一種地龍的dna條形碼分子鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種地龍的DNA條形碼分子鑒定方法和其COI序列，使用該方法進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出樣品COI基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖膠進(jìn)行驗(yàn)證后送至生物測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果通過手工校對(duì)、序列拼接，并與公開序列進(jìn)行比對(duì)，如果與所述基因序列SEQ?ID?NO.1-NO.4的同源性在99％以上，即可判斷所述的待測(cè)組織即為廣地龍或者滬地龍來源。本發(fā)明采用可靠的DNA分子鑒定技術(shù)，無需對(duì)地龍品種進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，可以快速、準(zhǔn)確的鑒定《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的地龍品種和非藥材地龍品種，此外可以進(jìn)一步區(qū)分廣地龍和滬地龍品種，增強(qiáng)了準(zhǔn)確性和可靠性，確保地龍作為藥材了入藥的安全性。
【專利說明】—種地龍的DNA條形碼分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及物種鑒定領(lǐng)域，具體涉及地龍的DNA條形碼分子鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]地龍，即蚯蚓，性寒，味微咸，是傳統(tǒng)的中藥材，而《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版(一部)“地龍”項(xiàng)下收載的僅有環(huán)節(jié)動(dòng)物門鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓(Pheretimaaspergillum(E.Perrier))、通俗環(huán)毛蝴(Pheretima vulgaris Chen)、威廉環(huán)毛蟲引(Pheretima.guillelmi (Michaelsen))或木節(jié)肓毛蟲引(Pheretima pectinifera Michaelsen)的干燥體。前一種習(xí)稱“廣地龍”，后三種習(xí)稱“滬地龍”。地龍?jiān)凇渡褶r(nóng)本草經(jīng)》被列為下品，具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿的功效。常炒制后用于高熱、神昏、驚癇抽搐、關(guān)節(jié)痹痛、肺熱喘咳、尿少水腫、高血壓等癥。李時(shí)珍在《本草綱目》稱之為具有通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀、預(yù)防治療心腦血管疾病作用?，F(xiàn)代研究表明，地龍含有多種藥理活性成分，藥理作用幾乎涉及人體各個(gè)系統(tǒng)，主要有抗血栓、溶栓和平喘、抗心律失常、降壓、增強(qiáng)免疫、抗?jié)?、解熱、消炎、?zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤等多方面的藥理作用，臨床應(yīng)用非常廣泛。
[0003]對(duì)地龍品種的鑒定是入藥的基礎(chǔ)，目前中藥材地龍的鑒定大多采用的是活體鑒別的方法，主要依據(jù)其外部形態(tài)和內(nèi)部構(gòu)造。但是由于動(dòng)物類藥材大多外部形態(tài)相似，組織特征無特異性，而且經(jīng)過產(chǎn)地粗加工和飲片炮制后，難以看出物種本身的形狀和顏色，顯微特征也有不同程度的破壞，造成地龍干品鑒別比較困難。因此，亟需尋求一種新的方法，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類方法的缺陷。
[0004]DNA條形碼技術(shù)(DNA Barcoding)是通過對(duì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析，從而快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)。目前在動(dòng)物中最常用的DNA barcode是細(xì)胞色素C氧化酶I號(hào)基因(COI)的部分序列。近幾年來，DNA條形碼技術(shù)已被證明是一個(gè)行之有效的生物鑒定手段，不僅可對(duì)傳統(tǒng)鑒定方法作強(qiáng)有力的補(bǔ)充，而且因?yàn)槠涓陀^、準(zhǔn)確，突破以往對(duì)經(jīng)驗(yàn)的過度依賴，能幫助鑒定物種、發(fā)現(xiàn)新種和隱種、重建物種和高級(jí)階元的演化關(guān)系等。運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)，可以很好的對(duì)廣地龍和滬地龍的品種進(jìn)行快速、有效的鑒定。
[0005]本發(fā)明提供一種地龍的DNA條形碼分子鑒定方法，無形態(tài)學(xué)觀察，可以快速準(zhǔn)確鑒定《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的地龍品種和非藥材地龍品種，保證中藥原材料的安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明克服目前以形態(tài)學(xué)鑒定地龍方法存在的缺陷，提高地龍鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度，是一種易于操作、靈敏度高的鑒定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]首先從采集的地龍樣品提取基因組DNA，利用一對(duì)引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出樣品一段COI基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，然后進(jìn)行序列分析比對(duì)，建立廣地龍和滬地龍的序列標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，在比較數(shù)據(jù)庫(kù)DNA的基礎(chǔ)上，通過分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物結(jié)果，根據(jù)COI基因序列的差異，從而達(dá)到快速、準(zhǔn)確鑒定地龍物種的目的。本發(fā)明設(shè)計(jì)的用于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的地龍品種和非藥材地龍品種鑒定方法，采用如下步驟:
[0008]1、提取地龍基因組DNA:按常規(guī)動(dòng)物DNA提取方法或者血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到0.1 μ g/μ 1-2 μ g/ μ 10
[0009]2、擴(kuò)增DNA片段，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即用特異的引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物對(duì)序列為
[0010]1X01490:5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
[0011 ] HC02198: 5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3':
[0012]擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性I分鐘，45°C退火1.5分鐘，72°C延伸1.5分鐘，5個(gè)循環(huán)94°C變性I分鐘，50°C退火1.5分鐘，72°C延伸I分鐘，35個(gè)循環(huán)72°C延伸5分鐘。
[0013]3、將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用DNAmarker檢測(cè)PCR片段大小。[0014]4、鑒定結(jié)果的判斷:若出現(xiàn)明顯清晰的709bp大小的條帶，且無雜帶，則可送生物測(cè)序公司測(cè)序。
[0015]5、將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行手工校對(duì)、序列拼接，如果與所述基因序列SEQ ID N0.1-SEQ IDN0.4，如果與任一序列同源性在99%以上，即可判斷所述的待測(cè)組織即為上述種屬。
[0016]其中，所述的地龍DNA條形碼分子鑒定方法采用的是血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒。
[0017]所述引物:
[0018]正向引物為5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，
[0019]反向引物為5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
[0020]所使用的DNA聚合酶為pfu高保真酶。
[0021 ] 所述的電泳為I % -2 %的瓊脂糖凝膠電泳。
[0022]所述的條帶大小需要用DNA maker檢測(cè)。
[0023]所述的DNA 序列拼接軟件包括 CodonCode Aligner、Sequencher> Genious、DNAstar等軟件。
[0024]與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，本發(fā)明獲得的基因序列有利于實(shí)現(xiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的地龍品種和非藥材地龍品種的鑒定。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明:
[0026]1、地龍標(biāo)本的采集與保存:采集的樣品來自廣西、上海等地。采獲的標(biāo)本經(jīng)10%酒精麻醉處理約20分鐘，再經(jīng)75%酒精浸泡15分鐘處死并保存。
[0027]2、試驗(yàn)樣品的前處理:取出保存于75 %酒精中的地龍標(biāo)本，去內(nèi)臟，避免內(nèi)臟內(nèi)容物的污染，剩余部分用蒸餾水浸泡清洗3次，洗去酒精，取尾部大約20mg解剖剪置入2mlEP管，加入磁珠，震蕩粉碎。蛋白酶K56°C溫浴I小時(shí)，至組織完全溶解。加入350 μ I氯仿:異戊醇(24: I)混勻，10，000Xg室溫離心5分鐘，小心吸取上清至新的1.5mL EP管中。
[0028]3、DNA模板制備:采用天根生物公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒DNA進(jìn)行提取，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到0.5 μ g/ μ I。
[0029]4、引物合成:本實(shí)施例所用引物如下:[0030]正向引物5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
[0031]反向引物5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
[0032]5、PCR擴(kuò)增本實(shí)施例的PCR反應(yīng)體系如下
[0033]PCR 反應(yīng)體系為 25μ 1:ddH208.5uL，2XTaq PCR Master Mixl2.5uL，正向引物 /反向引物(2.5umol)各 luL，DNA 模板 2uL2XTaq PCR Master Mix 包含了 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑和優(yōu)化劑及穩(wěn)定劑，濃度為2X，且不含染料；擴(kuò)增程序:反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性I分鐘，45°C退火1.5分鐘，72°C延伸1.5分鐘，5個(gè)循環(huán)94°C變性I分鐘，50°C退火1.5分鐘，72°C延伸I分鐘，35個(gè)循環(huán)72°C延伸5分鐘6、瓊脂糖電泳驗(yàn)證PCR結(jié)果瓊脂糖電泳顯示樣品擴(kuò)增良好，條帶清晰無雜質(zhì)，可直接送生物測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。
[0034]6、測(cè)序結(jié)果序列拼接:將測(cè)序結(jié)果用CodonCode Aligner生物軟件，將序列導(dǎo)入，將引物剪切后將序列組裝，然后分別跟SEQ ID N0.1-4進(jìn)行比對(duì)，Hl樣品與跟SEQ ID N0.1同源率100%，為廣地龍，參環(huán)毛蚓，屬于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的地龍品種；H2、H3序列與SEQ ID N0.2同源率100%，為滬地龍通俗環(huán)毛蚓，屬于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的地龍品種；H5、H6、H7樣品與SEQ ID N0.3同源率100%，為滬地龍威廉環(huán)毛蚓，屬于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的地龍品種；H8、H9與與SEQ ID N0.4同源率100%，為滬地龍櫛肓毛蚓，屬于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的地龍品種。
[0035]本發(fā)明所闡述的實(shí)施例并不是對(duì)本發(fā)明的限定，上述實(shí)施例和說明書中描述的僅為本發(fā)明的優(yōu)選例，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)手段可以預(yù)見或者微調(diào)的變化和改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種地龍的DNA條形碼分子鑒定方法，其特征在于無需對(duì)地龍品種進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，可以快速、準(zhǔn)確的鑒定藥用地龍品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于可以區(qū)分鑒定廣地龍和滬地龍品種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于可以區(qū)分鑒定滬地龍，包括通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓和櫛肓毛蚓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法為DNA條形碼分子鑒定方法，其步驟主要包括: (1)從待測(cè)的地龍樣品組織中分離提取基因組DNA； (2)以步驟(1)所提取的基因組DNA為模板用一對(duì)引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增； (3)然后取適量步驟(2)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出DNA產(chǎn)物用瓊脂糖電泳分離鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物大小，送生物測(cè)序公司測(cè)序； (4)將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，與所述基因序列SEQID N0.1-SEQ ID N0.4的同源性進(jìn)行比對(duì)，同源性在99%以上，即可判斷鑒定地龍品種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物，其特征在于引物DNA的序列為:
LC01490:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ ；
HC02198:5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其特征在于擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性I分鐘，45°C退火1.5分鐘，72°C延伸1.5分鐘，5個(gè)循環(huán)；94°C變性I分鐘，50。。退火1.5分鐘，72°C延伸I分鐘，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述擴(kuò)增產(chǎn)物，其特征在于擴(kuò)增片段為709bp，用1%-2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的地龍DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因序列，其特征在于所述條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因?yàn)镃OI基因，具有如下所述的廣地龍參環(huán)毛蚓基因序列SEQ ID N0.1 =AACACT
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的地龍DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因序列，其特征在于所述條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因?yàn)镃OI基因，具有如下所述的滬地龍通俗環(huán)毛蚓基因序列SEQ ID N0.2 =GAAT
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的地龍DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因序列，其特征在于所述條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因?yàn)镃OI基因，具有如下所述的滬地龍威廉環(huán)毛蚓基因序列SEQ ID N0.3 =GAAT
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的地龍DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因序列，其特征在于所述條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因?yàn)镃OI基因，具有如下所述的滬地龍櫛肓毛蚓基因序列SEQ ID N0.4 =GAATAG
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103898234SQ201410162028
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】李振國(guó), 陳艷明, 務(wù)勇圣 申請(qǐng)人:牡丹江友搏藥業(yè)股份有限公司