專利名稱：生產(chǎn)偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的超級質(zhì)粒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)試劑制備和基因工程應(yīng)用領(lǐng)域，具體說是一種通 過基因工程手段構(gòu)建的超級質(zhì)粒及其制備方法，該超級質(zhì)粒用于使用限制性 內(nèi)切酶酶切的方法制備偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
背景技術(shù)：
在DNA合成及各種方式的基因操作過程中，需要對合成的或進行操作的 DNA分子大小變化進行監(jiān)測，常用的方法是通過將待測DNA分子與一種己知 分子量的DNA混合標(biāo)準(zhǔn)物(分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA marker)同時進行電泳，通過 比較待測DNA分子與DNA分子標(biāo)準(zhǔn)在電泳過程中的遷移距離來判斷DNA樣 品分子的大小。因此，需要制備一些已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段混合物。
現(xiàn)有技術(shù)中制備標(biāo)準(zhǔn)DNA的方法己有多種方法
化學(xué)合成法通過化學(xué)反應(yīng)的方法將4種不同的脫氧核糖核苦酸腺嘌呤 (dATP)，鳥嘌呤(dGTP)，胞嘧啶dCTP)，胸腺嘧啶(dTTP)結(jié)合在一 起，合成目標(biāo)大小的DNA片段。該方法操作十分繁瑣，效率極低，合成的DNA 長度受到嚴重的限制， 一般可合成DNA的長度不超過400hp，大分子量的 DNA片段無法直接用化學(xué)合成法來合成，成本太高，因而不適用DNA分子量 的常規(guī)制備。
片段連接法先用PCR或者合成的方法獲得小分子量的DNA分子(如 100bp)，再用酶促連接反應(yīng)將小分子DNA—個一個順序連接起來，形成不同 大小的DNA分子(100 bp、 200 bp、 300 bp、 400 bp、...)。該方法理論上講 可以制備各種大小的DNA分子，但操作卻十分繁瑣，可再現(xiàn)性差，無法實現(xiàn) 大規(guī)模制備。
聚合酶鏈反應(yīng)法DNA聚合酶鏈反應(yīng)已廣泛用于基因克隆和DNA片般的 制備。目前國內(nèi)外已被廣泛用來制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物。但是該方法費時費 力，其生產(chǎn)能力有限。
酶切法用一種或兩種限制性內(nèi)切酶組合對噬菌體DNA或人工設(shè)計的質(zhì) 粒進行切割，產(chǎn)生不同大小的DNA片段，以作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。該方法的 優(yōu)點是容易大量制備，產(chǎn)率高。但該方法的缺點也很突出酶切產(chǎn)生的DNA 片段大小受到所用的限制性酶種類的限制，其制約因素是人工構(gòu)建質(zhì)粒的設(shè) 計水平。
長期以來，分子生物學(xué)試劑與基因工程應(yīng)用領(lǐng)域，需要一種高水平的人 工構(gòu)建質(zhì)粒設(shè)計，以克服酶切產(chǎn)生的DNA片段大小受到所用的限制性酶種類 的限制，以快速、精確、大量地生產(chǎn)偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容
經(jīng)過長期的實驗室研究，本發(fā)明恰恰滿足了上述需求，其目的在于提供一種通過基因工程手段構(gòu)建的、全新的、能夠快速、精確、大量地通過酶 切方法生產(chǎn)200bp偶數(shù)梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的超級質(zhì)粒。
本發(fā)明能夠的進一步目的在于提供一種生產(chǎn)200bp偶數(shù)梯度DNA分子量 標(biāo)準(zhǔn)的超級質(zhì)粒的制備方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案
通過PCR的方法以Lambda DNA為模板分別擴增了 400bp、 600bp、 800bp、 1000bp、 1400bp、 2000bp幾條片段，其中1400bp和1000bp通過pfii DNA聚合 酶進行擴增，而400bp-A、 400bp-B、 600bp、 800bp分別用Taq DNA聚合酶進 行擴增。然后利用Taq DNA聚合酶的加尾活性對1400bp和1000bp兩條片段加 T。再利用A/T互補的原理在離心管中建立連，體系，利用T4連接酶使600bp、 800bp、 1000bp連接成一個600-800-1000的單元，同樣400bp-A、 400bp-B、 1400bp 連接成400A-1400-400B的單元。然后通過T/A克隆試劑盒，把上述兩個單元分 別克隆到T載體中形成中間載體T681和T4144。
通過Pst I酶切將400A-1400-400B單元從T4144中切出來，并利用核酸純化 回收試劑盒進行回收和純化。同時T681載體也被Pst I酶切完全酶切，并利用 小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)進行載體脫磷處理，以防止載體自連。建立合適的 連接體系，把400-1400-400單元連接進脫磷處理的T681載體所得中間載體命名 為T6814144。通過與上述過程相近的技術(shù)路線，利用PCR方法從LambdaDNA 中擴增獲得一個2000bp的片段，并克隆到T載體中，然后用內(nèi)切酶SphI再切 出來，連入同樣Sphl酶切和CIAP脫磷處理的T6814144，獲得超級質(zhì)粒，命名 為pYE9600。
所獲得的超級質(zhì)粒pYE9600是一種全新的超級DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。其中 含有400bp、 600 bp、 800bp、 1000bp、 1400bp、 2000bp六條片段，其中400bp 為雙拷貝，以增強其觀察時的熒光強度。質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切后可以獲得一個由7 條片段組成的200bp偶數(shù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)梯度。同時各條DNA帶的濃度(質(zhì)
量)之間具有一定的比列關(guān)系(4: 3: 4: 5: 7: 10: 15)。
本發(fā)明的有益效果在于利用成熟的生產(chǎn)工藝和基因工程構(gòu)建了一種人工超
級質(zhì)粒，該質(zhì)粒是一種全新的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，對該質(zhì)粒進行切割制備 200bp偶數(shù)梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，克服了傳統(tǒng)的酶切法產(chǎn)生的DNA片段大小受 到所用的限制性酶種類的限制，容易大量制備，產(chǎn)率高。實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。


圖1是生產(chǎn)偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的超級質(zhì)粒pYE9600圖譜。
具體實施例方式
生產(chǎn)偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的超級質(zhì)粒制備方法，具體包括如下 歩驟
1. 通過PCR的方法分別擴增400bp、 600bp、 800bp、 1000bp、 1400bp、 2000 bp幾條片段，其中1400bp和1000bp通過pfuDNA聚合酶進行擴增，而400bp、 600 bp、 800 bp分別用Taq DNA聚合酶進行擴增。 -
2. 利用Taq DNA聚合酶的加尾活性對1400 bp和1000 bp兩條片段加T。
3. 利用A/T互補在離心管中建立連接體系，使600bp、 800bp、 lOOObp連接 成600-800-1000的單元，400bp和1400bp連接成400-1400-400的單元。
4. 通過T/A克隆試劑盒，把上述的600-800-1000、 400-1400-400兩個單元分別克隆到T載體中形成中間載體T681和T4144。
5. 通過Pst I酶切將400-1400-400單元從T4144中切出來，并回收。同時T68I 載體也被Pst I酶切完全酶切，并利用CIAP進行載體脫磷處理，以防止載體自連。
6. 把400-1400-400單元連接進上述的脫磷處理的T681載體所得中間載體 T6814144。
7. CIAP脫磷處理T6814144。
8.2000bp克隆到T載體中，然后用內(nèi)切酶Sph I再切出來，連入同樣SphI 酶切和CIAP脫磷處理的T6814144,獲得質(zhì)粒pYE9600。
該質(zhì)粒是一種全新的超級DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。其中含有400bp、 600 bp、 800bp、 1000bp、400bp、 2000bp、 3000bp七條片段，其中400bp為雙拷貝，以 增強其觀察時的熒光強度。質(zhì)粒經(jīng)EcoR I酶切后可以獲得一個由7條片段組成 的200bp偶數(shù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)梯度。同時各條DNA帶的濃度(質(zhì)量)之間具
有一定的比列關(guān)系(4: 3: 4: 5: 7: 10: 15)。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的超級質(zhì)粒，該質(zhì)粒是一種全新的超級DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，其特征在于其中含有400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp、3000bp七條片段；400bp為雙拷貝；經(jīng)EcoR I酶切后可以獲得一個由7條片段組成的200bp偶數(shù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)梯度；同時各條DNA帶的濃度(質(zhì)量)之間具有一定的比列關(guān)系(4∶3∶4∶5∶7∶10∶15)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的超級質(zhì)粒 的制備方法，包括通過PCR的方法分別擴增400bp、 600bp、 800bp、 1000bp、 1400bp、 2000bp幾條片段，其特征在于(1) 對400 bp、 600 bp、 800 bp分別通過普通Taq DNA聚合酶進行擴增；(2) 對1400bp、 1000bp分別通過p/wDNA聚合酶進行擴增；(3) 利用Taq DNA聚合酶的加尾活性對1400 bp和1000 bp兩條片段加T;(4) 利用A/T互補在離心管中建立連接體系，使600bp、 800bp、 1000bp 連接成600-800-1000的單元，400bp和1400bp連接成400-1400-400的單元；(5) 通過T/A克隆試劑盒，把上述的600-800-1000、 400-1400-400兩個單 元分別克隆到T載體中形成中間載體T681和T4144;(6) 通過Pst I酶切將400-1400-400單元從T4144中切出來，并回收；同 時T681載體也被Pst I完全酶切，并利用CIAP進行載體脫磷處理；(7) 把400-1400-400單元連接進上述的脫磷處理的T681載體獲得中間載 體T6814144;(8) 將2000bp片段克隆到T載體中，然后用內(nèi)切酶SphI再切出來，連入 同樣Sph I酶切和CIAP脫磷處理的T6814144，獲得超級質(zhì)粒pYE9600。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的超級質(zhì)粒 制備方法，其特征在于所述的400bp、 600bp、 800bp分別通過聚合酶進行擴 增，具體是指用TaqDNA聚合酶進行擴增。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的超級質(zhì)粒 制備方法，其特征在于所述的1400 bp、 1000bp分別通過聚合酶進行擴增，具 體是指用pfuDNA聚合酶進行擴增。
全文摘要
利用Taq DNA聚合酶的加尾活性和對連接產(chǎn)物的選擇性凝膠回收，構(gòu)建了一種全新的生產(chǎn)偶數(shù)200bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的超級質(zhì)粒。該質(zhì)粒是一種全新的超級DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。其中含有400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp、3000bp七條片段，其中400bp為雙拷貝，以增強其電泳后染色觀察時的熒光強度。質(zhì)粒經(jīng)EcoR I酶切后可以獲得一個由7條片段組成的200bp偶數(shù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)梯度。同時各條DNA帶的濃度(質(zhì)量)之間具有一定的比列關(guān)系(4∶3∶4∶5∶7∶10∶15)。克服了傳統(tǒng)的酶切法產(chǎn)生的DNA片段大小受到所用的限制性酶種類的限制，容易大量制備，產(chǎn)率高。
文檔編號C12N15/11GK101575601SQ200810015779
公開日2009年11月11日 申請日期2008年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月7日
發(fā)明者葉春江 申請人:濟南大學(xué)