專利名稱：超分子有序體在檢測g-四鏈體結(jié)構(gòu)dna中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及超分子有序體在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
單鏈的端粒DNA很容易通過鳥嘌呤堿基之間的氫鍵發(fā)生四個(gè)堿基配對，形成平 面的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。人體端粒DNA序列d (TTAGGG) 4可以在鉀離子或納離子的作用 下形成不同結(jié)構(gòu)的G-四鏈體。在體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中識(shí)別G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA (主要是 與線性的雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA相區(qū)別)，對于確定G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA在人體內(nèi)的生理功 能和抗腫瘤藥物的研發(fā)等方面都有非常重要的作用。
目前，在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中識(shí)別G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA已有一些文獻(xiàn)報(bào)道。體內(nèi)實(shí) 驗(yàn)中識(shí)別G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA較為困難，目前仍存在較大的爭議。體外實(shí)驗(yàn)中識(shí)別 G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA，大都采用生物方法，最常見的是利用與G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA特異 性相互作用的蛋白質(zhì)(主要為各種DNA酶類)。目前發(fā)現(xiàn)的在體外實(shí)驗(yàn)中能與G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA特異性相互作用的蛋白質(zhì)已經(jīng)超過二十種(^/oessa;^ 2007， W, 155-165)。但是以純度較高的蛋白質(zhì)作為檢測物，難以分離純化，加上蛋白質(zhì)活 性不易保存，價(jià)格也非常昂貴，大大的限制了以上方法的使用范圍。有報(bào)道采用單 一熒光分子來特異性的標(biāo)記G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA，但是這種方法檢測手段復(fù)雜，儀器 要求非常高，基本上不能普及使用。如有文獻(xiàn)報(bào)道了一種熒光染料分子分別與G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA、雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合時(shí)，表現(xiàn)出不同的熒光壽命(^s7/f/ca7 C力柳&iT. 2004， 7《4490-4494)。
超分子有序體是數(shù)目不定的大量組分自發(fā)締合產(chǎn)生某個(gè)特定的相而形成的多 分子實(shí)體(Lehn， J. -M. 5"wpra/ffo7ec〃7ar c/zefflistry ..co"ce/ z^s朋cZ/7erspec"Kes; Weinheim: VCH， 1995.)。在超分子有序體中，分子間以非共價(jià)鍵的方式相互結(jié)合， 相互作用力相對較弱。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供超分子有序體在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA中的應(yīng)用。 本發(fā)明提供了超分子有序體在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA中的應(yīng)用。 所述應(yīng)用是通過檢測超分子有序體聚集狀態(tài)的變化來實(shí)現(xiàn)的。所述超分子有序體具體可為菁染料超分子聚集體。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，雙鏈結(jié)構(gòu)DNA和G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA可使超分子有序體發(fā)生 聚集狀態(tài)的改變。由于超分子有序體是大量分子相互作用的結(jié)果，在不同聚集狀態(tài) 下有不同的特性，這些特性可以被各種常規(guī)檢測手段所檢測到。如菁染料超分子有 序體在雙鏈DNA和G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA樣品的作用下，表現(xiàn)出不同的聚集狀態(tài)(單體 和聚集體的比例不同)。菁染料超分子有序體的聚集狀態(tài)的改變引起其熒光特性、 紫外吸收特性的改變，通過檢測熒光光譜、紫外吸收光譜，即可確定待測DNA是G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA還是雙鏈結(jié)構(gòu)DNA。
本發(fā)明提供了超分子有序體在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA中的應(yīng)用。應(yīng)用超分子有 序體檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA，具有簡單、快捷、相對廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，克服了現(xiàn)有檢測 技術(shù)周期長、價(jià)格高昂、技術(shù)及設(shè)備要求高的缺陷。
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為實(shí)施例1中作為對照的檢測液丙的紫外可見吸收光譜
圖2為實(shí)施例1中檢測液甲的紫外可見吸收光譜
圖3為實(shí)施例1中檢測液乙的紫外可見吸收光譜
圖4為實(shí)施例1中作為對照的檢測液丙的熒光光譜
圖5為實(shí)施例1中檢測液甲的熒光光譜
圖6為實(shí)施例1中檢測液乙的熒光光譜
圖7為實(shí)施例2中菁染料聚集體與不同結(jié)構(gòu)DNA作用后的共聚焦激光掃描熒光 顯微鏡(CLSM)圖像
具體實(shí)施例方式
樣本l: G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA樣品，序列為d (TTAGGG) 4，購自英駿生物技術(shù)有 限公司。將上述序列為d (TTAGGG) 4的寡聚DNA鏈適量溶解于磷酸緩沖液中，4°C 靜置24小時(shí)即可得到樣本1。
樣本2:線性雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA樣品，序列為d (TTAGGG) 4/ (AATCCC) 4，該 樣品由兩條序列分別為d (TTAGGG) 4和d (AATCCC) 4的互補(bǔ)DNA鏈(均購自英駿生 物技術(shù)有限公司)自行合成。將上述兩條DNA鏈分別適量溶于磷酸緩沖液中，按摩 爾比l: 1混合后置于85'C水浴中保溫15分鐘，緩慢冷卻至室溫后4'C靜置24小 時(shí)即可得到樣本2。樣本3: : G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA樣品，序列為d (TTAGGG) 4-肌，購自英駿生物 技術(shù)有限公司。將上述序列為d (TTAGGG) 4-順2的寡聚DNA鏈適量溶解于磷酸緩沖 液中，4'C靜置24小時(shí)即可得到樣本3。
樣本4:線性雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA樣品，序列為d (TTAGGG) 4-NH2/ (AATCCC) 4， 該樣品由兩條序列分別為d (TTAGGG) 4-朋2和d (AATCCC) ^的互補(bǔ)DNA鏈(均購自 英駿生物技術(shù)有限公司)自行合成。將上述兩條DNA鏈分別適量溶于磷酸緩沖液中， 按摩爾比1: 1混合后置于85"C水浴中保溫15分鐘，緩慢冷卻至室溫后4'C靜置24 小時(shí)即可得到樣本4。
以下實(shí)施例中所用的菁染料的具體制備方法如下(參見文獻(xiàn)Hamer， F. M. 7力e C/ 柳istr/0//feteroc7c7ic 6b卿ow/2叔Interscience: New York, 1964; Vol. 18. 及Ficken， G. E. 7Xe of分/ t力e^'c "/es; Academic Press: New York,
1971; Vol. 4.): .s<image>image see original document page 5</image>
以上合成路線所用原料，均可購自Sigma公司。
下面以菁染料超分子聚集體為例，闡明應(yīng)用超分子有序體檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu) DNA的具體技術(shù)方案。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 實(shí)施例1、應(yīng)用菁染料超分子有序體檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA1、 制備反應(yīng)液
1) 溶液甲
在2ml容量瓶中加入40!xL 200.0 "M的菁染料的甲醇(優(yōu)級(jí)純)溶液；加入 60 uL 200 u M的樣本1的磷酸緩沖溶液(pH 6.0)，用磷酸緩沖液(pH 6.0)定 容，混勻，得到溶液甲。溶液甲中，樣本l DNA與菁染料的摩爾比為1.5: 1。
2) 溶液乙
在2ml容量瓶中加入40 uL 200.0 uM的菁染料的甲醇(優(yōu)級(jí)純)溶液；加入 60uL 200 ixM的樣本2的磷酸緩沖溶液(pH 6.0)，用磷酸緩沖液(pH 6.0)定 容，混勻，得到溶液乙。溶液乙中，樣本2 DNA與菁染料的摩爾比為1.5: 1。
3) 溶液丙
在2ml容量瓶中加入40nL 200.0 uM的菁染料的甲醇(優(yōu)級(jí)純)溶液，用磷 酸緩沖液(pH 6.0)定容，混勻，得到溶液丙，作為對照。
2、 檢測
溶液甲、溶液乙和溶液丙中菁染料的濃度均為4 uM。避光反應(yīng)12小時(shí)，得到 檢測液甲、檢測液乙和檢測液丙。
1) 紫外可見吸收光譜分析
將檢測液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析，測液丙的紫外可見吸收光譜見圖1，檢 測液甲的紫外可見吸收光譜見圖2，檢測液乙的紫外可見吸收光譜見圖3。 由圖可見，結(jié)果如下
檢測液丙(沒有DNA)的吸收譜上只有菁染料聚集體的吸收峰(659.5nm)，強(qiáng) 度為0. 917;檢測液甲(含有G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料聚集體的特征峰 (659.5nm)消失(小于0.01);檢測液乙(含有雙鏈結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料 聚集體的吸收峰(659.5mn)強(qiáng)度為0. 755。
檢測液丙(沒有DNA)的吸收譜上沒有出現(xiàn)菁染料單體的特征峰(584nm);檢 測液甲(含有四鏈體結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料單體的特征峰(584nm)強(qiáng)度為 0.1482;檢測液乙(含有雙鏈結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料單體的特征峰(584mn)強(qiáng) 度為0.1165。
2) 熒光光譜分析
將檢測液進(jìn)行熒光光譜分析，測液丙的熒光光譜見圖4，檢測液甲的熒光光譜 見圖5，檢測液乙的熒光光譜見圖6。 由圖可見，結(jié)果如下檢測液丙(沒有DNA)的發(fā)射熒光光譜上只有菁染料聚集體的熒光發(fā)射峰 (662nm)，強(qiáng)度為0.647，而沒有菁染料單體的熒光發(fā)射峰(600nm);檢測液甲 (含有G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA)的熒光光譜上出現(xiàn)很強(qiáng)的菁染料單體熒光發(fā)射峰 (600nm)，強(qiáng)度為22. 83;檢測液乙(含有雙鏈結(jié)構(gòu)DNA)的熒光光譜上出現(xiàn)較弱 的菁染料單體熒光發(fā)射峰(600nm)，強(qiáng)度為8. 576。
3、結(jié)果分析
進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析時(shí)，當(dāng)溶液中沒有DNA樣品時(shí)，菁染料呈聚集體狀 態(tài)，只有聚集體的吸收峰(659.5nm)，不會(huì)出現(xiàn)單體的峰(584nm)。當(dāng)加入G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA時(shí)，菁染料與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，菁染料超
分子有序體的聚集狀態(tài)發(fā)生了明顯變化，由聚集體狀態(tài)轉(zhuǎn)為單體狀態(tài)，聚集體的峰 消失。當(dāng)加入雙鏈結(jié)構(gòu)DNA時(shí)，菁染料超分子有序體的聚集狀態(tài)變化不明顯，只有
少部分菁染料由聚集體狀態(tài)轉(zhuǎn)為單體狀態(tài)，聚集體的吸收峰強(qiáng)度稍有下降，同時(shí)出 現(xiàn)單體吸收峰。
進(jìn)行熒光光譜分析時(shí)，當(dāng)溶液中沒有DNA樣品時(shí)，菁染料呈聚集體狀態(tài)，只有 聚集體的熒光發(fā)射峰(662nm)，不會(huì)出現(xiàn)單體的峰(600nm)。當(dāng)加入G-四鏈體結(jié) 構(gòu)DNA時(shí)，菁染料與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，菁染料超分子有序 體的聚集狀態(tài)發(fā)生了明顯變化，由聚集體狀態(tài)轉(zhuǎn)為單體狀態(tài)。當(dāng)加入雙鏈結(jié)構(gòu)DNA 時(shí)，菁染料超分子有序體的聚集狀態(tài)變化不明顯，只有少部分菁染料由聚集體狀態(tài) 轉(zhuǎn)為單體狀態(tài)，因此只出現(xiàn)較弱的單體熒光發(fā)射峰。
實(shí)施例2、應(yīng)用菁染料超分子有序體檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA
1) 將樣本3和樣本4分別與巰基十一酸處理過的Au片反應(yīng)，使DNA分別組裝 到Au片表面，得到Au片甲和Au片乙；
2) 將處理好的Au片放入濃度為10 UM的菁染料磷酸緩沖溶液(pH 6.0)中 常溫下避光染色1小時(shí)；
3) 取出Au片后用磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，洗掉直接吸附到Au片表面的菁染料 聚集體；
4) 用氮?dú)獯蹈珊髮u片放到共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)下，用559nm的 激光激發(fā)菁染料分子的熒光，并分波長的接收菁染料分子的發(fā)射熒光圖像。
見圖7，從CLSM熒光圖像上可以很清楚的看到菁染料超分子有序體標(biāo)記出了 Au片表面組裝有DNA樣品的部分，并且能夠識(shí)別出組裝在Au片表面的不同結(jié)構(gòu)的 DNA樣品。
權(quán)利要求
1、超分子有序體在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA中的應(yīng)用。
2、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用是通過檢測超分子有序體聚 集狀態(tài)的變化來實(shí)現(xiàn)的。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述超分子有序體為菁染料超分 子聚集體。
全文摘要
本發(fā)明公開了超分子有序體在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過檢測超分子有序體聚集狀態(tài)的變化來實(shí)現(xiàn)G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA的檢測。應(yīng)用超分子有序體檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA，具有簡單、快捷、相對廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，克服了現(xiàn)有檢測技術(shù)周期長、價(jià)格高昂、技術(shù)及設(shè)備要求高的缺陷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101587070SQ20081011239
公開日2009年11月25日 申請日期2008年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者向俊鋒, 唐亞林, 徐廣智, 楊千帆 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所