的熒光探針的制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種檢測食源性水中S2-的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 含硫有機(jī)物分解或硫酸鹽類物質(zhì)還原而生成的硫化物，即含有S2-的物質(zhì)具有一定 的毒性，微摩爾濃度的含s 21 勿質(zhì)的存在已可對水生生物和人類造成傷害(Wang F et.al. Env. Toxi. Chem. 1999，18(11): 2526-2532.XS2-超標(biāo)的水或者食物可造成人體內(nèi)細(xì)胞 色素、氧化酶等物質(zhì)中二硫鍵的破壞，造成細(xì)胞組織嚴(yán)重缺氧，導(dǎo)致人體四肢麻痹甚至休 克?！兜乇硭h(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》要求食用水源中硫化物的含量不得高于0.05mg/L，因此，檢測食 用性水源中S 2_的含量越來越受到重視。
[0003] 目前，水中S2_的檢測方法發(fā)展迅速，已報(bào)道的有毛細(xì)管電泳法，光纖傳感器法，離 子色譜法，離子選擇性電極法，氣相色譜法，流動(dòng)注射分析法、電感耦合等離子體原子發(fā)射 光譜法等，被用于國家標(biāo)準(zhǔn)的有氣相分子吸收光譜法(HJ/T200-2005)、對氨基二甲基苯胺 比色法(GB/T 30376-2013)和碘量法(MT/T 371-2005)。這些分析方法中，要么需要用復(fù)雜 的儀器設(shè)備，要么分析過程步驟繁雜，且有的方法的靈敏度并不高，比如對氨基二甲基苯胺 比色法對水中硫離子的濃度檢測范圍為0.08~1.00 mg/L，碘量法測定水中硫離子的濃度 范圍為1.00 mg以上(參見MT/T 371-2005)。因此，發(fā)展簡單易行、檢測成本低、選擇性好、靈 敏度高的硫化物分析方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 近年來，熒光化學(xué)傳感器技術(shù)的發(fā)展帶動(dòng)了一批有機(jī)熒光物質(zhì)的出現(xiàn)，例如三氰 基二氧呋喃，2，7-二醋酸汞基熒光素，α，β_不飽和醛酮等有機(jī)類化合物用于檢測水溶液中 S2_的濃度。但是，此類化合物水溶液中溶解度低，需要用有機(jī)溶劑溶解，且此類化合物合成 步驟復(fù)雜，合成過程需要大量的有機(jī)試劑，造成環(huán)境污染。因此，研發(fā)環(huán)境友好型可用于食 用性水源檢測的熒光傳感器具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種檢測靈 敏度高，成本低，選擇性好，抗干擾，環(huán)境友好的檢測食源性水中S 2_的熒光探針。
[0006] 本發(fā)明進(jìn)一步要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種步 驟簡單、成本低的檢測食源性水中S2_的熒光探針的制備方法。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下:一種檢測食源性水中S2-的熒光探 針，由Cu2+與含有至少3個(gè)組氨酸和至少1個(gè)色氨酸的多肽絡(luò)合而成，且色氨酸的位置在組氨 酸之間。
[0008] 進(jìn)一步，所述含有至少3個(gè)組氨酸和至少1個(gè)色氨酸，且色氨酸的位置在組氨酸之 間的多肽氨基酸序列為:組氨酸-組氨酸-色氨酸-組氨酸、組氨酸-絲氨酸-色氨酸-甘氨酸_ 組氨酸-谷氨酰胺-組氨酸或絲氨酸-組氨酸-色氨酸-組氨酸-甘氨酸-組氨酸-谷氨酸等。
[0009]進(jìn)一步，所述Cu2+與組氨酸-組氨酸-色氨酸-組氨酸絡(luò)合所得熒光探針的分子結(jié)構(gòu) 式如下所示：
所述Cu2+與組氨酸-絲氨酸-色氨酸-甘氨酸-組氨酸-谷氨酰胺-組氨酸絡(luò)合所得熒光 探針的分子結(jié)構(gòu)式如下所示：
所述Cu2+與絲氨酸-組氨酸-色氨酸-組氨酸-甘氨酸-組氨酸-谷氨酸絡(luò)合所得熒光探 針的分子結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0010] 進(jìn)一步，所述多肽采用多肽固相合成法。
[0011] 本發(fā)明進(jìn)一步解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下:檢測食源性水中S2-的熒光 探針的制備方法，將多肽水溶液和CuSO^H 2S〇4溶液以多肽:Cu2+的摩爾比為1.0~1.2:1的 比例，與4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液混合，即成。
[0012] 進(jìn)一步，所述多肽水溶液的濃度為100~400ymol/L。多肽水溶液濃度若低于?οομ mol/L，不利于后面多肽、Cu 2+和4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液的混合，而多肽水溶液濃度若 高于400μπι〇 1 /L，由于多肽在水溶液中的溶解度不高，多肽在水中的有效濃度降低，造成多 肽-Cu2+絡(luò)合物濃度的不準(zhǔn)確，最終導(dǎo)致對S 21t測的不準(zhǔn)確。
[0013] 進(jìn)一步，所述CuS〇4的H2SO4溶液是指溶解于0.2~4.0 mmol/LH2S〇4溶液中，CuS〇4濃 度為0.2~4. Ommol/L的溶液。CuS0^H2S04溶液濃度不能過大，過大會(huì)影響最終測試溶液的 pH〇
[0014] 進(jìn)一步，所述4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液的濃度為10~50mmo 1 /L，pH值為7.0~ 7.8。4_羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液的濃度若低于10 mmol/L，不能發(fā)揮緩沖溶液的效果，即 CuS0d^H2S04溶液和多肽水溶液的加入會(huì)造成最終溶液pH值的改變，4-羥乙基哌嗪乙磺酸 緩沖溶液的濃度若高于50 mmol/L，則會(huì)影響多肽與Cu2+的絡(luò)合，影響本方法的靈敏度。而4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液pH值過高或過低都會(huì)影響多肽與Cu 2+的絡(luò)合，影響本方法對S2_ 的檢測。緩沖溶液的用量不需要嚴(yán)格限制。
[0015] 進(jìn)一步，所述混合的溫度為20~37°C，時(shí)間為1~2min?；旌系臏囟热舻陀?0°C，會(huì) 影響多肽的溶解度，若高于3 7 °C，則會(huì)影響多肽與Cu2+的絡(luò)合。多肽與Cu2+的絡(luò)合物可以迅 速絡(luò)合，混合時(shí)間并不需要太長。
[0016] 將本發(fā)明所述熒光探針用于檢測食源性水中S2'具體操作為:將所述熒光探針配 制成濃度為ΙΟμ mol/L的標(biāo)準(zhǔn)檢測溶液，向該標(biāo)準(zhǔn)檢測溶液中加入待測溶液，分別測定加入 待測溶液前標(biāo)準(zhǔn)檢測溶液的本征信號和加入待測溶液后標(biāo)準(zhǔn)檢測溶液的熒光光譜的輸出 信號，前后信號之差即為待測溶液中S 2_的含量。
[0017] 本發(fā)明的原理是:含有至少3個(gè)組氨酸和至少1個(gè)色氨酸，且色氨酸的位置在組氨 酸之間的多肽具有熒光，Cu2+與該多肽絡(luò)合后淬滅了該多肽的熒光，而S 2_可以和Cu2+與該多 肽的絡(luò)合產(chǎn)物多肽_Cu2+中的Cu 2+結(jié)合生成沉淀，釋放出多肽，增強(qiáng)溶液中自由多肽的含量， 從而使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。本發(fā)明以含有至少3個(gè)組氨酸和至少1個(gè)色氨酸，且色氨酸的位置在 組氨酸之間的多肽-Cu2+為熒光材料，用F-4600熒光分光光度計(jì)檢測其在不同S2!^度下的 多肽熒光光譜，根據(jù)所測數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得待測溶液在多肽_Cu2+絡(luò)合物溶液中的熒 光信號后，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出待測溶液中的S 2_濃度。
[0018]本發(fā)明的有益效果如下： (1) 本發(fā)明熒光探針檢測靈敏度高，檢出限為O.Olymol/L，檢測范圍為0.05~20μπι〇1/ L，檢測速度快，不受常見陰離子干擾，成本低，選擇性好； (2) 本發(fā)明熒光探針在檢測過程中，無需復(fù)雜且昂貴的儀器設(shè)備，分析過程簡單易行， 耗樣少，無需添加有機(jī)溶劑溶解，可用于食源性水中S 2_的檢測，環(huán)境友好； (3) 本發(fā)明制備方法步驟簡單、成本低。
【附圖說明】
[0019] 圖1是ΙΟμL?οΙ/L HHWH溶液，實(shí)施例1所得ΙΟμL?θΙ/L HHWH-Cu2+溶液以及在其中加入 不同濃度S2^后的熒光發(fā)射譜圖（圖中S2!^度由下至上依次為0.5，1.0,2.0,2.5,3.0,4.0， 5·0,6·0,7·0,8·0,9·0和9.5ymol/L); 圖2是不同濃度32_在實(shí)施例1所得ΙΟμ mol/L HHWH-Cu2+中355nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線（線性方 程為:y= 99.00X+85.68其中，y為熒光強(qiáng)度值，X為S2-的濃度，R2為0.999); 圖3是不同常見陰離子在實(shí)施例1所得ΙΟμ mol/L HHWH-Cu2+中355nm處的熒光強(qiáng)度（圖 中1為HHWH-Cu2+溶液中直接加入S2^的溶液，2~13依次為HHWH-Cu2+溶液中分別加入S〇4 2_， S032-，S2〇32-，S 2〇82-，HC03-，CH3⑶0-，N〇2-，Cl-，Br-，Γ，L-半胱氨酸或P〇4 3-后，再加入S2-的溶 液，其中，常見陰離子在混合溶液中的濃度為1 mmo 1/L，S2^在混合溶液中的濃度為5μπι〇 1/ L)〇
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0021 ]本發(fā)明實(shí)施例所使用的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液(HEPES緩沖液)購于Si gma-Aldrich;其它所使用的化學(xué)試劑，如無特殊說明，均通過常規(guī)商業(yè)途徑獲得。
[0022] 參考例1 多肽組氨酸-組氨酸-色氨酸-組氨酸(HHWH)的制備方法為：（1)將lg 2-氯三苯甲基氯 樹脂放入反應(yīng)管中，加入15 mL二氯甲烷(DCM)溶脹，振蕩30min; (2)通過沙芯抽濾掉DCM，先 加入6.5g保護(hù)組氨酸氨基酸(Fmoc-His(Trt)-OH)，再加入10 mL N，N二異丙基乙胺(DIEA)， 最后加入15 mL二甲基甲酰胺(DMH溶解，振蕩30min后，加入5mL甲醇，震蕩30min; (3)抽濾， 向固體中加20 mL 20%哌啶DMF溶液，反應(yīng)5min，過濾后，再加20 mL 20%哌啶DMF溶液，反應(yīng) 15min;(4)抽掉20%哌啶DMF溶液，用20 mL DMF沖洗2次，20 mL甲醇沖洗2次，20 mL DMF再?zèng)_ 洗2次；（5)將51^01^溶解的68保護(hù)色氨酸氨基酸斤111〇(3-1'印(8〇(3)-0!〇,51^01^溶解的7 8 0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU)加入反應(yīng)管，再立刻加入30mL DIEA，反應(yīng) 30min;(6)用20 mL DMF沖洗2次，20 mL甲醇沖洗2次，20 mL DMF再?zèng)_洗2次；（7)重復(fù)（3)~ (6)的操作，從右到左依次連接序列中的氨基酸；（8)用20 mL DMF沖洗兩次，20 mL甲醇沖洗 2次，20 mL DMF再?zèng)_洗2次，抽干10min;(9)加200 mL切割液(三氟乙酸（TFA) 95wt%，水 2￥七％，1，2-乙二硫醇化01')2￥丨％，三異丙基硅烷(1'13)1￥丨％)避光切割12〇!1^11 ;(10)抽濾得到 固體，將裂解液用氮?dú)獗M量吹干，用乙醚洗所得固體6次，然后常溫?fù)]發(fā)干燥，得待純化的多 肽；（11)用高效液相色譜(HPLC)通過C18柱純化多肽：以含0. lwt%TFA的乙氰和含0. lwt%TFA 的水作為流動(dòng)相，洗滌時(shí)間為40 min，流速為4.75 mL/min，產(chǎn)物的出峰時(shí)間為17.8 min; (12)最后將純化后的溶液凍干，即得到成品；（13)鑒定：分別取少量的成品多肽，做質(zhì)譜 (MS)的分子量鑒定；（14)密封避光包裝白色粉末狀的多肽，-20°C保存。
[0023] 參考例2 多肽組氨酸-絲氨酸-色氨酸-甘氨酸-組氨酸-谷氨酰胺-組氨酸(HSWGHQH)的制備方法 與參考例1的區(qū)別僅在于:在步驟(2)與步驟(5)加入氨基酸時(shí)，按照本參考例中的氨基酸序 列按照從右至左的順序加入相應(yīng)的Fmoc保護(hù)的氨基酸即可。余同參考例1。
[0024] 參考例3 多肽絲氨酸-組氨酸-色氨酸-組氨酸-甘氨酸-組氨酸-谷氨酸(DHWHGHE)的制備方法與 參考例1的區(qū)別僅在于:在步驟(2)與步驟(5)加入氨基酸時(shí)，按照本參考例中的氨基酸序列 按照從右至左的順序加入相應(yīng)的Fmoc保護(hù)的氨基酸即可。余同參考例1。
[0025] 實(shí)施例1 HHWH-Cu2+熒光探針的分子結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0026] 制備方法:將10yL參考例1所得HHWH配制的濃度為200 ymol/L的HHWH水溶液和2μ L溶解于1 mmol/L H2SO4溶液中CuS〇4濃度為1 mmol/L的溶液與188yL的HEPES緩沖液(濃 度10 mmol