專利名稱：一種陸川豬及其肉制品的dna分子鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用DNA分子標記技術鑒定豬品種的方法，具體是一種陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定方法。
背景技術：
陸川豬是我國華南地區(qū)的優(yōu)良豬種，因其原產(chǎn)于廣西省東南部的陸川縣而得名，現(xiàn)主要分布于廣西玉林、梧州、欽州等地區(qū)。陸川豬與榮昌豬、太湖豬、東北民豬、金華豬、寧鄉(xiāng)豬、淮豬以及八眉豬一起并稱“中國八大地方優(yōu)良豬種”。陸川豬屬于小型脂肪型豬種，因其皮薄肉嫩、脆而不膩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富而久負盛名。其畜產(chǎn)品可加工成香腸、無皮五花臘肉、白切豬腳、脆皮乳豬、扣肉等制品，深受當?shù)叵M者的青睞。但因其飼料率低、飼養(yǎng)周期長，養(yǎng)殖行業(yè)出現(xiàn)許多雜交品種，如以陸川豬為母本的二元雜豬和三元雜豬。同時，由于市場上的陸川豬肉價格是普通豬肉價格的好幾倍，出現(xiàn)了以假亂真的不良現(xiàn)象。另一方面，巴馬香豬和環(huán)江香豬也是廣西名優(yōu)豬種，以其乳豬制成的烤香豬和臘香豬肉質細嫩、香甜可口、清甜濃香，深受當?shù)厝藗兿矏?，并且遠銷國內外市場，出現(xiàn)供不應求的情形。有些不法商販將陸川乳豬假冒巴馬香乳豬和環(huán)江香乳豬用于生產(chǎn)烤香豬和臘香豬，產(chǎn)品失去了正宗香豬的原汁原味，出現(xiàn)以次充好的情形。目前尚無行之有效的方法對真品陸川豬肉進行鑒偽。傳統(tǒng)上是通過測定豬胴體和肉質特征來評價生鮮肉及其肉制品品質，包括瘦肉率、嫩度、PH值、肉色等。但由于飼養(yǎng)條件和豬個體存在差異，測定過程中對供試樣品的采集時間和取樣部位有要求，給檢測人員工作帶來干擾和不便，導致獲得的指標數(shù)據(jù)不穩(wěn)定不可靠。通過對肉質的研究發(fā)現(xiàn)，肉質指標大多沒有統(tǒng)一的數(shù)值范圍，個體差異也比較明顯，不能作為鑒定豬品種的依據(jù)。DNA分子標記(DNA molecular marker)是以生物大分子的多態(tài)性為基礎的一種遺傳標記，直接反映了 DNA水平遺傳多樣性。該技術直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織及各個發(fā)育階段均可檢測，不受取樣部位、年齡、生長條件等的限制。DNA分子標記能夠檢測到無限的基因座位，數(shù)量遍及整個基因組且多態(tài)性高。這些優(yōu)勢為DNA分子標記技術擁有廣泛的應用性奠定了基礎，目前已發(fā)展多種分子鑒別技術，包括RFLP技術、RAPD技術、AFLP技術、SSR技術和ISSR技術等。其中ISSR技術和PCR技術聯(lián)合使用具有很高的特異性和靈敏度且準確快速，廣泛應用在食品快速檢驗領域，如檢測轉基因成分、動植物種類成分、病原微生物等，在食品溯源如鑒別糧食作物、水果品種、蔬菜品種等領域也有涉及。Heaton通過32個SNP標記對美國牛肉進行了品種的鑒定和親本分析(HEATON M P, HARHAY G P, BENNETT G L, et al.Selection and use of SNP markers foranimal identification and paternity analysis in U.S.beef cattle[J].MammalianGenome, 2002, 13(5):272-281)。陳冬曾在擴增線粒體12S rDNA基因的基礎上，成功的鑒別出了市場上的混合牛肉及其制品，并用該方法鑒定了 24個品牌的牦牛肉干制品(陳冬.基于線粒體12S rRNA基因的PCR-RFLP鑒別混合牛肉及制品的牛種來源研究[D].雅安:四川農業(yè)大學，2008)。申請?zhí)枮?01210057485.9發(fā)明專利公開了利用ISSR分子標記技術鑒定狼尾草屬牧草的方法，公開了引物UBC815和UBC835，快速、準確地區(qū)分了 7份狼尾草屬牧草材料。但未見國內外應用DNA分子技術區(qū)分鑒定陸川豬品種的報道。利用DNA分子標記技術具有多位點性、高變異性、簡單而穩(wěn)定的遺傳性和體細胞穩(wěn)定性等優(yōu)勢，建立可用于鑒偽的陸川豬的特異DNA指紋圖譜，開發(fā)陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定技術，對規(guī)范陸川豬市場，引導深加工企業(yè)的健康發(fā)展以及維護“陸川豬”品牌形象具有重要的意義。

發(fā)明內容
為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定方法，能夠快速、準確的鑒定陸川豬、陸川豬雜交品種、巴馬香豬、環(huán)江香豬及其肉制品之間的區(qū)別。本發(fā)明采用以下技術方案解決上述技術問題:一種陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定方法，包括以下步驟:a、提取生鮮肉 及其肉制品的總DNA ；b、利用ISSR-PCR反應擴增生鮮肉及其肉制品的DNA ；C、構建生鮮肉及其肉制品的DNA電泳圖譜；d、鑒定陸川豬及其肉制品。所述ISSR-PCR所用的引物為麗14、麗12和麗29，其中核苷酸序列分別為:5，-CTCCTCCTCGC-3， ；5，-CACCACCACGC-3， ；5，-CTCCTCCTCAT-3，。所述步驟b中的ISSR-PCR反應體系及程序為:25yL體系:模版DNAl μ L、引物2μ L,2XTaq PCR Master Mixl2.5 μ UddH2O 補足 25 μ L，其中 2 X Taq PCR Master Mix 包含了 Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR反應的增強劑和優(yōu)化劑及穩(wěn)定劑，濃度為2X，且不含染料；擴增程序:95°C預變性5min，95°C變性30s，36°C退火30s，72°C延伸2min，循環(huán)30次，72°C再延伸5min。所述步驟c中用1.5%的瓊脂糖凝膠，IXTAE緩沖液為介質電泳檢測擴增結果，根據(jù)電泳圖繪制電泳圖譜。所述陸川豬是指原產(chǎn)于廣西壯族自治區(qū)東南部的陸川縣，現(xiàn)主要分布于廣西玉林、梧州、欽州地區(qū)，屬于小型脂肪型豬種。所述肉制品是指以陸)I丨豬為原料加工制備的扣肉和臘肉制品。所述的陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定方法在鑒定陸川豬生鮮肉及其肉制品與其它豬品種生鮮肉及其肉制品中的應用。所述其它豬品種為長陸二元雜、大陸二元雜、杜長大三元雜、大陸長白三元雜、龍寶豬、三元雜豬、巴馬香豬和環(huán)江香豬。步驟a所述的提取生鮮肉及其肉制品的總DNA的方法為改良后的SDS法。原方法中冷時使用了液氮、蛋白酶K、25:24:l的酚:氯仿:異戊醇、KAC等試劑，且需在50°C 55°C下溫育數(shù)小時，操作繁瑣，用時長；改進后冷卻時直接在冰上研磨樣品，代替了加入液氮及溫育等步驟，并分別使用飽和酚和24:1的氯仿:異戊醇進行兩次抽提，節(jié)約了時間，簡化了步驟，提高了效率，降低了提取成本。所述構建的電泳圖譜，選取ISSR-PCR擴增產(chǎn)物多態(tài)性好、條帶清晰的電泳圖譜作為直觀鑒定陸川豬及其肉制品的指紋圖譜。本發(fā)明突出的實質性特點和顯著進步在于:利用DNA分子技術對陸川豬和廣西其他豬品種進行分子鑒定，有效解決了陸川豬品源的鑒偽難題。DNA分子技術操作簡單、快速準確、多態(tài)性豐富、模板需要量少，提高了質檢人員的檢測工作效率和準確度。所構建的陸川豬特異DNA指紋圖譜，非常直觀顯示陸川豬和廣西一些豬品種的基因差異，規(guī)范了陸川豬發(fā)展市場和深加工企業(yè)的經(jīng)營行為，也對維護“陸川豬”品牌形象具
有重要意義。


圖1引物麗14擴增出的陸川豬及其雜交品種生鮮肉的電泳圖譜；圖2引物麗14擴增出的陸川豬及其雜交品種臘肉的電泳圖譜；圖3引物麗14擴增出的陸川豬及其雜交品種扣肉的電泳圖譜；圖4引物麗12擴增出的陸川豬與環(huán)江香豬生鮮肉的電泳圖譜；圖5引物麗12擴增出的陸川豬與環(huán)江香豬臘肉的電泳圖譜；圖6引物麗29擴增出的陸川豬與巴馬香豬生鮮肉的電泳圖譜；圖7引物麗29擴增出的陸川豬與巴馬香豬扣肉的電泳圖譜；圖8以 圖1為基礎繪制的電泳模式圖；圖9以圖4為基礎繪制的電泳模式圖；圖10以圖7為基礎繪制的電泳模式圖。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步說明。本試驗ISSR-PCR反應引物均為自行設計的序列，并由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。實施例1鑒定區(qū)分陸川豬及其肉制品與二元雜豬、三元雜豬及其肉制品選取需鑒定陸川豬、二元雜豬、三元雜豬生鮮肉、臘肉和扣肉樣品數(shù)份，采用改良的SDS法分別提取各樣品的DNA。以麗14為引物，經(jīng)過ISSR-PCR反應，對各組樣品的總DNA進行擴增。ISSR-PCR反應體系為254 1^體系:模版0嫩14 1^、引物24 1^、2父139 PCR Master Mixl2.5μ L,ddH209.5 μ L，其中 2XTaq PCR Master Mix 包含了 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR反應的增強劑和優(yōu)化劑及穩(wěn)定劑，濃度為2X，且不含染料；擴增程序:95°C預變性5min，95°C變性30s，36°C退火30s，72°C延伸2min，循環(huán)30次，72°C總延伸5min。其中Marker為IOObp Plus DNA ladder，加入量為5 μ L，樣品加入量均為8μ L。用1.5%的瓊脂糖凝膠，I XTAE緩沖液為介質電泳檢測擴增結果，電泳圖譜如圖1、
2、3，以圖1為基礎繪制的電泳模式圖如圖8，如各圖中箭頭所示，雜交豬品種均產(chǎn)生一條較清晰的條帶，而陸川豬中無此條帶，多次重復驗證實驗均能證明，證明引物麗14可以作為區(qū)分陸川豬和其它雜交品種的有力證據(jù)。其中圖1中1-6代表六份不同陸川豬生鮮肉樣品，9-10代表四份不同長陸二元雜豬生鮮肉樣品，11-14代表四份不同大陸二元雜豬生鮮肉樣品，15-18代表一份龍寶豬、兩份不同杜長大外三元雜豬和一份大陸長白內三元雜豬生鮮肉樣品。圖2中1-5代表五份不同陸川豬臘肉樣品，6-9代表四份不同長陸二元雜豬臘肉樣品，10-12代表三份不同大陸二元雜豬臘肉樣品，13-15代表一份外三元雜豬，I份龍寶豬和一份大陸長白內三元雜豬的臘肉樣品。圖3中1-5代表五份不同陸川豬扣肉樣品，6-9代表四份不同長陸二兀雜豬扣肉樣品，10-12代表三份不同大陸二元雜豬扣肉樣品，13-14代表一份外三元雜豬，I份龍寶豬的臘肉樣品。釆用NTSYS-pc2.1Oe軟件對可辨別擴增條帶進行聚類分析，用SimQual程序對原始矩陣求遺傳相似系數(shù)(Jaccaixl系數(shù))，參見表1，其中LI L6代表陸川豬；C1 C4代表長陸二元雜豬；D1 D4代表大陸二元雜豬；L代表龍寶豬；W1-W2代表外三元雜豬；N代表內三元雜。結果表明陸川豬間Jaccard系數(shù)為0.88 1.00，說明陸川豬樣品間親緣關系較近。陸川豬與長陸二元雜豬之間的Jaccard系數(shù)為0.63 0.75 ;陸川豬與大陸二元雜豬之間的Jaccaixl系數(shù)為0.63 0.75 ;陸川豬與龍寶豬之間的Jaccaixl系數(shù)為0.63 0.75 ;陸川豬與外三元雜豬之間的Jaccard系數(shù)為0.50 0.63 ;陸川豬與內三元雜豬之間的的Jaccard系數(shù)為0.50 0.63，均表明陸川豬與其他雜豬之間差異性較大，親緣關系相差較遠。本發(fā)明可準確區(qū)分鑒別陸川豬與其他雜豬品種。表I陸川豬與其雜交豬間Jaccard系數(shù)矩陣
權利要求
1.一種陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟: a、提取生鮮肉及其肉制品的總DNA； b、利用ISSR-PCR反應擴增生鮮肉及其肉制品的DNA； C、構建生鮮肉及其肉制品的DNA電泳圖譜； d、鑒定陸川豬及其肉制品。
2.如權利要求1所述的陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定方法，其特征在于，所述ISSR-PCR所用的引物為WM14、WM12和WM29，其中核苷酸序列分別為:5’ -CTCCTCCTCGC-3’ ；5’-CACCACCACGC-3’ ；5’-CTCCTCCTCAT-3’ 。
3.如權利要求1所述的陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定方法，其特征在于，所述步驟b中的ISSR-PCR反應體系及程序為:25yL體系:模版DNAl μ L、引物2 μ L、2XTaqPCRMaster Mixl2.5μ L, ddH20 補足 25 μ L，其中 2XTaq PCR Master Mix 包含了 Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR反應的增強劑和優(yōu)化劑及穩(wěn)定劑，濃度為2X，且不含染料；擴增程序:95°C預變性5min，95°C變性30s，36°C退火30s，72°C延伸2min，循環(huán)30次，72°C再延伸5min。
4.如權利要求1所述的陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定方法，其特征在于，所述步驟c中用1.5%的瓊脂糖凝膠，IXTAE緩沖液為介質電泳檢測擴增結果，根據(jù)電泳圖繪制電泳圖譜。
5.如權利要求1所述的陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定方法，其特征在于，所述陸川豬是指原產(chǎn)于廣西壯族自治區(qū)東南部的陸川縣，主要分布于廣西玉林、梧州、欽州地區(qū)，屬于小型脂肪型豬種。
6.如權利要求1所述的陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定方法，其特征在于，所述肉制品是指以陸川豬為原料加工制備的扣肉和臘肉制品。
7.如權利要求1 7任意一項所述的陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定方法在鑒定陸川豬生鮮肉及其肉制品與其它豬品種生鮮肉及其肉制品中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述其它豬品種為長陸二元雜、大陸二元雜、杜長大三元雜、大陸長白三元雜、龍寶豬三元雜豬、巴馬香豬和環(huán)江香豬。
全文摘要
一種陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定方法，其中ISSR-PCR所用的引物為WM14、WM12和WM29，其核苷酸序列分別為5'-CTCCTCCTCGC-3'、5'-CACCACCACGC-3'和5'-CTCCTCCTCAT-3'。最終繪制了7張陸川豬及其肉制品的電泳圖譜，建立了陸川豬及其肉制品的DNA指紋圖譜，可作為區(qū)分鑒定陸川豬及其肉制品的依據(jù)。本發(fā)明采用可靠的DNA分子鑒定技術，快速、準確的鑒定了陸川豬、陸川豬雜交品種、巴馬香豬、環(huán)江香豬及其肉制品之間的區(qū)別，促進了陸川豬優(yōu)勢品牌豬的發(fā)展。
文檔編號C12Q1/68GK103215365SQ20131014909
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月26日 優(yōu)先權日2013年4月26日
發(fā)明者韋保耀, 王淼, 黃麗, 滕建文, 夏寧, 王勤志, 封毅 申請人:廣西大學