種類，減少工作量，節(jié)約人力物力。

11、本發(fā)明采用的二維碼材料為可食用的油墨，通過食用色素色劑、食用連接料、魔芋葡聚糖作為結構助劑、食用納米SiO₂組合，得到的食用油墨材料流動性與潤滑性好，可達到更好的分散懸浮和穩(wěn)定，且用量少、遮蔽力好、光澤優(yōu)、粒度細膩、成膜連續(xù)、均勻光滑、膜層薄、印刷圖像清晰、印刷適應性好；完全符合食用及藥用標準；腐蝕性小，無毒無害；耐油耐酸性，固色性能好。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的實現(xiàn)水產(chǎn)品商業(yè)化監(jiān)管的步驟流程圖；

圖2為本發(fā)明二維碼圖片；

圖3為本發(fā)明二維碼圖片掃描后顯示的信息。

具體實施方式

下面結合實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于實施例表述的范圍。

實施例1

1、材料

市場上采集紅鰭東方鲀、草魚、鯉魚、黃顙魚等4種各一條(表1)，全部樣本均由中華鱘研究所進行形態(tài)學鑒定。

表1魚類及生肉制品樣本及引物統(tǒng)計表

2、基因組DNA提取

取10mg左右的組織于1.5mL的離心管中，加入494μL的DNA裂解液和6μL的蛋白酶K(20mg/mL)；將離心管于56℃恒溫水浴鍋中裂解3小時，水浴完后，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)，搖勻至乳濁液，離心10min，12000r/min；吸取上清，轉入新的1.5mL離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)，搖勻至乳濁液，離心10min，12000r/min。吸取上清，轉入新的1.5mL離心管中，加入兩倍體積無水乙醇(提前預冷)，顛倒混勻，-20℃靜置30min，離心10min，12000r/min；棄去上清，75％乙醇洗滌2次；烘干后加入50μL dH₂O，溶解DNA；取2μL制備1％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，同時吸取1μL稀釋后使用紫外分光光度計進行檢測；將原液存放于-20℃冰箱保存。

3、PCR擴增和測序

PCR反應體系25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs(2.5Mm)1.0μL，TaKaRa Taq(5U/μL)0.5μL，引物各0.25μL，DNA模版1.0μL，去離子水19.0μL。PCR反應程序：95℃、3min；94℃、30s，52℃、40s，72℃、1min，35個循環(huán)；72℃、10min。PCR擴增完成后，以1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，挑選擴增成功且條帶單一的產(chǎn)物送測。

4、序列比對及分析

采用Chromas v2.3查看序列波峰圖，將測序成功的序列應用BioEdit 7.0軟件人工比對拼接，將處理過的DNA條形碼序列進行BLAST相似性比對，完成物種鑒定，MEGA分析序列間的K2P遺傳距離(見表2)。

表2 4種魚類K2P遺傳距離表

5、條形碼信息輸出

鑒定后的物種信息連同采集的生產(chǎn)信息在線制作二維碼圖標，輸出二維碼圖標見圖2。其中條形碼或二維條形碼包括產(chǎn)地、生成日期、商品流通等信息(圖3)。

6、條形碼信息查詢

利用一體機將魚肉制品的二維碼打印到防水標簽紙上，其中二維碼圖像為1.0cm*1.0cm，帶500萬分辨率攝像頭的智能手機經(jīng)測試可輕易掃描識別。商品二維碼信息在超市購物平臺、智能手機、掃描設備等讀取設備均可獲取，此信息具備唯一可靠性，不會與其他魚類混亂，具備“一物一碼，全程追溯”特征。非科研人員也可以直接通過掃描二維碼獲得該魚的具體信息。

所述二維碼防水標簽粘貼在商品包裝表面或者固定在魚類尾部鰭條，所述二維碼采用的材料為可食用油墨，所述可食用油墨包括食用色素：

實施例2

實施例1中的所述二維碼采用的材料為可食用油墨，所述可食用油墨包括按重量份計的以下組分：包括食用色素色劑10份；食用連接料20份；魔芋葡聚糖0.05份；食用納米SiO₂ 0.5份。

所述的食用連接料包括下述重量份的組分：水20份；油20份；乳化劑10份。

所述的油為大豆油。

所述的乳化劑卵磷脂。

將食用色素色劑、魔芋葡聚糖加入水中，攪拌溶解，再一次加入食用連接料、魔芋葡聚糖、食用納米SiO₂溶解，研磨得到食用油墨。

實施例3

實施例1中的所述二維碼采用的材料為可食用油墨，所述可食用油墨包括按重量份計的以下組分：食用色素色劑35份；食用連接料85份；魔芋葡聚糖0.03份；食用納米SiO₂3份。

所述的食用連接料包括下述重量份的組分：水40份；油60份；乳化劑15份。

所述的油為氫化蓖麻油。

所述的阿拉伯膠。

將食用色素色劑、魔芋葡聚糖加入水中，攪拌溶解，再一次加入食用連接料、魔芋葡聚糖、食用納米SiO₂溶解，研磨得到食用油墨。

實施例4

實施例1中的所述二維碼采用的材料為可食用油墨，所述可食用油墨包括按重量份計的以下組分：食用色素色劑22份；食用連接料34份；魔芋葡聚糖0.02份；食用納米SiO₂0.8份。

所述的食用連接料包括下述重量份的組分：水50份；油65份；乳化劑15份。

所述的油為氫化蓖麻油。

所述的乳化劑為卵磷脂與黃原膠按1：2的比例組合。

將食用色素色劑、魔芋葡聚糖加入水中，攪拌溶解，再一次加入食用連接料、魔芋葡聚糖、食用納米SiO₂溶解，研磨得到食用油墨。

實施例5

實施例1中的所述二維碼采用的材料為可食用油墨，所述可食用油墨包括按重量份計的以下組分：食用色素色劑65份；食用連接料75份；魔芋葡聚糖0.03份；食用納米SiO₂3份。

所述的食用連接料包括下述重量份的組分：水70份；油70份；乳化劑15份。

食用色素色劑為食用級炭黑、食用級辣椒紅、甜菜紅、紅曲紅、鐵紅，食用級梔子黃、姜黃素，食用級梔子藍、靛藍的其中其中之一或任意組合。

所述的油橄欖油。

所述的乳化劑為黃原膠。

將食用色素色劑、魔芋葡聚糖加入水中，攪拌溶解，再一次加入食用連接料、魔芋葡聚糖、食用納米SiO₂溶解，研磨得到食用油墨。

上述的實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，而不應視為對于本發(fā)明的限制，本申請中的實施例及實施例中的特征在不沖突的情況下，可以相互任意組合。本發(fā)明的保護范圍應以權利要求記載的技術方案，包括權利要求記載的技術方案中技術特征的等同替換方案為保護范圍。即在此范圍內(nèi)的等同替換改進，也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。