專利名稱：一種新型生物條形碼檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的檢測方法及其應(yīng)用，特別是涉及一種新型的簡易生 物條形碼檢測方法及其在生物檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物條形碼檢測技術(shù)(bio-bar codes assay, BCA)是美國西北大學(xué)Mirkin 教授領(lǐng)導(dǎo)的課題組于2003年首次報(bào)道的一種新型標(biāo)記免疫測定技術(shù)，其突出特點(diǎn) 是具有極高的靈敏度，可達(dá)常規(guī)ELISA方法的IO6倍(Nam JM, Thaxton CS, Mirkin CA.Nano—particle—based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins. Science,2003，301(5641) 1884-1886)。BCA技術(shù)的基本原理是利用被檢物單抗標(biāo)記的磁性微球探針(magnetic micropar-ticles, MMPs)和被檢物多抗及特異DNA雙鏈標(biāo)記的金納米顆粒探針 (nanoparticle,NP)，通過形成MMP-被檢物-NP三明治復(fù)合物后再利用去雜交將NP探針上 標(biāo)記的特異DNA鏈釋放出來，再通過常規(guī)PCR方法或芯片檢測方法(金標(biāo)銀染法)鑒定這 些釋放的DNA鏈就可確定被檢物的存在。BCA技術(shù)中，NP探針標(biāo)記有雙鏈DNA (48bp)和病原的多克隆抗體，雙鏈DNA的 其中一條和膠體金顆粒通過Au-S鍵相連，另一條和前者互補(bǔ)是用來指示被檢物的條形碼 DNA,每一個(gè)直徑為30nm的膠體金上大約標(biāo)記有400條左右的條形碼DNA鏈(Hurst SJ, Lytton-Jean AR,Mirkin CA. Maximizing DNA loading on a range of gold nanoparticle sizes. Anal Chem, 2006，78 =8313-8318) ；MMP探針是對應(yīng)于分選磁場的直徑約為1 μ m的磁 珠微球，其表面上包被有抗病原的單克隆抗體。BCA技術(shù)通過抗原抗體高度特異性反應(yīng)捕獲 抗原，再通過檢測條形碼DNA而實(shí)現(xiàn)對被檢物的間接檢測，由于雙鏈DNA標(biāo)記的一次放大以 及PCR反應(yīng)和芯片檢測的二次放大效應(yīng)，使檢測靈敏度得到極大提高。迄今為止，BCA技術(shù)已在某些病原標(biāo)志物的檢測上取得了很好的進(jìn)展。Nam等 人首先利用BCA技術(shù)對前列腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)進(jìn)行了 檢測，檢測下限可達(dá)3amol/L，比傳統(tǒng)ELISA方法低6個(gè)數(shù)量級(Nam JM, Thaxton CS, Mirkin CA. Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins. Science, 2003, 301 (5641) : 1884-1886)。Georganopoulou 等人利用 BCA 技術(shù)對 β-淀粉樣蛋白源性播散性配基(amyloid β -derived diffusible ligands，ADDL)進(jìn)行 了檢測，能在15 μ 1腦脊液中檢測至Ij 50個(gè)ADDL分子(Georganopoulou DG, Chang L，Nam JM, et al. Nano-particle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzh-eimer' s disease. Proc Natl Acad Sci,2005,102 (7) 2273-2276)。Stoeva等人利用BCA技術(shù)對血清中的三種腫瘤標(biāo)志物PSA、人體絨毛膜促 性腺激素(human chorionic gona-dotropin, HCG)禾口 α 月臺JL球蛋白(α -fetoprotein, AFP)進(jìn)行 了聯(lián)合檢測，檢測限度可達(dá) 170f mol/L(Stoeva Si，Lee JS, Smith JE, et al.Multiplexed detection of protein can—cer markers with biobarcodednanoparticle probes. Am Chem Soc,2006,128(26) :8378_8379)。綜上所述，BCA技術(shù)與現(xiàn)代標(biāo)記免疫檢測技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)-ELISA技術(shù)相比，具有非 常顯著的優(yōu)點(diǎn)，具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面(I)BCA技術(shù)顯示了比常規(guī)的ELISA方法高出六 個(gè)數(shù)量級(100萬倍)的敏感性；(2)針對不同的被檢物設(shè)計(jì)不同長度和序列的條形碼DNA， 可分析復(fù)雜樣本中的多種物質(zhì)；(3)具有較高的特異性，其特異性決定于檢測系統(tǒng)使用的 單克隆抗體的特異性，只要使用高特異的抗目標(biāo)檢物的單克隆抗體就能保證檢測系統(tǒng)的高 特異性；(4)檢測范圍廣，只要被檢物具有單抗和多抗，就可對其進(jìn)行檢測，這使得它在檢 測一些不適宜用PCR技術(shù)檢測的微量物質(zhì)方面具有很大的優(yōu)勢。但是，從BCA技術(shù)檢測的過程和顯示體系可以看出，這種技術(shù)存在著明顯的缺陷。 在PCR反應(yīng)中，由于模板、試劑、焦磷酸鹽分子的聚集等因素影響聚合酶反應(yīng)，最終導(dǎo)致PCR 反應(yīng)不再以指數(shù)形式進(jìn)行而進(jìn)入“平臺期”，一些反應(yīng)的終產(chǎn)物比另一些要多，因此終點(diǎn)PCR 反應(yīng)方法定量不準(zhǔn)確；其次，終點(diǎn)PCR容易交叉污染，產(chǎn)生假陽性。傳統(tǒng)BCA技術(shù)標(biāo)記的DNA 為雙鏈，長度為48bp左右，不僅操作繁瑣、檢測過程冗長，而且也間接影響到檢測靈敏度， 此外還不適宜于進(jìn)行基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，不能對樣品模板進(jìn)行精確 定量分析。條形碼DNA的芯片檢測由于銀染試劑自身的缺點(diǎn)而易產(chǎn)生假陽性，陰陽性不易 界定，染色結(jié)果因時(shí)間、環(huán)境因素變化很大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于病原抗原高靈敏度檢測的生物條形碼(BCA)檢測方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種生物條形碼檢測方法，是在 普通生物條形碼檢測方法的基礎(chǔ)上，將標(biāo)記的條形碼DNA鏈改進(jìn)為單鏈，并將其長度延長 為適于進(jìn)行熒光定量PCR/TaqMan熒光探針檢測的長度，三明治反應(yīng)復(fù)合物中條形碼DNA鏈 不用解離，直接用基于TaqMan熒光探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法或普通PCR方法對三明治 反應(yīng)復(fù)合物中條形碼DNA鏈進(jìn)行定性、定量檢測的生物條形碼檢測方法。具體來講，所述生物條形碼檢測方法可包括以下步驟(I)NP探針的制備設(shè)計(jì)適用熒光定量PCR/TaqMan熒光探針檢測的條形碼DNA單 鏈，然后利用金納米顆粒、抗待測物的多克隆抗體和條形碼DNA單鏈制備NP探針；(2)MMP探針的制備用磁性微球和抗待測物的單克隆抗體制備MMP探針；(3)條形碼DNA檢測利用NP探針、MMP探針和待測物通過抗原、抗體作用制備三 明治復(fù)合物，然后將復(fù)合物上標(biāo)記的條形碼DNA鏈直接進(jìn)行基于TaqMan熒光探針的實(shí)時(shí)熒 光定量PCR檢測或普通PCR檢測，以對待測物進(jìn)行定性、定量檢測。在上述生物條形碼檢測方法中，所述步驟(1)中的金納米顆粒直徑可為10 40nm，優(yōu)選為15nm ；優(yōu)選的用于生物條形碼檢測的單鏈條形碼DNA鏈可具有序列表中SEQ IDNo 1的核苷酸序列。所述步驟(2)中磁性微球的直徑可為0. 5 3 μ m，優(yōu)選為2. 8 μ m。所述步驟(3)中優(yōu)選的用于對條形碼DNA鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的引物對 的上游引物具有序列表中SEQ ID No :2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQID No 3 的核苷酸序列，TaqMan熒光探針具有序列表中SEQ ID No 4的核苷酸序列。為獲得更好的檢測效果，所述步驟(1)和步驟(2)中還包括對NP探針和MMP探針
4進(jìn)行純化的步驟。所述新型生物條形碼檢測方法的檢測范圍較廣闊，對病毒、細(xì)菌、毒素(如蓖麻毒 素)、生物戰(zhàn)劑、類固醇、脂類、維生素、腫瘤特異性標(biāo)志物等均可進(jìn)行檢測。當(dāng)待測物為蓖麻毒素時(shí)，可用蓖麻毒素蛋白作為檢測對象進(jìn)行生物條形碼檢測。 所述檢測方法中使用的MMP探針標(biāo)記有抗蓖麻毒素蛋白的單克隆抗體，NP探針標(biāo)記有抗蓖 麻毒素蛋白的多克隆抗體。當(dāng)待測物為藍(lán)舍病病毒時(shí)，可用VP7蛋白作為檢測對象進(jìn)行生 物條形碼檢測。所述檢測方法中使用的MMP探針標(biāo)記有抗VP7蛋白的單克隆抗體，NP探針標(biāo) 記有抗VP7蛋白的多克隆抗體。依此類推，針對不同的檢測物，只需要改變檢測目標(biāo)蛋白， 在檢測方法中對應(yīng)調(diào)整目標(biāo)蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，這些單克隆抗體和多克隆抗 體均可采用生物技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)方法制備，也可從公司直接購買。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種生物條形碼檢測試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒包括包被有抗待測物單克隆抗體的MMP探針，包被有抗待 測物多克隆抗體和條形碼單鏈DNA鏈的NP探針，以及用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的引物和 TaqMan熒光探針。在上述試劑盒中，優(yōu)選的與NP探針聯(lián)結(jié)的條形碼DNA鏈具有序列表中SEQ ID No: 1的核苷酸序列；優(yōu)選的用于對條形碼DNA鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的引物對的上游 引物具有序列表中SEQ ID No 2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No 3的核 苷酸序列；優(yōu)選的用于對條形碼DNA鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的TaqMan熒光探針具有 序列表中SEQ ID No 4的核苷酸序列。本發(fā)明在傳統(tǒng)生物條形碼檢測方法基礎(chǔ)上，對標(biāo)記的條形碼DNA鏈進(jìn)行了創(chuàng)新， 并引進(jìn)基于TaqMan熒光探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR對標(biāo)記DNA進(jìn)行檢測，不僅簡化了檢測步 驟，還可對標(biāo)記DNA進(jìn)行直接定性、定量檢測。本發(fā)明與常規(guī)的生物條形碼檢測方法相比， 本發(fā)明的BCA檢測方法采用長片段、單鏈條形碼DNA鏈制備NP探針，可直接對反應(yīng)復(fù)合物 上的條形碼DNA鏈進(jìn)行檢測，不用預(yù)先解離，降低了檢測成本，并大大簡化了檢測程序；此 外，利用基于TaqMan熒光探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對條形碼DNA鏈進(jìn)行檢測，可對被 檢物進(jìn)行精確定量，并且消除了常規(guī)生物條形碼檢測方法的陰陽性界限不清等問題，具有 準(zhǔn)確度高、檢測速度快、對儀器設(shè)備要求低和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明對于各種目標(biāo)蛋白的 高靈敏度檢測具有較大的實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為條形碼DNA鏈的熒光定量PCR檢測擴(kuò)增曲線圖(蓖麻毒素)圖2為條形碼DNA鏈的熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(蓖麻毒素)圖3為條形碼DNA鏈的常規(guī)PCR檢測擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(蓖麻毒素)圖4 條形碼DNA鏈的熒光定量PCR檢測擴(kuò)增曲線圖(BTV VP7蛋白)圖5為條形碼DNA鏈的熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(BTV VP7蛋白)圖6為條形碼DNA鏈的常規(guī)PCR檢測擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(BTV VP7蛋白)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的 操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物、條形碼DNA鏈和 TaqMan熒光探針均由TaKaRa公司合成；納米金顆粒購自Ted pella公司；磁性微球顆粒購自 Invitrogen公司；蓖麻毒素蛋白、抗蓖麻毒素蛋白多克隆抗體和抗蓖麻毒素蛋白單克隆抗體 均購自諾維森生物科技有限公司；其他目標(biāo)蛋白及其多克隆抗體和單克隆抗體也均可商購。實(shí)施例1、蓖麻毒素的新型生物條形碼(BCA)檢測本實(shí)施例以對蓖麻毒素蛋白進(jìn)行定性、定量檢測為例，說明本發(fā)明的新型BCA檢 測方法如何實(shí)施，具體包括以下步驟(I)NP探針的制備條形碼DNA鏈合成設(shè)計(jì)并合成用于本發(fā)明中NP探針制備的條形碼DNA鏈，其序 列為5，-GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG TGA AAT AGC CAG TTC TCG TGG CAT TTGCGT MT CCT GAT GTA TCG CTC GGT GGT TGC CAA CTA GAG AAC-3’(序列表中 SEQ IDNo :1)。NP探針制備取10. 5 μ g待檢病原的多抗(購自諾維森生物科技有限公司)加入 到100 μ L納米金(15nm，10 40nm均可)溶液里混合均勻，之后用0. IM NaOH調(diào)節(jié)pH值 至9. 5 ；室溫下振蕩30min ；加入20 μ L 100 μ M的單鏈DNA鏈，10°C下孵育16h，使溶液中的 納米金粒子和抗體、DNA能充分作用；加入585yL 10%的BSA室溫孵育30min ；4°C、13000g 離心20min，去除上清；之后用0. IM NaCl作為穩(wěn)定劑，邊加邊混勻，使穩(wěn)定劑的終濃度為 0. 1M，靜置7 IOh以上，重懸沉淀，定溶至原來的體積。4 8°C保存。(2) MMP探針制備緩沖液(Buffer)A6. 18g H3BO3 (MW 61. 83)添加到 800mL 蒸餾水中，用 5M NaOH調(diào) 節(jié)pH值到9. 5，使用蒸餾水定溶至1L。緩沖液B:2. 62g NaH2PO4 H2O (MW137. 99)、14. 42g Na2HPO4 2H20 (MW 177. 99)用蒸 餾水定溶到lL，pH值為7.4。緩沖液C 在緩沖液A或緩沖液B中溶解39. 64g (NH4) 2S04,用NaOH或者HCl調(diào)節(jié) PH值至9. 5或7. 4，最后用緩沖液A或緩沖液B定溶至100mL。緩沖液D0. 88g NaCl (MW 58. 4)、0· 5% (w/v)BSA to 80mL0. OlM PBS (pH 7. 4)，充 分混勻后定溶至lOOmL，用0. OlM PBS (pH 7. 4)調(diào)節(jié)pH 7. 4。緩沖液E 0. 88g NaCl (MW 58. 4)、0· 1% (w/v) BSA 到 80mL 0. OlM PBS (pH 7. 4)充 分混勻后用0. OlM PBS (pH 7. 4)定溶至IOOmL0把66 μ L 磁珠(直徑為 2·8μπι，0·5 3μπι均可，2X109beads/mL)移入 EP 管后 置入磁場中，使磁珠完全沉淀下來，去除上清和除去磁場；加入ImL Buffer A或BufTerB重 懸磁珠，反復(fù)吹打；重新置入磁場中，使磁珠完全沉淀下來，去除上清；除去磁場；之后加入 40 μ L待檢病原的單抗(購自諾維森生物科技有限公司)和20 μ L的Buffer Α,反復(fù)渦旋； 加入40 μ L Buffer C之后渦旋振蕩，37°C孵育12 18h ；重新置入磁場，使磁珠沉淀，去除 上清；除去磁場；加入ImL Buffer D 37°C孵育Ih ；再次置入磁場，使磁珠再次完全沉淀，去 除上清和磁場；加入ImL Buffer Ej^m 5 IOsec ；置入磁場，使磁珠完全沉淀，去除上清 和除去磁場；之后重復(fù)用ImL Buffer E洗滌；最后用96 μ L的Buffer E重懸磁珠，使磁珠溶液濃度為20mg/mL。4 8°C保存。(3)蓖麻毒素新型BCA檢測中三明治檢測復(fù)合物的形成將15 μ L MMP (20mg/mL)加入30 μ L蓖麻毒素蛋白(100fg/mL)中，37°C劇烈振蕩 Ih ；加入磁場固定MMP探針，用PBS溶液反復(fù)沖洗，除去未連接的蓖麻毒素蛋白和其它雜質(zhì)； 加入45 μ L NP探針，劇烈振蕩30min ；加入磁場，用500 μ LPBS反復(fù)沖洗4次，除去未連接 的NP探針。反復(fù)沖洗后用50 μ L超純水溶解。得到MMP-蓖麻毒素蛋白-NP三明治結(jié)構(gòu)， 復(fù)合物中的條形碼DNA鏈可用于下一步的定性、定量檢測。(4)條形碼DNA鏈的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測對步驟(3)中的條形碼DNA鏈進(jìn)行基于TaqMan熒光探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢 測。25 μ 1反應(yīng)體系為2XPCR緩沖液12. 5μ 1，上游引物1 μ 1 (50mM)，下游引物 1 μ 1 (50mM)，TaqMan 熒光探針 1 μ 1 (25mM)，三明治復(fù)合物樣品 2 μ 1，ddH20 7. 5 μ 1。反應(yīng)條件為95°C 10s,95°C 5s，52°C 20s，共45個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)退火結(jié)束時(shí)收
集FAM熒光信號。上游引物5，-GTTCTC TAG TTG GCA ACC ACC-3，(序列表中 SEQ ID No 2)下游引物5，-GTGACT GCA AGT CCA TTG AGG-3，(序列表中 SEQ ID No 3)TaciMan 熒光探針5，-FAM-AGT TCT CGT GGC ATT TGC GTA ATC C TAMRA-3，(序 列表中 SEQ ID No 4)條形碼DNA鏈的熒光定量PCR檢測擴(kuò)增曲線圖如圖1所示(曲線a、b、c、d、e和 f 分別為 102fg/mL、lO'fg/mL, 10°fg/mL、lO—fg/mL、l(T2fg/mL 和 l(T3fg/mL，曲線 g 為陰性 對照。)，條形碼DNA鏈的熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示(標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 45. 02-3. 35x)，上述檢測結(jié)果表明本檢測的蓖麻毒素蛋白檢測靈敏度可達(dá)10_2fg/mL。(5)條形碼DNA鏈的常規(guī)PCR檢測對步驟(3)中的條形碼DNA鏈進(jìn)行常規(guī)PCR檢測。25 μ 1 PCR反應(yīng)體系為2 XPCR 緩沖液12. 5 μ 1，上游引物1 μ 1 (50mM)，下游引物1 μ 1 (50mM)，三明治結(jié)構(gòu)2 μ 1，ddH20 8. 5μ 1。PCR 反應(yīng)條件為95°C 10s，95°C 5s, 52°C 20s, 72°C 20s，共 35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 7min，4°C終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各10 μ 1進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測 (100V 電泳 40min)。上游引物5，-GTTCTC TAG TTG GCA ACC ACC-3'(序列表中 SEQ ID No 2)下游引物5，-GTGACT GCA AGT CCA TTG AGG-3'(序列表中 SEQ ID No 3)常 規(guī)PCR檢測結(jié)果如圖3所示(泳道M為DL2000 DNA Marker,泳道a g分別為102fg/mL、 lO^g/mL, 10°fg/mL、lO^fg/mL, 10_2fg/mL、10^fg/mL和陰性對照。)，檢測結(jié)果表明本檢測蓖 麻毒素蛋白檢測靈敏度可達(dá)10_2fg/mL。實(shí)施例2、藍(lán)舌病病毒(BTV)的新型生物條形碼(BCA)檢測用本發(fā)明的新型BCA檢測方法對藍(lán)舌病病毒BTV VP7蛋白進(jìn)行定性、定量檢測，具 體方法包括以下步驟(I)NP探針的制備抗BTV VP7蛋白的多克隆抗體的制備利用藍(lán)舌病病毒免疫新西蘭大白兔制備抗 VP7蛋白的多克隆抗體，具體方法包括以下每只雄性新西蘭大白兔免疫前，都由耳緣靜脈取血2mL，靜置分離血清，-20°C保存，以待作為陰性對照用；免疫方案首次免疫，每只家兔 注射2mL的乳化抗原，于足掌及肘窩淋巴結(jié)周圍，背部兩側(cè)、領(lǐng)下、耳后等處皮下多點(diǎn)注射， 對照兔子注射等量生理鹽水，2周后以同樣的劑量(含等體積弗氏不完全佐劑)加強(qiáng)免疫， 背部多點(diǎn)注射，2周后再次加強(qiáng)免疫，10天后進(jìn)行第3次加強(qiáng)免疫，約10天以后進(jìn)行末次免 疫，直接用2mL乳化抗原靜脈注射。每次加強(qiáng)免疫后7-10天從兔耳緣靜脈采血2-3mL，用間 接ELISA法檢測抗體效價(jià)。結(jié)果末次免疫后抗體效價(jià)達(dá)104，符合要求，末次免疫后7天即 用頸動(dòng)脈放血法采血，4°C靜置過夜(10-12小時(shí))，次日4000rpm離心lOmin，收集上清，分 裝后-20°C保存。條形碼DNA鏈合成設(shè)計(jì)并合成用于本發(fā)明中NP探針制備的條形碼DNA鏈，其序 列為5’ -GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG TGA AAT AGC CAG TTC TCG TGG CAT TTG CGT AAT CCT GAT GTA TCG CTC GGT GGT TGC CAA CTA GAG AAC-3’(序列表中 SEQ ID No :1)。NP探針制備取10. 5 μ g BTV VP7的多抗加入到100 μ L納米金(15nm, 10 40nm 均可)溶液里混合均勻，之后用0. IM NaOH調(diào)節(jié)pH值至9. 5 ；室溫下振蕩30min ；加入20 μ L 100 μ M的單鏈DNA鏈，10°C下孵育16h，使溶液中的納米金粒子和抗體、DNA能充分作用； 加入585 μ L 10%的BSA室溫孵育30min ；4°C、13000g離心20min，去除上清；之后用0. IM NaCl作為穩(wěn)定劑，邊加邊混勻，使穩(wěn)定劑的終濃度為0. 1M，靜置7 IOh以上，重懸沉淀，定 溶至原來的體積。4 8°C保存。(2) MMP探針制備緩沖液(Buffer)A6. 18g H3BO3 (MW 61. 83)添加到 800mL 蒸餾水中，用 5M NaOH調(diào) 節(jié)pH值到9. 5，使用蒸餾水定溶至1L。緩沖液B:2.62g NaH2PO4 H2O (MW137. 99)、14. 42g Na2HPO4 2H20 (MW 177. 99)用蒸 餾水定溶到lL，pH值為7.4。緩沖液C 在緩沖液A或緩沖液B中溶解39. 64g (NH4) 2S04,用NaOH或者HCl調(diào)節(jié) PH值至9. 5或7. 4，最后用緩沖液A或緩沖液B定溶至100mL。緩沖液D 0. 88g NaCl (MW 58. 4)、0· 5% (w/v)BSA to 80mL 0. OlM PBS (pH 7. 4)， 充分混勻后定溶至lOOmL，用0. OlM PBS (pH 7. 4)調(diào)節(jié)pH 7. 4。緩沖液E 0. 88g NaCl (MW58. 4)、0· 1% (w/v) BSA 到 80mL 0. OlM PBS (pH 7. 4)充 分混勻后用0. OlM PBS (pH 7. 4)定溶至IOOmL0抗BTV VP7蛋白的單克隆抗體的制備用雜交瘤細(xì)胞免疫BALB/c小鼠制備抗VP7 蛋白的單克隆抗體，方法為采用6-8周雌性BALB/c小鼠，在注射雜交瘤細(xì)胞前7天，預(yù)先 腹腔注射0. 5mL滅菌液體石蠟；然后，每只鼠腹腔注射含1-5X IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞的0. 5mL 的培養(yǎng)液；當(dāng)小鼠產(chǎn)生腹水時(shí)(1-3周)，腹部穿刺放出腹水(l_5mL)，隔天穿刺直至小鼠死 亡；隨后，3000rpm離心15min，除去腹水中的細(xì)胞；將上清無菌儲(chǔ)存或加0.01%疊氮鈉置 于-70°C冰箱保存?zhèn)溆?。?6 μ L 磁珠(直徑為 2·8μπι，0·5 3μπι均可，2X109beads/mL)移入 EP 管后 置入磁場中，使磁珠完全沉淀下來，去除上清和除去磁場；加入ImL Buffer A或BufTerB重 懸磁珠，反復(fù)吹打；重新置入磁場中，使磁珠完全沉淀下來，去除上清；除去磁場；之后加入 40 μ L BTV VP7的單抗和20 μ L的Buffer A，反復(fù)渦旋；加入40yL BufferC之后渦旋振蕩， 37°C孵育12 18h ；重新置入磁場，使磁珠沉淀，去除上清；除去磁場；加入ImL Buffer D
837°C孵育Ih ；再次置入磁場，使磁珠再次完全沉淀，去除上清和磁場；加入ImL Buffer Ε, 渦旋5 IOsec ；置入磁場，使磁珠完全沉淀，去除上清和除去磁場；之后重復(fù)用ImL Buffer E洗滌；最后用96 μ L的Buffer E重懸磁珠，使磁珠溶液濃度為20mg/mL。4 8°C保存。(3) BTV VP7新型BCA檢測中三明治檢測復(fù)合物的形成將15yL MMP (20mg/mL)加入 30 μ L BTV VP7 蛋白(100fg/mL)中，37°C 劇烈振蕩 Ih ；加入磁場固定MMP探針，用PBS溶液反復(fù)沖洗，除去未連接的VP7蛋白和其它雜質(zhì)；加入 45 μ L NP探針，劇烈振蕩30min ；加入磁場，用500 μ L PBS反復(fù)沖洗4次，除去未連接的NP 探針。反復(fù)沖洗后用50 μ L超純水溶解。得到MMP-BTV VP7-NP三明治結(jié)構(gòu)，復(fù)合物中的條 形碼DNA鏈可用于下一步的定性、定量檢測。(4)條形碼DNA鏈的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測對步驟(3)中的條形碼DNA鏈進(jìn)行基于TaqMan熒光探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢 測。25 μ 1反應(yīng)體系為2XPCR緩沖液12. 5 μ 1，上游引物1 μ 1 (50mM)，下游引物 1 μ 1 (50mM)，TaqMan 熒光探針 1 μ 1 (25mM)，三明治復(fù)合物樣品 2 μ 1，ddH20 7. 5 μ 1。反應(yīng)條件為95°C 10s,95°C 5s，52°C 20s，共45個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)退火結(jié)束時(shí)收
集FAM熒光信號。上游引物5，-GTTCTC TAG TTG GCA ACC ACC-3，(序列表中 SEQ ID No 2)下游引物5，-GTGACT GCA AGT CCA TTG AGG-3，(序列表中 SEQ ID No 3)TaciMan 熒光探針5，-FAM-AGT TCT CGT GGC ATT TGC GTA ATC C-TAMRA-3，(序 列表中 SEQ ID No 4)條形碼DNA鏈的熒光定量PCR檢測擴(kuò)增曲線圖如圖4所示(曲線a、b、c、d、e和 f 分別為 102fg/mL、lO'fg/mL, 10°fg/mL、lO—fg/mL、l(T2fg/mL 和 l(T3fg/mLBTV VP7)，條形碼 DNA鏈的熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示(標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 33. 46-3. 32x)，上 述檢測結(jié)果表明本檢測的BTV VP7檢測靈敏度可達(dá)10_2fg/mL。(5)條形碼DNA鏈的常規(guī)PCR檢測對步驟(3)中的條形碼DNA鏈進(jìn)行常規(guī)PCR檢測。25 μ 1 PCR反應(yīng)體系為2 XPCR 緩沖液12. 5 μ 1，上游引物1 μ 1 (50mM)，下游引物1 μ 1 (50mM)，三明治結(jié)構(gòu)2 μ 1，ddH20 8. 5μ 1。PCR 反應(yīng)條件為95°C 10s，95°C 5s, 52°C 20s, 72°C 20s，共 35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 7min，4°C終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各10 μ 1進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測 (100V 電泳 40min)。上游引物5，-GTTCTC TAG TTG GCA ACC ACC-3'(序列表中 SEQ ID No 2)下游引物5，-GTGACT GCA AGT CCA TTG AGG-3'(序列表中 SEQ ID No 3)常規(guī)PCR檢測結(jié)果如圖6所示(泳道M為DL2000 DNA Marker,泳道a g分別 為 103fg/mL、102fg/mL、lO'fg/mL, 10°fg/mL、lO—fg/mL、l(T2fg/mL 和 l(T3fg/mL)，檢測結(jié)果表 明本檢測BTV VP7蛋白檢測靈敏度可達(dá)10_2fg/mL。利用本發(fā)明方法針對多種來源(如病毒、細(xì)菌、毒素、生物戰(zhàn)劑、類固醇、脂類、維 生素、腫瘤特異性標(biāo)志物)的檢測物，僅需確定檢測的目標(biāo)蛋白，檢測過程與實(shí)施例1和實(shí) 施例2所列步驟完全相同，所不同的是需使用目標(biāo)蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體(這些 單克隆抗體和多克隆抗體均可采用生物技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)方法制備，也可直接購買)，在此不一一贅述；針對不同目標(biāo)蛋白用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測，也能達(dá)到與實(shí)施例1和實(shí)施例2類 似的檢測效果。實(shí)施例3、新型BCA檢測試劑盒的制備將實(shí)施例中的條形碼DNA鏈、上游引物、下游引物、TaqMan熒光探針、金鈉米顆粒 和磁性微球共同包裝，得到新型BCA檢測試劑盒。
權(quán)利要求
一種生物條形碼檢測方法，是在普通生物條形碼檢測方法的基礎(chǔ)上，將標(biāo)記的條形碼DNA鏈改進(jìn)為單鏈，并將其長度延長為適于進(jìn)行熒光定量PCR/TaqMan熒光探針檢測的長度，三明治反應(yīng)復(fù)合物中條形碼DNA鏈不用解離，直接用基于TaqMan熒光探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法或普通PCR方法對三明治反應(yīng)復(fù)合物中條形碼DNA鏈進(jìn)行定性、定量檢測的生物條形碼檢測方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物條形碼檢測方法，其特征在于所述生物條形碼檢測方 法包括以下步驟(1)NP探針的制備設(shè)計(jì)適用熒光定量PCR/TaqMan熒光探針檢測的條形碼DNA單鏈， 然后利用金納米顆粒、抗待測物的多克隆抗體和條形碼DNA單鏈制備NP探針；(2)MMP探針的制備用磁性微球和抗待測物的單克隆抗體制備MMP探針；(3)條形碼DNA檢測利用NP探針、MMP探針和待測物通過抗原、抗體作用制備三明治 復(fù)合物，然后將復(fù)合物上標(biāo)記的條形碼DNA鏈直接進(jìn)行基于TaqMan熒光探針的實(shí)時(shí)熒光定 量PCR檢測或普通PCR檢測，以對待測物進(jìn)行定性、定量檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物條形碼檢測方法，其特征在于所述步驟(1)中的金納 米顆粒直徑為10 40nm，優(yōu)選為15nm ；用于生物條形碼檢測的單鏈條形碼DNA鏈具有序列 表中SEQ ID No 1的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物條形碼檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中磁性微 球的直徑為0. 5 3 μ m，優(yōu)選為2. 8 μ m。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物條形碼檢測方法，其特征在于所述步驟(3)中用于對 條形碼DNA鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的引物對的上游引物具有序列表中SEQ ID No 2 的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No 3的核苷酸序列，TaqMan熒光探針具有 序列表中SEQ ID No 4的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物條形碼檢測方法，其特征在于所述步驟(1)和步驟(2) 中還包括對NP探針和MMP探針進(jìn)行純化的步驟。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的生物條形碼檢測方法在檢測病毒、細(xì)菌、毒素、生物戰(zhàn) 劑、類固醇、脂類、維生素和腫瘤特異性標(biāo)志物中目標(biāo)蛋白的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于所述毒素為蓖麻毒素，目標(biāo)蛋白為蓖麻毒素 蛋白，檢測中使用的MMP探針標(biāo)記有抗蓖麻毒素蛋白的單克隆抗體，NP探針標(biāo)記有抗蓖麻 毒素蛋白的多克隆抗體；所述病毒為藍(lán)舍病病毒，目標(biāo)蛋白為VP7蛋白，檢測中使用的MMP 探針標(biāo)記有抗VP7蛋白的單克隆抗體，NP探針標(biāo)記有抗VP7蛋白的多克隆抗體。
9.一種生物條形碼檢測試劑盒，包括包被有抗待測物單克隆抗體的MMP探針，包被有 抗待測物多克隆抗體和條形碼單鏈DNA鏈的NP探針，以及用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的引 物和TaqMan熒光探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述與NP探針聯(lián)結(jié)的條形碼DNA鏈 具有序列表中SEQ ID No 1的核苷酸序列；用于對條形碼DNA鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢 測的引物對的上游引物具有序列表中SEQ ID No :2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中 SEQ ID No 3的核苷酸序列；用于對條形碼DNA鏈進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的TaqMan熒 光探針具有序列表中SEQ ID No 4的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物條形碼檢測方法及其應(yīng)用。該方法是在普通生物條形碼檢測方法的基礎(chǔ)上，將標(biāo)記的條形碼DNA鏈改進(jìn)為單鏈，并將其長度延長為適于進(jìn)行熒光定量PCR/TaqMan熒光探針檢測的長度，三明治反應(yīng)復(fù)合物中條形碼DNA鏈不用解離，直接用基于TaqMan熒光探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法或普通PCR方法對三明治反應(yīng)復(fù)合物中條形碼DNA鏈進(jìn)行定性、定量檢測的生物條形碼檢測方法。本發(fā)明降低了檢測成本，簡化了檢測程序，可對被檢物進(jìn)行精確定量，具有準(zhǔn)確度高、檢測速度快、對儀器設(shè)備要求低和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明對于各種目標(biāo)蛋白的高靈敏度檢測具有較大的實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號G01N33/577GK101986157SQ201010530060
公開日2011年3月16日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者尹惠瓊, 楊姝, 章金剛, 賈茗嫻 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所