鴨源多種致病菌的多重pcr檢測引物組及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物檢測【技術領域】，具體公開了鴨源多種致病菌的多重PCR檢測引物組及其試劑盒。所述引物組包含4對引物：RArpoB-P1和RArpoB-P2；E.coliphoA-P1和E.coliphoA-P2；SalminvA-P1和SalminvA-P2；和Strep16srRNA-P1和Strep16srRNA-P2。用上述四對引物進行多重PCR擴增，能同時快速、方便、特異、靈敏地檢測鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和鏈球菌四種細菌，可用于細菌鑒定、疾病診斷和流行病學調(diào)查，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟效益。
【專利說明】鴨源多種致病菌的多重PCR檢測引物組及其試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測【技術領域】，具體涉及鴨源多種致病菌的多重PCR檢測引物組及其試劑盒。
【背景技術】
[0002]鴨疫里氏桿菌{RiemerellaAnatipestifer，RA)是雛鴨、雛火雞以及雛鵝等多種禽類感染發(fā)病的致病菌，對I~8周齡的鴨危害最大，臨床上呈急性或慢性敗血癥，病變以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎為主，部分病例出現(xiàn)干酪性輸卵管炎、結膜炎、關節(jié)炎等特征，俗稱鴨傳染性漿膜炎。
[0003]鴨大腸桿菌病是致病性大腸桿菌coli, E.coli)感染所引起，由于感染鴨的年齡、抵抗力以及大腸桿菌的致病力、感染途徑的不同，可以產(chǎn)生許多不同的病理變化和臨床癥狀。在雛鴨以引起大腸桿菌肝炎和腦炎為特征，在產(chǎn)蛋鴨以發(fā)生大腸桿菌性生殖器官病為特性。大腸桿菌是一種條件性致病菌，當各種應激刺激造成鴨的免疫功能降低時，就會發(fā)生感染。因此，在臨床上常常成為鴨疫里氏桿菌病的并發(fā)癥。
[0004]鴨鏈球菌病是由鏈球菌(SirepiococciAs，Strep)引起的鴨的急性或慢性傳染病，雛鴨感染主要表現(xiàn)為急性死亡，一旦發(fā)病，可引起大量死亡。成年鴨和種鴨感染主要表現(xiàn)為跛行與癱瘓，死亡率較低，對生產(chǎn)性能的影響較大，造成較大的經(jīng)濟損失。
[0005]鴨沙門氏菌病是由鼠傷寒沙門氏菌、鴨沙門氏菌和腸炎沙門氏菌等引起的疾病的總稱。各種日齡的鴨都能感染，主要發(fā)生在雛鴨，可造成大批死亡。這一類細菌可引起人的食物中毒，在公共衛(wèi)生上有重要意義。
[0006]鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌Salm)是造成鴨纖維性心包炎、漿膜炎及肝周炎的主要致病菌，給世界各國養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重危害。同時，鴨疫里氏桿菌與鏈球菌混合感染也較為常見。主要表現(xiàn)為漿膜炎，容易導致誤診，若僅按漿膜炎治療，雖癥狀會減輕，死亡率有所下降，但停藥后又復發(fā)。
[0007]以上4種細菌性傳染病都易發(fā)生于雛鴨，且容易混合感染，均可引起漿膜炎，其臨床癥狀和剖檢病變相似，難以區(qū)分。目前對這些致病菌的檢驗仍主要沿用傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)、生化鑒定的方法以及針對單個病原建立的PCR檢測方法等。細菌的分離與鑒定是診斷的金標準，但這種方法檢測周期長、操作繁瑣，靈敏度低且不能大批量檢測。
[0008]覃宗華等研究的“鴨疫里默氏菌病和大腸桿菌病鑒別診斷雙重PCR方法的建立和應用”公開了一種能快速準確鑒別診斷鴨疫里默氏菌和大腸桿菌病的雙重PCR方法，但該方法也僅能同時檢測2種鴨子的細菌病，為了節(jié)約成本，提高檢測效率，尋求一種同時檢測多種細菌病的方法是必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術中鴨源致病菌檢測技術的不足，提供一組用于鴨源多種致病菌的檢測引物組，所述致病菌包括鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌及沙門氏菌。
[0010]本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述檢測引物組的試劑盒。
[0011]本發(fā)明的另一個目的是提供上述檢測試劑盒在檢測鴨疫多種致病菌中的應用。
[0012]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的:
本發(fā)明提供了一種用于檢測4種鴨源致病菌的多重PCR檢測引物組，所述引物組包含
4對引物:RA rpoB-Pl 和 RA rpoB-P2 ;Ε.coli phoA-Pl 和 E.coli phoA_P2 ；Salm invA-Pl和 Salm invA-P2 ；Strep 16srRNA_Pl 和 Str印 16srRNA_P2 ;引物序列如 SEQ ID NO:1 ~8所示；所述4種鴨源致病菌為鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌和鏈球菌。
[0013]其中所述RA rpoB-Pl的核酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述RA rpoB_P2的核酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述E.coli phoA-Pl的核酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述E.coliphoA-P2的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述Str印16srRNA_Pl的核酸序列如SEQ ID NO:5所不，所述Strep 16SrRNA_P2的核酸序列如SEQ ID NO:6所不,所述Salm invA-Pl的核酸序列如SEQ I D NO:7所示，所述Salm invA-P2的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0014]本發(fā)明利用 申請人:測定并提交到GenBank上鴨疫里氏桿菌不同血清型基因的序列(GenBank accession numbers),與在GenBank上發(fā)表的其他細菌如大腸桿菌、鏈球菌、沙門氏菌等的基因進行比對，選擇序列差異大的區(qū)域設計引物，用于鴨疫里氏桿菌的檢測。
[0015]本發(fā)明選擇大腸桿菌的持家基因基因作為靶基因，用于鴨大腸桿菌的檢測。對已發(fā)表的不同細菌的/AM基因序列比對重新設計引物。
[0016]本發(fā)明選擇鏈球菌的16SrRNA基因作為靶基因，16SrRNA素有“細菌化石”之稱，該基因序列幾乎可以對所有的細菌進行種屬水平上的鑒定，是細菌分類學研究中最常用、最有用的“分子鐘”。本發(fā)明對已發(fā)表鏈球菌的16SrRNA基因序列進行比對重新設計引物。
[0017]本發(fā)明選擇沙門氏菌基因作為靶基因，用于鴨沙門氏菌的檢測。對已發(fā)表沙門氏菌基因序列進行比對重新設計引物。
[0018]本發(fā)明還提供了一種用于檢測4種鴨源致病菌的多重PCR檢測試劑盒，所述試劑盒含有上述引物組，所述4種鴨源致病菌為鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌和鏈球菌。
[0019]優(yōu)選地，所述多重PCR檢測試劑盒中各引物對的上游引物和下游引物的濃度分別為10 μ Μ，所述試劑盒還含有10XPCR反應緩沖液、DNA聚合酶和dNTP。所述10XPCR反應緩沖液含有IOOmM Tris-HCl (pH8.3)，500mM KCl和15mM MgCl2 ;所述DNA聚合酶濃度為5units/ μ L、dNTP 濃度為 2.5mM。
[0020]優(yōu)選地，所述多重PCR檢測試劑盒的多重PCR反應體系為:10XPCR反應緩沖液
5μ L、DNA 聚合酶 0.3 μ L、dNTP 4 μ L、rpoB-Pl 0.5 μ L、rpoB-P2 0.5 μ L、phoA-Pl
0.5 μ L,phoA-P2 0.5 μ L、16SrRNA_Pl 0.5 μ L、16SrRNA_P2 0.5 μ L.1nvA-Pl 0.5 μ L、invA-P2 0.5 μ L，DNA模板I μ L，用無菌的超純水補齊到25 μ L。
[0021]優(yōu)選地，所述多重PCR檢測試劑盒的多重PCR的反應條件為:95°C預變性5min，94°C 35s, 56°C 35s，72°C 45s 共運行 35 個循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。
[0022]本發(fā)明還提供了上述多重PCR檢測試劑盒在檢測鴨疫致病菌中的應用。
[0023]本發(fā)明還提供了上述多重PCR檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
S1.提取待測樣品DNA;52.利用上述試劑盒進行多重PCR；
53.將PCR后的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，進行結果判定，所述結果判定為:若出現(xiàn)139bp，256bp，327bp，和482bp條帶，則表明樣本含鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌和鏈球菌和沙門氏菌；若出現(xiàn)139bp，256bp和327bp，則表明樣本含鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌和鏈球菌；若出現(xiàn)139bp，256bp和482bp條帶，則表明樣本含鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌和沙門氏菌；若出現(xiàn)256bp，327bp和482bp條帶，則表明樣本含大腸桿菌和鏈球菌和沙門氏菌；若出現(xiàn)139bp，327bp和482bp條帶，則表明樣本含鴨疫里氏桿菌和鏈球菌和沙門氏菌；若出現(xiàn)139bp和256bp條帶，則表明樣本含鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌；若出現(xiàn)139bp，327bp條帶，則表明樣本含鴨疫里氏桿菌和鏈球菌；若出現(xiàn)139bp和482bp條帶，則表明樣本含鴨疫里氏桿菌和沙門氏菌；若出現(xiàn)256bp和327bp條帶，則表明樣本含和大腸桿菌和鏈球菌；若出現(xiàn)256bp和482bp條帶，則表明樣本大腸桿和沙門氏菌；若出現(xiàn)327bp和482bp條帶，則表明樣本含鏈球菌和沙門氏菌；若出現(xiàn)139bp條帶，則表明樣本含鴨疫里氏桿菌；若出現(xiàn)256bp條帶，貝1J表明樣本含大腸桿菌；若出現(xiàn)327bp條帶，則表明樣本含鏈球菌；若出現(xiàn)482bp條帶，則表明樣本含沙門氏菌。 [0024]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明提供了一種多重PCR檢測引物組及含有所述引物組的多重PCR檢測試劑盒，所述引物組或試劑盒用于檢測鴨源多種致病菌，不僅大大縮短檢測時間，還能批量對樣品進行檢測，即能同時快速、方便、特異、靈敏地檢測鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和鏈球菌四種細菌。
[0025]本發(fā)明還提供了上述引物組或試劑盒在檢測鴨疫致病菌中的應用。所述引物組或試劑盒快速、簡便、反應靈敏，可用于細菌鑒定、疾病診斷和流行病學調(diào)查，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1多重PCR特異性檢測；M =Takara DL500 marker ;泳道a:鴨疫里氏桿菌；泳道b:大腸桿菌；泳道c:鏈球菌；泳道d:沙門氏菌；泳道e:鴨疫里氏桿菌+大腸桿菌；泳道f:鴨疫里氏桿菌+鏈球菌；泳道g:鴨疫里氏桿菌+沙門氏菌；泳道h:大腸桿菌+鏈球菌；泳道1:大腸桿菌+沙門氏菌；泳道j:鏈球菌+沙門氏菌；泳道k:鴨疫里氏桿菌+大腸桿菌+鏈球菌；泳道1:大腸桿菌+鏈球菌+沙門氏菌；泳道m(xù):鴨疫里氏桿菌+大腸桿菌+沙門氏菌；泳道η:鴨疫里氏桿菌+鏈球菌+沙門氏菌；泳道ο:鴨疫里氏桿菌+大腸桿菌+鏈球菌+沙門氏菌；泳道P:陰性對照(去離子水);
圖2多重PCR靈敏性檢測；M =Takara DL500 marker ;泳道a:4X IO4拷貝；泳道b:4X103拷貝j}dtC:4X102拷貝AIdtdMXlO1拷貝；泳道6:陰性對照(去離子水)；
圖3鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌和沙門氏菌實驗室感染臨床樣品檢測；泳道M:Takara DL2000marker ;泳道a:鴨疫里氏桿菌(血清型I型)感染鴨的肝組織；泳道b:鴨疫里氏桿菌(血清型I型)感染鴨的腦組織；泳道c:大腸桿ATCC8099株感染鴨的肝組織；泳道d:大腸桿菌ATCC8099株感染鴨的腦組織；泳道e:鏈球菌CVCC556株感染鴨的肝組織；泳道f:鏈球菌CVCC556株感染鴨的腦組織；泳道g:鼠傷寒沙門氏菌感染鴨的肝組織；泳道h:鼠傷寒沙門氏菌感染鴨的腦組織；泳道1:鴨疫里氏桿菌+大腸桿菌+鏈球菌+沙門氏菌；泳道j:陰性對照(去離子水)。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合說明書附圖和具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域技術人員熟悉的意義相同。
[0028]實施例1引物設計及引物特異性檢測
本實施例利用 申請人:測定并提交到GenBank上鴨疫里氏桿菌不同血清型基因的序列(GenBank accession numbers),與在GenBank上發(fā)表的其他細菌如大腸桿菌、鏈球菌、沙門氏菌等的基因進行比對，選擇序列差異大的區(qū)域設計引物，用于鴨疫里氏桿菌的檢測，所述引物對為 RA rpoB-Pl (SEQ ID NO:1)和 RArpoB_P2 (SEQ ID NO:2)。
[0029]本實施例選擇大腸桿菌的持家基因基因作為靶基因，用于鴨大腸桿菌的檢測。對已發(fā)表的不同細菌的/AM基因序列比對重新設計引物，所述引物對為E.coliphoA-Pl (SEQ ID NO:3)和 E.coli phoA_P2 (SEQ ID NO:4)。
[0030]本實施例選擇鏈球菌的16SrRNA基因作為靶基因，對已發(fā)表鏈球菌的16SrRNA基因序列重新設計引物，所述引物對為Str印16srRNA-Pl(SEQ ID NO:5)和Str印16srRNA_P2(SEQ ID NO:6)。
[0031]本實施例選擇沙門氏菌基因作為靶基因，用于鴨沙門氏菌的檢測。對已發(fā)表沙門氏菌基因序列重新設計引物，所述引物對為Salm invA-Pl (SEQ ID NO:7)和Salm invA-P2 (SEQ ID NO:8)。
[0032]上述4對引物序列如下:
SEQ ID NO:1:5’ -TGCCCAAGCGAATGTGGAGC-3’ ；
SEQ ID NO:2:5’ -ACCGGAAATCTGGTTTGGCG-3’ ；
SEQ ID NO:3:5’ -CGATAAGCCCGCAGTCACCT-3’ ；
SEQ ID NO:4:5’ -GACCAGCGTGTTACCCTCCT-3’ ；
SEQ ID NO:5:5’ -TACCAGAAAGGGACGGCTAA-3’ ；
SEQ ID NO:6:5’ -CGTTTACGGCGGCGTGGACTACC-3’ ；
SEQ ID NO:7:5’ -TGGGTAACGCATGAAGAGGG-3’ ；
SEQ ID NO:8:5’ -GGGTCAAGGCTGAGGAAGGT-3’。
[0033]根據(jù)所設計的4對特異性PCR引物對26株常見致病菌進行PCR檢測陰性、陽性結果，其中10株鴨疫里氏桿菌均檢測到rpoB基因，所有非鴨疫里氏桿菌均未見上述特異性擴增帶；5株大腸桿菌均檢測到PhoA基因，所有非大腸桿菌均未見上述特異性擴增帶；2株鏈球菌均檢測到16SrRNA基因，所有非鏈球菌均未見上述特異性擴增帶；5株沙門氏菌均檢測到invA基因，所有非沙門氏菌未見上述特異性擴增帶。即表明4對引物具有較好的特異性。
[0034]實施例2鴨源多種致病菌多重PCR檢測試劑盒的建立 按下列組成配制鴨源致病菌多重PCR檢測試劑盒:
含有 10 XPCR 反應緩沖液(IOOmM Tris-HCl (pH8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl2)、DNA 聚合酶(5units/y L)、dNTP (2.5mM)、4 對引物(IOuM)的序列如下:SEQ ID NO:1:5’ -TGCCCAAGCGAATGTGGAGC-3’ ；
SEQ ID NO:2:5’ -ACCGGAAATCTGGTTTGGCG-3’ ；
SEQ ID NO:3:5’ -CGATAAGCCCGCAGTCACCT-3’ ；
SEQ ID NO:4:5’ -GACCAGCGTGTTACCCTCCT-3’ ；
SEQ ID NO:5:5’ -TACCAGAAAGGGACGGCTAA-3’ ；
SEQ ID NO:6:5’ -CGTTTACGGCGGCGTGGACTACC-3’ ；
SEQ ID NO:7:5’ -TGGGTAACGCATGAAGAGGG-3’ ；
SEQ ID NO:8:5’ -GGGTCAAGGCTGAGGAAGGT-3’。
[0035]本發(fā)明對上述條件進行了優(yōu)化，最終確定該試劑盒的反應體系為=IOXPCR反應緩沖液 5 μ L、DNA 聚合酶 0.3 μ L、dNTP 4 μ L、rpoB-Pl 0.5 μ L、rpoB-P2 0.5 μ L、phoA-Pl 0.5 μ L, phoA-P2 0.5 μ L、16SrRNA_Pl 0.5 μ L、16SrRNA_P2 0.5 μ L、invA-Pl
0.5 μ L、invA-P2 0.5 μ L，DNA模板I μ L，用無菌的超純水補齊到25 μ L。
[0036]上述DNA模板由大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌和鴨疫里氏桿菌這4種細菌的DNA組成，上述細菌DNA的提取過程為:挑取單個大腸桿菌和沙門氏菌菌落分別于3mL LB肉湯培養(yǎng)基中于37°C 200 rpm搖床內(nèi)培養(yǎng)過夜；挑取單個鏈球菌和鴨疫里氏桿菌菌落分別于3mL加5%血清的TSB培養(yǎng)基中37°C 200 rpm搖床內(nèi)培養(yǎng)過夜。所得上述4種細菌的菌液于12000 rpm離心5min,棄上清,用200 μ L I X TE溶液重懸后，煮沸10 min,冰浴5 min,12000 rpm離心5min,取上清，_20°C保存。
[0037]上述多重PCR的反應條件為:95°C預變性5 min，在94°C 35 s，56°C 35 s，72°C45 s共運行35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0038]上述多重PCR擴增產(chǎn)物的鑒定:取5 μ L PCR產(chǎn)物與6 X loading Buffer混合后加到2.5%的瓊脂糖凝膠中，電泳條件為120V, 30min ;以Takara DL 500 marker為標準參照，在紫外成像儀下觀察檢測結果。檢測表明鴨疫里氏桿菌rpoB、大腸桿菌phoA、鏈球菌16SrRNA和沙門氏菌invA這4種靶基因的長度分別為139bp，256bp，327bp，482bp。
[0039]實施例3所述多重PCR檢測試劑盒的特異性
分別配制107 cfu/mL鴨疫里氏桿菌(血清型I型)、大腸桿菌(ATCC8099)、鏈球菌(CVCC556)、鼠傷寒沙門氏菌、禽巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和支原體等18株菌，用水煮法提取18株菌的DNA模板。將鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌和沙門氏菌4株菌提取的單一菌株DNA、兩兩混合菌株DNA、三三混合菌株DNA和四株混合菌株DNA為模板，禽巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和支原體4株菌提取的單一菌株DNA為模板，在實施例2所述優(yōu)化的PCR條件下進行PCR反應，以確定多重PCR反應的特異性。對PCR反應產(chǎn)物進行電泳后觀察，結果如圖1所示，圖1結果表明除了本發(fā)明所述鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌和沙門氏菌之外，其他細菌條帶均未檢出，說明本發(fā)明可以特異性地檢測出鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌和沙門氏菌。
[0040]實施例4所述多重PCR檢測試劑盒的靈敏性
將單個PCR產(chǎn)物使用PMD18-T Vector試劑盒進行膠回收，膠回收產(chǎn)物與18-T載體16°C連接過夜，然后使用DH5a感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，200 rpm 37°C下培養(yǎng)I h，吸取100μ L涂在SOC培養(yǎng)基上過夜。挑取白色菌落于5mL LB肉湯培養(yǎng)過夜，使用omega試劑盒提取質(zhì)粒進行測序，并檢測質(zhì)粒濃度。通過公式進行質(zhì)粒拷貝數(shù)的估算，統(tǒng)一每種質(zhì)粒的拷貝數(shù)，并配制四個菌的混合模板。所得到的混合模板用ddH20進行10倍稀釋。在PCR反應中分別加入I μ L混合模板，使每個稀釋度下的每種質(zhì)粒模板終濃度為4Χ IO4拷貝、4Χ IO3拷貝、4Χ IO2拷貝、4Χ IO1拷貝。以實施例2所述優(yōu)化的PCR條件進行擴增，從而確定多重PCR的敏感性，結果如圖2所示，圖2結果為鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌均為4Χ IO2拷貝，鏈球菌為4X IO3拷貝。
[0041 ] 實施例5所述多重P CR檢測試劑盒對實驗室樣品的檢測
運用實施例2建立的多重PCR檢測試劑盒對實驗室保存的80株鴨疫里氏桿菌、96株大腸桿菌、12株鏈球菌和142株沙門氏菌臨床分離株進行了檢測。
[0042](I)細菌DNA模板制備
將鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌和沙門氏菌的單個菌落分別接種到TSB+5%血清或LB液體培養(yǎng)基，37°C搖菌。大腸桿菌和沙門氏菌搖菌4 h，鴨疫里氏桿菌和鏈球菌搖菌8 h。各取3mL菌液于EP管中用水煮法提取DNA，-20°C保存。并設已知的鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌和沙門氏菌4種菌混合菌液用水煮法提取DNA，作為陽性對照；另外以去離子水代替DNA模板作為陰性對照。
[0043](2) PCR反應體系
采用優(yōu)化后的多重PCR體系進行檢測:10XBuffer 5 μ L、DNA聚合酶0.3 μ L、dNTP4 μ L、rpoB_Pl 0.5 μ L、rpoB_P2 0.5 μ L、phoA-Pl 0.5 μ L、phoA_P2 0.5 μ L>16SrRNA-Pl 0.5 μ L、16SrRNA -P2 0.5 μ L、invA -Pl 0.5 μ L、invA -P2 0.5 μ L, DNA 模板 Iμ L，用無菌的超純水補齊到25 μ L0
[0044](3)多重PCR 反應條件:95°C預變性 5 min，在 94°C 35 s，56°C 35 s,72°C 45 s 共運行35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0045](4)多重PCR檢測結果:檢測結果顯示鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌和沙門氏菌4種細菌的陽性位置出現(xiàn)了對應的條帶，即呈現(xiàn)特異性的反應。即表明本發(fā)明對上述4種細菌的臨床分離株都可進行特異性檢測。
[0046]實施例6所述多重PCR檢測試劑盒對臨床樣品的檢測
8份樣品來自實驗室分別感染了鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌或沙門氏菌的鴨的腦組織和肝臟組織。24份病死鴨的肝臟、腦組織均來自發(fā)病鴨場收集到的，且懷疑是細菌感染的病死鴨。
[0047](I) DNA模板的制備
無菌操作用接種環(huán)挑取少量鴨的肝臟、腦組織，接種于TSB+5%血清液體培養(yǎng)基中，37°C搖菌培養(yǎng)過夜。取3mL菌液于EP管中用水煮法提取DNA，-20°C保存。并設已知的鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌和沙門氏菌4種菌混合菌液用水煮法提取DNA，作為陽性對照；另外以去離子水代替DNA模板作為陰性對照。
[0048](2) PCR反應體系
采用優(yōu)化后的多重PCR體系進行檢測=IOXBuffer 5 μ L、DNA聚合酶0.3 μ L,dNTP 4μ L> rpoB-Pl 0.5 μ L> rpoB~P2 0.5 μ L、phoA-Pl 0.5 μ L> pho A-P2 0.5 μ L>16SrRNA-P10.5 μ LU6SrRNA -P2 0.5 μ L.1nvA -Pl 0.5 μ L.1nvA -P2 0.5 yL，DNA模板 I μ L，用無菌的超純水補齊到25 UL0
[0049](3)多重PCR 反應條件:95°C預變性 5 min，在 94°C 35 s，56°C 35 s,72°C 45 s 共運行35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0050] (4)多重PCR檢測結果
用實施例2所述試劑盒進行多重PCR檢測后結果見圖3，8份來自實驗室分別感染鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌或沙門氏菌鴨的肝和腦組織樣品，用多重PCR檢測全部為陽性。在24只鴨子(檢測肝和腦組織)，有2只鴨子同時檢測出鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌，有3只鴨子同時檢測出大腸桿菌和鏈球菌，有2只鴨子只檢測出鴨疫里氏桿菌，有4只鴨子檢測出大腸桿菌，有11只鴨子只檢測出鏈球菌，有2只鴨子只檢測出沙門氏菌。細菌分離和鑒定的結果 也證實了多重PCR結果的正確性。
【權利要求】
1.一種用于檢測4種鴨源致病菌的多重PCR檢測引物組，其特征在于，所述引物組包含4 對引物:RA rpoB-Pl 和 RA rpoB-P2 ;Ε.coli phoA-Pl 和 E.coli phoA_P2 ；Salm invA-Pl和 Salm invA-P2 ；Strep 16srRNA_Pl 和 Str印 16srRNA_P2 ;引物序列如 SEQ ID NO:1 ~8所示；所述4種鴨源致病菌為鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌和鏈球菌。
2.一種用于檢測4種鴨源致病菌的多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求1所述引物組，所述4種鴨源致病菌為鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌和鏈球菌。
3.根據(jù)權利要求2所述多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中各引物對的上游引物和下游引物的濃度分別為?ο μ Μ，所述試劑盒還含有10 XPCR反應緩沖液、DNA聚合酶和dNTP。
4.根據(jù)權利要求2所述多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的多重PCR反應體系為:10 X PCR 反應緩沖液 5 yL、DNA 聚合酶 0.3 μ L.dNTP 4 μ L、rpoB_Pl 0.5 μ L、rpoB-P2 0.5 μ L.phoA-Pl 0.5 μ L, phoA-P2 0.5 μ L、16SrRNA_Pl 0.5 μ L、16SrRNA_P20.5 μ L、invA-Pl 0.5 μ L、invA_P2 0.5 μ L, DNA 模板 I μ L，用無菌的超純水補齊到25 μ L0
5.根據(jù)權利要求2所述多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的多重PCR的反應條件為:951:預變性51^11，941: 35s, 56°C 35s，72°C 45s共運行35個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0
6.權利要求2至5任一項所述多重PCR檢測試劑盒在檢測鴨疫致病菌中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103937892SQ201410161746
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月21日 優(yōu)先權日:2014年4月21日
【發(fā)明者】曾振靈, 仇珍珍, 蔣紅霞, 瞿穎, 李亞菲, 曹長福 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學